METABOLISME LEMAK PADA PROSES PERKECAMBAHAN KACANG TANAH TANAH
LAPORAN PRAKTIKUM BIOREAKSI
diajukan sebagai salah satu syarat untuk menempuh mata kuliah bioreaksi
Oleh: Denni Indiarto
091810301004 091810301004
Syarifatullaily
091810301038
Jaka Hendari
091810301041 091810301041
Dosen Pembimbing: Ir. Neran M.Kes
LABORATORIUM BIOKIMIA
JURUSAN KIMIA FAKULTAS MATEMATIKA DAN ILMU PENGETAHUAN ALAM UNIVERSITAS JEMBER
2012
BAB 1. PENDAHULUAN 1.1 Latar Belakang
Tanaman kacang tanah ( Arachis hypogae L.) sebenarnya merupakan tanaman asli asal benua Amerika. Pada Pada awalnya, awalnya, diketahui diketahui bahwa tanaman tanaman ini tumbuh liar dan mulai dibudidayakan orang Indian di Amerika selatan sejak tahun 1500 SM. Kacang tanah masuk ke Indonesia melalui perantara pedagang-pedagang Spanyol yang berlayar dari Meksiko ke propinsi Maluku dan Sulawesi. Di Indonesia, tanaman ini mulai dibudidayakan pada awal abad ke 18. Lipid merupakan substansi kelompok senyawa yang mudah ditemui baik pada sel tumbuhan maupun hewan, hewan, termasuk termasuk kacang kacang tanah. Salah satu golongan golongan lipid yaitu lemak dari kacang tanah sendiri dapat diperoleh dengan mudah melalui proses industri, menghasilkan minyak minyak kacang tanah. tanah. Minyak kacang tanah termasuk dalam dalam minyak nabati (minyak yang berasal dari biji-bijian) yang terdiri dari asam lemak dan asam lemak bebas, yang merupakan campuran asam-asam karboksilat jenuh dan ti dak jenuh. Pada perkembangannya menjadi kecambah, kadar lemak seperti asam lemak bebas berkurang. Sebagian besar asam lemak pada biji kacang tanah akan berubah menjadi zat lain selama proses perkecambahan. Pada perkecambahan sendiri, asam lemak sebagai cadangan makanan akan diubah dan mengalami metabolisme untuk mendukung nutrisi demi terbentuknya kecambah. Kandungan lemak pada kacang tanah berubah selama proses perkecambahan, perkecambahan, begitu pula kandungan air, gula reduksi, dan proteinnya. Pada proses metabolisme perkecambahan kacang tanah, air memegang peranan penting pada tahap reaksi hidrolisis sebagai inisiator metabolisme tersebut. Masuknya air ke dalam biji kacang tanah juga akan merubah konsentrasi biomolekul yang ada di dalamnya menjadi lebih rendah. rendah. Hal ini diduga memicu proses proses perkecambahan perkecambahan tersebut. Lemak dalam dalam hal ini menjadi objek utama yang di analisis katabolismenya menjadi zat lain khususnya gula reduksi dan protein sebagai hasil anabolisme perkecambahan. perkecambahan. Pada proses perkecambahan akan terjadi perubahan kadar lemak, air, gula reduksi, dan protein yang dapat dibandingkan untuk memonitor metabolisme lemak selama proses perkecambahan kacang tanah. Selanjutnya dengan mengetahui metabolisme lipid dalam kacang dan kecambahnya diharapkan dapat menjadikannya kontribusi yang cukup penting bagi perkembangan teknologi bahan pangan kacang tanah itu sendiri. Hal inilah yang melatarbelakangi dilakukannya praktikum “Metabolisme Asam Lemak pada Proses Perkecambahan Kacang Tanah ”.
1.2 Rumusan Masalah
Berdasarkan latar belakang percobaan di atas maka dapat dirumuskan permasalahan sebagai berikut. a. Bagaimana perubahan kadar lemak, gula reduksi, dan protein pada biji kacang tanah oleh proses perkecambahan? perkecambahan? b. Bagaimana perbandingan kadar dan karakter lemak, gula reduksi, dan protein pada kacang tanah selama proses perkecambahan? c. Bagaimana metabolisme lemak pada kacang tanah selama proses perkecambahan? perkecambahan? 1.3 Tujuan Praktikum Adapun tujuan pelaksanaan praktikum praktikum ini antara lain. a. Mengetahui perubahan kadar lemak dibandingkan dengan kadar air, gula r eduksi, dan protein pada proses perkecambahan perkecambahan kacang tanah.. b. Menganalisa dan memprediksikan jalannya proses metabolisme lemak pada kacang tanah selama proses perkecambahan. 1.4 Manfaat Praktikum Berdasarkan tujuan praktikum ini diharapkan dapat diambil manfaat antara lain sebagai berikut.
a. Kadar dan perbandingan perbandingan lemak dengan kadar kadar air, gula reduksi, reduksi, dan protein pada metabolisme perkembangan kacang tanah sejak dari biji sampai menjadi kecambah dapat diketahui. b. Dapat memprediksi jalannya proses metabolisme lemak pada kacang tanah selama proses perkecambahan. 1.5 Batasan Masalah
Praktikan membatasi praktikum ini hanya pada penentuan kadar, serta prediksi dari proses metabolisme lemak serta kaitannya dengan air, gula reduksi, dan protein mulai dari biji, biji rendaman, biji bertunas dan kecambah dari kacang tanah saja tanpa mengidentifikasi jenis-jenis lemak penyusunnya penyusunnya secara secara langsung. langsung.
BAB 2. TINJAUAN PUSTAKA
2.1 Kacang Tanah
2.1.1 Kandungan kimia kacang tanah Polong kacang tanah yang sudah matang (cukup tua) mempunyai ukuran panjang 1,25 – 7,50 cm dan berbentuk silinder. Tiap-tiap polong kacang tanah terdiri dari kulit (shell) 21 -29 %, daging biji (kernel) 69 -72,40 %, dan lembaga (germ) 3,10 – 3,10 – 3,60 3,60 % (Wikipedia, 2009). Dari jumlah 9,1 persen kadar nitrogen kacang tanah sebesar 8,74 % diantaranya terdiri dari fraksi f raksi albumen, gluten dan globulin. Kacang tanah mengandung asam- asam amino esensial, yaitu arigin (2,72 %), fenilalani (1,52 %), histidin (0,51 %), isoleusim (0,99%), leusin (1,92 %), methionin (0,33%), tritophan (0,21 %), dan valin (1,33 %) (Wikipedia, (Wikipedia, 2009). Tabel 2.1.1 Komposisi Daging Biji Kacang Tanah Komposisi
Jumlah (%)
Kadar air Protein kasar Lemak Serat kasar Ekstrak Abu
4,6 – 6,0 25,0 – 30,0 46,0 – 52,0 2,8 – 3,0 10,0 – 13,0 2,5 – 3,0
(Bailey, 1950) 2.1.2 Minyak kacang tanah Minyak kacang tanah mengandung 76-82 % asam lemak tidak jenuh, yang terdiri dari 40-45 % asam oleat dan 30-35 % asam linoleat. Asam Asam lemak jenuh sebagian besar terdiri dari asam palmitat, sedangkan kadar asam miristat sekitar 5 %. Kandungan asam linoleat yang tinggi akan menurunkan kestabilan minyak. Kestabilan minyak akan bertambah dengan cara hidrogenasi atau dengan penambahan anti-oksidan. Dalam minyak kacang tanah terdapat persenyawaan tokoferol yang merupakan anti-oksidan alami dan efektif dalam menghambat proses oksidasi minyak kacang tanah (Ketaren, 1986). Tabel 1.2 Komposisi Asam Lemak Minyak Kacang Tanah Komposisi Asam lemak jenuh 1. Miristat 2. Palmitat
1921 USA (%) 17,1 6,3
1934 Afrika Barat (%) 17,7 8,2
1945 Argentina (%) 21,9 0,4 11,4
3. Stearat 4. Behenat Asam lemak tak jenuh 1. Oleat 2. Linoleat 3. Heksa dekanoat
4,9 5,9
3,4 6,1
2,8 7,3
61,1 21,8 -
60,4 21,5 -
42,3 33,3 2,4
Di dalam kacang tanah terdapat karbohidrat sebanyak 18 persen dengan kadar pati 0,5 – 5,0 persen dan kadar sukrosa 4 – 7 persen. Vitamin-vitamin yang terdapat adalah riboflavin, thiamin, asam nikotinat, vitamin E dan K. Sebagian besar kandungan mineral terdiri dari kalsium, k alsium, magnesium, fosfor dan sulfur (Ketaren, 1986). Racun di dalam dalam kacang tanah yang disebut disebut aflatoksin, dihasilkan dihasilkan oleh cendawan cendawan Aspergillus flavus. Aflatoksin ini terdiri dari B1, B2, G1, G2. Kode B dan G menunjukkan intensitas fluorecence fluorecence biru (blue) (blue) dan hijau (green) jika disinari dengan dengan sinar ultra violet. Kacang tanah berumur tua, yang digunakan sebagai bibit kadang-kadang mengandung aflatoksin (Ketaren, 1986). Minyak kacang tanah merupakan minyak yang lebih baik daripada minyak jagung, minyak biji kapas, minyak olive, minyak bunga matahari, untuk dijadikan salad dressing, dan o disimpan di bawah suhu -11 C. Hal ini disebabkan karena minyak kacang tanah jika berwujud padat berbentuk amorf, dimana lapisan padat tersebut tidak pecah sewaktu proses o pembekuan. Minyak kacang tanah yang didinginkan pada suhu -6,6 C, akan menghasilkan sejumlah besar trigliserida padat (Ketaren, 1986). o
Berdasarkan flow test, maka fase padat terbentuk dengan sempurna pada suhu -6,6 C. Sifat fisika-kimia minyak kacang tanah sebelum dan sesudah dimurnikan dapat dilihat pada tabel 1.4. Tabel 1.3 Sifat Fisika-Kimia Fisika- Kimia Minyak Kacang Tanah Tanah Sebelum dan Sesudah Dimurnikan Karakteristik Bilangan Iod Bilangan penyabunan Bilangan Polenske Bilangan ReichertMeissl Bilangan asetil o Titer ( C) Titik cair o Titik asap ( C) o Indeks bias nD 60 C Bobot jenis
(Ketaren, 1986).
Sebelum dimurnikan Tipe Virgina Tipe Spanis 94,80 90,10 187,80 188,20 0,29 0,12 0,21 0,27 9,5 0,9136
8,7 0,9148
Sesudah dimurnikan Bermacam-macam varietas 90,0 - 94,0 186,0 - 192,0 0,2 - 0,7 0,1 - 1,0 9,0 - 9,1 28 - 30 -5,5 - 2,2 226,6 1,4558 0,910 - 0,915
Tabel 1.4 Sifat Kimia Minyak Kacang Tanah
Karakteristik Derajat asam Bilangan penyabunan Bilangan Iod Bilangan thioainogen Bilangan hidroksil Bilangan ReichertMeissl Bilangan Polenske Zat tak tersabunkan o Indeks bias nD 40 C o Bobot jenis: 15/15 C Bobot jenis: 25/25 oC Titer,oC
Kisaran 0,08 – 6,0 188,0 – 195,0 84,0 – 102,0 67,0 – 73,0 2,5 – 9,5 0,2 – 1,0 0,2 – 0,7 0,2 – 0,8 1,4605 – 1,4645 0,91 – 0,915 26 – 32
Macam Standar British ACCS Standard 188,0 – 195,0 188 min 100,0 – 84 82 – 99 63 8,6 – 9,6 0,5 -
Species Spanis 1,5 -
N.C. Runner 1,5 -
0,5 1 0,917 – 0,921 0,910 – 0,915 26,32
0,64 1,4683 -
0,7 1,4681 -
0,8 max 0,17 – 0,92 -
(Ketaren, 1986). 2.1.4 Proses perkecambahan dan tahapannya a. Proses perkecambahan diawali dengan bakal biji yang membentuk zigot dan endosperma (cadangan makanan). b. Zigot akan berkembang menjadi sel basal dan sel terminal. t erminal. c. Sel basal akan berkembang menjadi suspensor ( menyalurkan nutrisi dari endosperm ke proembrio) dan sel terminal akan berkembang menjadi proembrio. d. Setelah mendapatkan nutrisi yang cukup, proembrio akan berkembang menjadi embrio. e. Bakal biji juga akan berkembang menjadi biji yang di dalamnya terdapat embrio, kotiledon (keping biji), hormon dan enzim pertumbuhan. f. Jika biji ditanam dalam suatu media (misalnya tanah) dan diberi air, akan terjadi proses imbibisi (masuknya molekul – molekul air ke dalam biji melalui testa/kulit biji). g. Proses imbibisi akan mengubah kondisi di dalam sel dan mengaktifkan enzim – enzim pertumbuhan. Enzim – Enzim – enzim enzim tersebut akan mengatalisis reaksi biokimiawi. h. Proses imbibisi juga mengaktifkan hormon giberelin yang mensekresikan hormon alfa amilase ( memecah enzim amilase menjadi glucosa ) dan protease ( memecah protein menjadi asam-asam amino ) disebut proses metabolisme yang akan menghasilkan ATP. i. ATP yang dihasilkan digunakan untuk proses diferensiasi sel, organogenesis, dan plantula (tumbuhan kecil yang tumbuh dari biji). j. Plantula akan mengalami diferensiasi menjadi radikula (calon akar), kotiledon (calon daun), dan kalikulus (calon batang). k. Plantula akan berkecambah berkembang menjadi individu baru berupa tumbuhan muda. Mulai membentuk organ-organ ( penyempurnaan organ ). l. Seiring dengan berjalannya waktu, terjadilah pertumbuhan primer dan pertumbuhan sekunder dan tumbuhan akan semakin tumbuh dan berkembang agar menjadi tumbuhan lengkap (Wikipedia, 2011).
2.2 Lipid
Lipid adalah senyawa organik berminyak atau berlemak yang tidak larut di dalam air, yang dapat diekstrak dari sel, dan jaringan oleh pelarut nonpolar, seperti kloroform, atau eter. Jenis lipid yang paling banyak adalah lemak atau triasilgliserol, yang merupakan bahan bakar utama bagi hamper semua organisme. Memang, golongan ini adalah bentuk energi kimia simpanan yang paling penting (Lehninger, 1993: 341). Lipid diklasifikasikan menjadi lipid sederhana atau kompleks. 1. Lipid sederhana sederhana : Ester asam asam lemak dengan dengan berbagai berbagai alkohol. a. Lemak (fat) : Ester asam lemak dengan gliserol. Minyak (oil) adalah lemak dalam keadaan cair. b. Wax (malam) : Ester asam lemak dengan alkohol monohidrat berberat molekul tinggi. 2. Lipid kompleks : Ester asam lemak yang mengandung gugus selain alkohol dan asam lemak. a. Fosfolipid Fosfoli pid : Lipid yang mengandung suatu residu asam fosfor, selain asam lemak dan alkohol. Lipid ini sering memiliki basa yang mengandung nitrogen nitrogen dan substituen lain, misalnya alkohol pada gliserofosfolipid adalah gliserol, dan alkohol pada sfingofosfolipid adalah sfingosin. b. Glikolipid (glikolsfingolipid): Lipid yang mengandung asam lemak, sfingosin, dan karbohidrat. c. Lipid kompleks lain : Lipid seperti sulfolipid dan aminolipid. Lipoprotein juga dapat dimasukkan dalam kelompok ini. 3. Prekursor dan lipid turunan: Kelompok ini mencakup asam lemak, gliserol, steroid, alkohol lain, dan badan keton, hidrokarbon, vitamin larut-lemak, dan hormon. Karena tidak bermuatan, asilgliserol (gliserida), kolesterol, dan ester kolesteril disebut lipid netral (Murray et al, 1995:128). Istilah lipid menunjuk ke zat-zat yang dapat diekstraksi dari materi hidup dengan menggunakan pelarut hidrokarbon seperti ligroin, benzene, etil, eter, atau kloroform. Protein, karbohidrat, dan asam nukleat pada dasarnya tidak larut dalam pelarut-pelarut non-polar. Kesimpulan ini bahwa lipid larut dalam lemak barangkali merupakan satu-satunya penyamarataan tentang lipid yang dapat ditarik, karena mereka menunjukkan keanekaragaman baik fungsional maupun struktural dalam batas-batas yang besar. Fungsi lipid termasuk: 1. Penyimpan energi dan transport; 2. Struktur membran; 3. Kulit pelindung, komponen dinding sel; 4. Penyampai kimia (David, 1997: 191). Senyawa ini terutama terdiri atas hidrokarbon dan mempunyai afinitas yang kecil dengan air. air. Beranekaragam molekul termasuk ke dalam kelompok lipid ini. Diantaranya yang paling sederhana ialah asam-asam lemak. Sebagian besar asam lemak adalah senyawa dengan rantai lurus yang mengandung atom C dalam jumLah genap. Asam lemak seluruhnya
dibentuk oleh hidrokarbon, kecuali gugus asam yang berkutub atau polar pada salah satu ujung (Shcumm, 1987: 20-22). Asam lemak pada umumnya terdapat sebagai ester dalam minyak dan lemak alami, tetapi bisa juga terdapat dalam bentuk tak-teresterifikasi sebagai asam lemak bebas, yakni suatu bentuk transpor yang terdapat dalam plasma. Asam lemak yang terdapat dalam lemak alami biasanya adalah turunan rantai lurus yang mengandung atom karbon berjumlah genap. Rantai tersebut dapat jenuh (tidak mengandung ikatan rangkap) atau tidak jenuh (mengandung satu atau lebih ikatan rangkap) (Murray et al, 1995:128). Kuantisasi dari lipid mungkin memerlukan suatu langkah awal yaitu ekstraksi. Langkah ini pasti akan menurunkan lipid maupun ekstrak dari beberapa komponen bukan lipid, seperti karbohidrat, asam amino, dan sebagainya. Kebutuhan individual akan menunjukan betapa perlunya beberapa prosedur ekstraksi dan pemurnian harus dilakukan, tetapi beberapa tidakan pencegahan pokok harus dilakukan untuk memperkecil kemungkinan terjadinya error (Holme dan Peck, 1998: 424). Triasilgliserol merupakan cadangan energi yang sangat besar karena karena dalam bentuk bentuk tereduksi dan bentuk anhidrat. Oksi dasi sempurna asam lemak menghasilkan energi sebesar 9 kkal/g dibandingkan karbohidrat dan protein yang menghasilkan energi sebesar 4 kkal/g. Ini disebabkan disebabkan karena asam lemak jauh lebih lebih tereduksi. tereduksi. Lagi pula triasilgliserol sangat sangat non polar sehingga tersimpan dalam keadaan keadaan anhidrat, sedangkan sedangkan protein dan karbohidrat karbohidrat jauh lebih polar, sehingga bersifat terhidratasi (Rusdiana, 2004:2). 2.3 Metabolisme Lemak
Tahap awal penggunaan penggunaan lemak sebagai sumber energi energi adalah hidrolisis triasilgliserol oleh lipase yang akan menghasilkan gliserol dan asam lemak. Peningkatan kadar AMP siklik merangsang protein kinase A, yang akan mengaktifkan lipase dengan cara fosforilasi. Gliserol yang terbentuk pada lipolisis mengalami fosforilasi dan dioksidasi menjadi dihidroksiaseton fosfat, yang selanjutnya mengalami isomerisasi menjadi gliseraldehida 3 – fosfat. fosfat. Zat antara ini terdapat baik pada jalur glikolisis dan glukoneogenesis. glukoneogenesis. Proses kebalikannya dapat terjadi melalui reduksi dihidroksiasetonfosfat dihidroksiasetonfosfat men jadi gliserol gliserol 3-fosfat. Hidrolisis oleh fosfatase akan menghasilkan menghasilkan gliserol. Jadi, gliserol gliserol dan zatzat- zat antara glikolisis glikolisis dapat dapat saling mudah mudah mengalami mengalami interkonversi interkonversi (Rusdiana, 2004:2).
BAB 3. METODE PERCOBAAN
3.1 Alat dan Bahan
3.1.1 Alat Adapun alat yang diperlukan dalam percobaan ini antara lain sebagai berikut.
1 set alat elektroforesis vertikal Ball pipet 1 buah Baskom 1 buah Batang pengaduk 2 buah Beaker glass 100 mL 4 buah Beaker glass 250 mL 1 buah Blender organik Botol kecil 25 mL 8 buah Botol semprot 1 buah Cawan porselen 2 buah (Besar: 56,75 gram. Kecil 54,87 gram) Corong gelas 1 buah Erlenmeyer 125 mL 2 buah Kain kasa 15 x 15 cm 2 helai Kamera digital Kuvet 2 buah Labu ukur 100 mL 1 buah Labu ukur 25 mL 1 buah Labu ukur 50 mL 1 buah Lemari es Media tanam kecambah (baskom atau gelas bekas secukupnya) Mortar 1 buah Neraca analitik 1 buah Penangas air Pipet mikro 200-800 µ l 1 buah Pipet mikro 1000 µ l atau suntikan kecil 1 buah Pipet mohr 10 mL 1 buah Pipet tetes 2 buah Pisau 1 buah Rak tabung reaksi 1 buah Spatula 1 buah Spektrometer UV-vis Tabung reaksi 5 buah Tabung sentrifuge 4 buah Wadah botol 10 buah atau lebih
3.1.2 Bahan Adapun bahan yang dibutuhkan dalam percobaan percobaan ini antara lain sebagai berikut.
Akuades Etanol secukupnya Amonium sulfat secukupnya secukupnya Arsenomolibdat Biji Kacang tanah basah secukupnya Biji Kacang tanah secukupnya secukupnya Es batu H2SO4 Indikator pp 1 %. Isopropanol secukupnya Kacang tanah bertunas (berkuncup) Kecambah kacang tanah secukupnya Kertas saring K-oksalat Larutan formaldehid 40 %. NaCl NaOH 0,1 N Pb asetat atau bubur alumunium hidroksida petrolium eter secukupnya secukupnya Reagen Nelson
±10 gram (±100 gram)
±10 gram ±10 gram ± 3 buah
(± 20 mL)
3.2 Prosedur Kerja
3.2.1 Preparasi sampel dan bahan a. Pembuatan sampel kacang basah 1) 5 gram biji kacang tanah dicuci bersih. 2) Direndam dalam baskom selama 12 jam. 3) Digunakan sebagai sampel kedua dalam analisis. b. Pembuatan sampel kacang tanah bertunas 1) 5 gram biji kacang tanah dicuci bersih. 2) Disiapkan media tanam seperti baskom atau gelas bekas air mineral yang didalamnya diisi media kapas. 3) Media tanam diberi air bersih secukupnya. 4) Tempatkan biji kacang tanah secukupnya di atas media tanam. 5) Dibiarkan dalam tempat lembab (±24 jam) sampai timbul t imbul tunas. c. Pembuatan kecambah kacang tanah 1) 5 gram biji kacang tanah dicuci bersih. 2) Disiapkan media tanam seperti baskom atau gelas bekas air mineral yang didalamnya diisi media kapas.
3) 4) 5) 6)
Media tanam diberi air bersih secukupnya. Tempatkan biji kacang tanah secukupnya di atas media tanam. Dibiarkan dalam tempat lembab l embab sampai menjadi kecambah. Kecambah dibiarkan tumbuh sesuai waktu yang ditentukan (1, 2, 3, dan seterusnya sampai berumur satu minggu).
d. Preparasi sampel 1) 10 g biji kacang tanah yang sudah dicuci bersih, dihaluskan dengan mortar ditambah serbuk kaca, atau dengan blender. 2) Dilakukan perlakuan yang sama pada sampel lainnya. l ainnya. e. Ekstraksi sampel 1) 5 g sampel halus dilarutkan dalam 25 ml alir lalu disaring dengan kain kasa. 2) Filtrat disentifuge dengan kecepatan 1000 rpm selama 15 menit. 3) Dipisahkan supernatannya untuk digunakan pada prosedur selanjurnya. f. Preparasi sistem pelarut dan reagen 1) Heksana- isopropanol (3:2) atau petroleum eter 2) Reagen nelson 3) indikator pp 1 %. 4) NaCl 10% 5) NaOH 0,1 N 6) K-oksalat jenuh 7) Larutan formaldehid 40 %.
3.2.2 Analisis lipid pada kacang tanah a. Siapkan erlenmeyer 125 mL, timbang dan catat beratnya. b. Tempatkan 5 gram sampel kacang tanah dan kecambah yang sudah dihaluskan masing-masing ke dalam erlenmeyer 125 mL. c. Tambahkan 50 mL heksana-isopropanol heksana-isopropanol (3:2) atau petroleum eter, tutupi dengan kertas alumunium foil. d. Panaskan di atas penangas air atau hot plate selama ±15 menit. e. Aduk-aduk dan goyang larutan supaya tercampur selama pemanasan. pemanasan. f. Siapkan corong beserta kertas saringnya. g. Saring larutan dengan cepat, lalu tambahkan 20 mL heksana-isopropanol atau petroleum eter panas untuk mencuci residu yang ada pada filter. h. Hilangkan pelarut dengan menguapkannya dengan penangas penangas air untuk menguapkannya menguapkannya di lemari asam atau dekat ventilasi udara (gunakan masker). i. Suhu selalu dijaga pada titik didih pelarut. j. Crude lipid yang dihasilkan ditimbang (diperkirakan 1-2 gram). k. Simpan crude lipid didalam desikator bila perlu. 3.3 Pengukuran kadar air sampel a. 2 gram sampel dibersihkan lalu dihaluskan. b. Bersihkan cawan porselen, keringkan dengan oven, dinginkan dalam eksikator, dan timbang beratnya.
– 2 gram dalam cawan porselen. c. Timbang sampel yang sudah dihaluskan sebanyak 1 – 2 d. Masukkan cawan porselen yang berisi sampel ke dalam oven bersuhu 100 – 105°C – 105°C selama 1 - 2 jam tergantung sampelnya. e. Setelah 1-2 jam, dinginkan sampel tadi dalam deksikator, kemudian timbang. f. Masukkan lagi sampel dan cawannya tersebut dalam oven selama 30 menit, dinginkan dalam deksikator dan timbang. g. Perlakuan ini diulangi sampai tercapai berat konstan (selisih penimbangan penimbangan berturut-turut kurang dari 0,2 mg). h. Pengurangan Pengurangan berat merupakan banyaknya banyaknya air dalam bahan.
3.4 Penentuan kadar gula reduksi 3.4.1 Pembuatan kurva standar a. b. c. d. e. f. g. h. i. j.
k. l. m.
Siapkan larutan glukosa standar ( 1 mg glukosa anhidrat/ml). Encerkan larutan standar dalam labu ukur 100 ml sehingga diperoleh larutan standar dengan dengan kadar glukosa 2, 4, 6, 8 dan 10 mg/100 ml. Siapkan 6 tabung reaksi yang bersih, masing-masing diisi dengan 2 ml larut standar tersebut. Siapkan satu tabung reaksi yang diisi dengan 2 ml aquades sebagai sebagai blangko. Masukkan tabung-tabung tabung-tabung reaksi tersebut dalam waterbath pada suhu 30 °C selama 5 menit. Setelah 5 menit, tambahkan 1 ml larutan ‘glucose test’ (reagen Nelson dan sebagainya) sebagainya) pada masing-masing tabung reaksi. Inkubasikan tabung reaksi tersebut dalam waterbath suhu 30 °C selama 30 menit. Setelah 30 menit, reaksi dihentikan dengan penambahan 10 ml larutan H 2SO4 (1 + 3). Selang waktu penambahan larutan asam sulfat pada satu tabung dengan tabung berikutnya dibuat ajeg, sehingga lamanya inkubasi pada setiap tabung adalah sama selama 30 menit. Gojog tabung reaksi sampai homogen dan dinginkan sampai suhu kamar. Teralah absorbansi setiap larutan dengan menggunakan spektrofotometer pada panjang gelombang 540 nm (atau pada panjang gelombang hasil scanning). Buatlah kurva standar dengan persamaan regresi linier l inier yang menunjukkan hubungan antara konsentrasi glukosa dan absorbansi.
3.4.2 Penentuan kadar glukosa dalam sampel a. Siapkan larutan sampel yang dihasilkan dari ekstrak supernatan pemisahan larutan kacang. b. Larutan sampel harus jernih, bila keruh atau berwarna dapat dijernihkan dengan Pb asetat atau bubur aluminum hidroksida. c. Pipetlah 2 ml larut sampel yang jernih tersebut ke dalam tabung reaksi. d. Masukkan tabung reaksi tersebut dalam waterbath pada suhu 30°C selama 5 menit dan selanjutnya diperlakukan sama seperti pada pembuatan kurva standar di atas. e. Kadar glukosa dapat ditentukan berdasarkan absorbansi larutan sampel dan persamaan regresi linier dari kurva standar st andar larutan glukosa.
3.5 Penentuan kadar protein terlarut 3.5.1 Isolasi dan ekstraksi protein a. 5 mL supernatan ekstrak hasil sentrifugasi ditambahkan amonium sulfat sebanyak 25% lalu diaduk. o b. Didiamkan pada suhu 0-4 C. c. Disentrifugasi 8000 rpm selama 30 menit. d. Dipisahkan supernatan dan peletnya dengan teknik dekantasi. e. Pelet dicuci dengan sedikit NaCl 10% (± 2 mL). f. Dimasukkan pelet dalam labu ukurr 5 mL. m L. g. Supernatan sisa ditambahkan ditambahkan dengan dengan amonium sulfat sebanyak sebanyak 25% lalu diaduk o h. Didiamkan pada suhu 0-4 C. i. Disentrifugasi 8500 rpm selama 30 menit. j. Dipisahkan supernatan dan peletnya dengan teknik dekantasi. k. Pelet dicuci dengan NaCl 10% (± 2 mL), ditambahkan ke dalam labu ukur 5 mL sebelumnya. l. Diencerkan sampai sampai 5 mL, dimasukkan pelet dalam botol pelet protein . m. Disimpan pelet dalam lemari pendingin. 3.5.2 Analisis kadar protein dengan metode titrasi formol a. b. c. d. e. f. g. h. i. j. k.
Ambil 10 ml larutan sampel (larutan protein) dan masukkan ke dalam erlenmeyer. Tambahkan 20 ml aquades, aquades, 0,4 ml larutan K-oksalat jenuh dan 1 ml indikator pp 1 %. Gojog, lalu diamkan 2 menit. Titrasilah larutan sampel tersebut dengan larutan NaOH 0,1 N sampai berwarna merah jambu (pink). Catat banyaknya larutan NaOH 0,1 N yang digunakan untuk titrasi (titrasi pertama). Setelah warna tercapai, tambahkan 2 ml larutan formaldehid f ormaldehid 40 % dan titrasilah titr asilah kembali dengan larutan NaOH 0,1 N sampai berwarna merah jambu (pink) lagi. Catat banyaknya larutan NaOH 0,1 N yang digunakan untuk titrasi ( titrasi kedua). Buatlah titrasi blanko yang terdiri dari 20 ml aquades + 0,4 ml larutan K-oksalat jenuh + 1 ml indikator indikator pp 1 % + 2 ml larutan formaldehid 40 40 %. Titrasilah dengan larutan NaOH 0,1 N sampai berwarna merah jambu (pink). Larutan terkoreksi adalah titrasi kedua dikurangi titrasi blanko merupakan titrasi formol. Untuk mengetahui % protein, harus dibuat percobaan serupa dengan menggunakan larutan yang telah diketahui kadar proteinnya (dengan metode Kjieldahl).
3.6 Diagram Alir Sampel 1: Biji kacang tanah Inkubasi
Sampel 2: Kacang tanah basah (rendaman)
Dihaluskan/diblender
1.Uji kadar air Dehidrasi
Inkubasi
Sampel 3: Kacang tanah bertunas Inkubasi
Sampel 4: Kecambah kacang tanah
Filtrasi
Residu Sampel halus Filtra Filtrat/Ek t/Ekstr strak ak sam el Isolasi lemak
2. Kadar crude lipid
Analisis
4. Kadar glukosa 3. Pembuatan kurva standar glukosa
+ Amonium sulfat
5. Pelet protein Titrasi formol
6. Kadar protein
7. Pembandingan dan analisa metabolisme asam lemak l emak
BAB 4. HASIL DAN PEMBAHASAN
4.1 Hasil Percobaan 4.1.1 Uji Kadar Air
Berat awal (gram) 5,00
Berat akhir (gram) 4,00
Kadar air (gram) 1,00
Kadar air, %
Biji rendaman
5,00
1,49
3,51
70,2
Tunas
5,00
3,99
1,01
20,2
Kecambah
5,00
2,95
2,05
41
Sampel Biji
20,00
4.1.2 Uji Kadar Lemak
Sampel
Berat awal (gram)
Berat crude lipid (gram)
Kadar crude lipid (persen, %)
Biji
5
1,79
35,8
Biji rendaman
5
1,08
21,6
Tunas
5
1,01
20,2
Kecambah
5
0,93
18,6
4.1.3 Uji Kadar Glukosa -3
No.
Konsentrasi Glukosa Standar (mg/mL)
Absorbansi (10 )
1.
0,00 (blank)
19
2.
0,02
52 – 52 – 19 19 = 33
3.
0,04
99 – 99 – 19 19 = 80
4.
0,06
161 – 161 – 19 19 = 142
5.
0,08
214 – 19 214 – 19 = 195
6.
0,10
222 – 222 – 19 19 = 203
Kurva kalibrasi kadar glukosa 250 200
y = 24.95x - 9.8 R² = 0.989
150
Series1
Absorbansi 100
Linear (Series1)
50 0 0 -50
5
10
Konsentrasi (10-2 mg/mL)
-3
-2
Sampel (ekstrak)
Absorbansi (10 )
Konsentrasi(10 mg/mL)
Kadar (%)
Biji
25 – 25 – 19 19 = 6
0,633
0,03165
Biji rendaman
45 – 45 – 19 19 = 26
1,435
0,07175
Tunas
35 – 35 – 19 19 = 16
1,034
0,05170
Kecambah
76 – 76 – 19 19 = 57
2,677
0,13385
glukosa
4.1.2 Uji Formol Kadar Protein
Sampel
Volume Titran Volume Titran Kadar protein NaOH ke-1 (mL) NaOH ke-2 (mL)
Blanko
-
0,1
Biji
0,10
0,2 – 0,2 – 0,1 0,1 = 0,1
Biji rendaman
0,11
0,2 – 0,2 – 0,1 0,1 = 0,1
Tunas
0,10
0,2 – 0,2 – 0,1 0,1 = 0,1
Kecambah
0,10
0,2 – 0,2 – 0,1 0,1 = 0,1
4.2 Pembahasan
Pada percobaan ini, diuji perubahan kadar biomolekul seperti kadar lemak kasar (crude lipid ), ), protein terlarut (dalam air), dan kadar gula reduksi (glukosa) selama proses perkecambahan kacang tanah. Adapun perubahan kadar biomolekul-biomolekul tersebut berhubungan dengan kadar air yang memiliki peran penting dalam metabolisme proses perkecambahan. Seperti diketahui bahwa agar terjadi perkecambahan diperlukan proses perendaman dari biji kacang tanah. Untuk memonitor perubahan kadar biomolekul selama proses perkecambahan, digunakan empat sampel antara lain biji kacang (kering) tanah, biji rendaman (basah), biji bertunas, dan kecambah. Masuknya air ke dalam biji dapat membuat konsentrasi biomolekul di dalam biji tersebut menurun, serta mengaktifkan enzim-enzim yang berperan dalam proses perkecambahan. Banyak reaksi dalam metabolisme perkecambahan juga membutuhkan air untuk sebagai reaktannya, misalnya pada reaksi hidrolisis trigliserida, hidrolisis amilum dan sebagainya. Pada percobaan penentuan kadar air selama proses perkecambahan kacang tanah, diperoleh kenaikan secara signifikan dari biji setelah perendaman. Namun, kadar air menurun kembali saat bertunas bertunas dan kemudian kemudian naik kembali setelah setelah menjadi kecambah. kecambah. Perubahan kadar air selama proses perkecambahan kacang tanah dapat dilihat dengan jelas melalui grafik berikut.
Perubahan Kadar Air 80 Biji rendaman, 70.2
70
Series1
60
) %50 ( r i A40 r a d30 a K
Kecambah, 41
20
Biji, 20
Tunas, 20.2
10 0 0
1
2
3
Sampel Kacang Tanah
4
5
Ket. Sampel : 1. Biji 2. Biji Redaman 3. Tunas 4. Kecambah
Uji perubahan perubahan kadar kadar
lemak kasar kasar selama proses perkecambaha perkecambahan n kacang tanah
dilakukan dengan ekstraksi pelarut menggunakan metode sokhlet. Lemak diekstrak dengan petroleum eter untuk dipisahkan dari zat-zat lainnya. Pelarut petroleum eter dihilangkan dengan penguapan, sehingga hanya lemak yang tersisa yang lalu ditimbang. Lemak yang didapat hasil berupa lemak kasar ( crude lipid ) yang kurang murni. Lemak kasar pada kacang tanah yang diperoleh dari hasil ekstraksi cukup banyak yaitu 35,8%. Setelah direndam semalam, kadar lipid berkurang cukup banyak menjadi 21,6% . Hal ini dikarenakan lemak trigliserida pada biji kacang tanah mengalami hidrolisis (oleh adanya air) pada saat perendaman. Air berfungsi sebagai reagen sekaligus pengaktih enzim hidrolase. Reaksi yang terjadi adalah :
Kadar lipid dari biji rendaman menjadi biji tunas berkurang sedikit, yaitu menjadi 1,01. Hal ini dikarenakan kadar airnya sedikit. Sedangkan dari tunas menjadi kecambah diperoleh kadar lipid juga sama yaitu hanya berkurang 0,7 gram. Sehingga, selisihnya tidak terlalu besar. Pada proses perkecambahan protein, pati dan lipid dirombak oleh enzim-enzim dan sebagian langsung dipakai sebagai bahan penyusun pertumbuhan didaerah titik-titik tumbuh sebagian lagi digunakan sebagai bahan bakar respirasai. Lemak dirombak oleh enzim lipase menjadi asam lemak dan gliserol untuk energi metabolisme. Enzim lipase mengatur kecepatan hidrolisis dan esterifikasi dalam perkecambaha p erkecambahan n biji. Katabolisme lemak dikonversi menjadi biomolekul lain yaitu gula reduksi dan protein. Proses awal asam lemak mengalami esterifikasi yaitu membentuk ester dengan gliserol menjadi trigliserida sebagai cadangan energi jangka panjang. Jika sewaktu-waktu tak tersedia sumber energi dari karbohidrat barulah asam lemak dioksidasi. Proses oksidasi asam lemak dinamakan oksidasi beta dan menghasilkan asetil KoA. Selanjutnya sebagaimana asetil KoA dari hasil metabolisme karbohidrat dan protein, asetil KoA dari jalur inipun akan masuk ke dalam siklus asam sitrat sehingga dihasilkan energi. Lemak dalam biji akan dipecah oleh enzim lipase menjadi asam lemak bebas dan gliserol. Sebelum dikatabolisir dalam oksidasi beta, asam lemak harus diaktifkan terlebih dahulu menjadi asil-KoA. Dengan adanya ATP dan Koenzim A, asam lemak diaktifkan dengan dikatalisir oleh enzim asil-KoA sintetase (Tiokinase)..
Pada proses oksidasi beta, asam lemak masuk ke dalam rangkaian siklus dengan 5 tahapan proses dan pada setiap proses, diangkat 2 atom C dengan hasil akhir berupa asetil KoA. Selanjutnya asetil KoA masuk ke dalam siklus asam sitrat. Kadar lemak menurun karena terjad hidrolisis sehingga mengandung lebih banyak air. Hasil dari katabolisme katabolisme lemak itu sendiri sendiri berikutnya digunakan untuk penentuan kadar kadar gula reduksi yang dilakukan dengan cara spektrofotometer, hasil yang diperoleh dari setiap peningkatan konsentrasi gula standar standar
nilai absorbansi absorbansi juga meningkat sehingga sehingga kadar kadar
glukosapun relative meningkat yaitu pada biji konsentrasi konsentrasi 0,633 memiliki kadar kadar glukosa 0,03165 %, pada biji rendaman konsentrasi 1,435 memiliki kadar glukosa 0,07175 %, pada tunas konsentrasi 1,034 memiliki kadar glukosa 0,05170%, dan pada kecambah dengan konsentrasi 2,677 memiliki kadar glukosa 0,13385. Peningkatan yang terjadi disebabkan oleh sintesis glukosa itu sendiri. ATP dan precursor untuk sintesis diperoleh dari hasil hidrolisis lemak. Penentuan protein dengan titrasi formol larutan protein dinetralkan dengan basa (NaOH), kemudian ditambahkan formalin akan membentuk dimethilol. Dengan terbentuknya antara asam (gugus karboksil) dengan basa NaOH, sehingga akhir titrasi dapat diakhiri dengan tepat. Indikator yang digunakan adalah PP, akhir titrasi bila tepat terjadi perubahan warna menjadi merah muda yang tidak hilang dalam 30 detik. Titrasi formol ini hanya tepat untuk menentukan suatu proses terjadinya pemecahan protein dan kurang tepat untuk penentuan protein. Hasil yang diperoleh dari uji formol f ormol kadar protein relative tetap. Perbandingan kadar dan karakter lemak, gula reduksi, dan protein pada kacang tanah selama proses perkecambahan perkecambahan sangat jelas terlihat dari hasil yang diperoleh BAB 5. KESIMPULAN DAN SARAN
5.1 Kesimpulan
Adapun kesimpulan yang dapat diambil dari percobaan ini adalah sebagai berikut.
5.2 Saran
Praktikan menyadari dengan segala keterbatasan waktu, pengetahuan, sarana, maupun dana yang ada praktikum masih jauh dari yang diharapkan. Oleh karena itu demi kelancaran dan kesempurnaan kesempurnaan praktikum selanjutnya hendaklah segala sesuatunya seperti metode percobaan,
kelengkapan alat, dan bahan harap diperhatikan. Pada praktikum selanjutnya hendaklah disediakan bahan bahan dan alat yang baik demi kesempurnaan kesempurnaan hasil percobaan.
DAFTAR PUSTAKA
Adnan, Mochamad. 1997. Teknik Kromatografi untuk Analisa Bahan Makanan. Yogyakarta: Penerbit ANDI Biochemist ry. Edisi kedua. California: The Boyer, Rodney F. 1993. Modern Experimental Biochemistry Benjamin/Cummings Publishing Company. Inc.
Holme, David J dan Peck, Hazel. 1998. Analytical Biochemistry. Edisi ketiga. Singapura: Longman Singapore Publisher (Pte) Ltd. MIG Corp. Tanpa tahun. Kacang Tanah ( Arachis hypogeae L.). Kantor Deputi Menegristek Bidang Pendayagunaan Pendayagunaan dan Pemasyarakatan Pemasyarakatan Ilmu Pengetahuan dan Teknologi. Serial on line [www.googlesearch.com] [www.googlesearch.com] Murray, Robert K. dkk. 1995. Biokimia Harper . Edisi ke-22. Jakarta: Penerbit Buku Kedokteran EGC Jili d 1. Jakarta:Erlangg Lehninger,A. 1982. Dasar-dasar Biokimia, Jilid J akarta:Erlanggaa
Schumm, Dorothy E. 1987. Intisari Biokimia. Jakarta: Binarupa Aksara Wirahadikusumah, Muhamad. 1989. Biokimia: Protein, Enzim, dan Asam Nukleat . Bandung: Penerbit ITB
