METODE FITOKIMIA
1
REFERENSI
List PH and Schmidt PC, 1989, Phytopharmaceutical Technology , CRC Press, Boston Departemen Kesehatan Republik Indonesia, 2000, Parameter Standar Umum Ekstrak Tumbuhan Obat , Departemen Kesehatan Republik Indonesia Harbone,J.B., 1984, Metode Fitokimia: Penuntun cara modern menganalisis tumbuhan, Penerbit ITB, Bandung 2
ALUR PENCARIAN B. AKTIF DARI TUMBUHAN Tumbuhan
….?? ?
Simplisia (Skrining fitokimia, Ekstraksi)
Ekstrak
(Uji biaktivitas, Separasi)
Fraksi
(Uji biaktivitas, Pemurnian)
Isolat
(Uji biaktivitas, Identifikasi)
3
EKSTRAKSI Pengambilan bahan aktif dari tumbuhan dengan pelarut tertentu Macam-Macam Ekstrak – EKSTRAK TOTAL – EKSTRAK PARSIAL
4
FAKTOR2 YANG BERPENGARUH
• Bahan Awal • Pelarut (Menstruum) • Cara/Metode
5
Bahan Awal SEGAR
KERING BUAH/FRUCTUS DAUN/FOLIUM BIJI/SEMEN HERBA BATANG/CAULIS RIMPANG/RHIZOMA KULIT KAYU/KORTEKS KAYU/LIGNUM
6
PELARUT Selektifitas Mudah penanganannya Ekonomis Ramah Lingkungan
7
JENIS-JENIS PELARUT
Ais Hidrokarbon alifatis (PE,heksan) Kloro hidrokarbon (Diklormetan, Triklormetan) Alkohol (Etanol, metanol, isopropanol) Asam karboksilat Ester Ether Minyak 8
METODE EKSTRAKSI
3 Metode Ekstraksi
Proses yang menghasilkan keseimbangan konsentrasi antara larutan dan residu padat Contoh : Maserasi, digesti, ultrasonic extraction, dll Proses Ekstraksi seksama/menyeluruh Contoh : Perkolasi, Countercurrent extraction. Ekstraksi dengan Gas superkritis PHYTOPHARMACEUTICAL TECHNOLOGY
9
METODE EKSTRAKSI • Ekstraksi dengan menggunakan Pelarut • Dingin maserasi, perkolasi • Panas Infus, dekokta, Refluks, Soxhlet • Destilasi • Lainnya • Ekstraksi berkesinambungan • Ekstraksi dengan gas superkritis • Ekstraksi dengan ultrasonik • Ekstraksi dengan tenaga listrik PARAMETER STANDAR UMUM EKSTRAK TUMBUHAN OBAT 10
Proses yang menghasilkan keseimbangan konsentrasi antara larutan dan residu padat p adat
Maseration, Kinetic maceration,
Digestion Vortical (Turbo) Extraction Ultrasound extraction Extraction by Electrical Energy 11
MACERATION Penyarian dengan menggunakan pelarut beberapa hari (5 hari) dengan pengadukan (tidak kontinu) Sesuai untuk bahan aktif yang mudah larut dalam cairan penyari Simplisia yang mengandung musilago dan bahan lain yan mudah mengambang. (+) Cara pengerjaan dan peralatan sangat sederhana dan mudah (-) Pengerjaan lama dan penyarian kurang sempurna Kinetic Maceration: Maserasi dengan pengadukan konstan dan kontinu Digesti : Maserasi dengan pemanasan (40-50 C)
12
VORTICAL (TURBO) EXTRACTION Bahan dan pelarut diaduk dengan kecepatan tinggi (high speed mixer/homogenizer) Bahan semakin halus karena ada pengecilan ukuran partikel selama proses, sehingga meningkatkan luas permukaan bahan dengan cairan penyari Penyarian lebih baik dan waktu lebih singkat dari maserasi Cukup beresiko untuk bahan yang termolabil Pemisahan antara cairan penyari dengan residu jauh lebih sulit Tidak efektif untuk large scale.
13
ULTRASOUND EXTRACTION
Penyarian dengan menggunakan gelombang suara (ultrasonik, Frek > 20 hz) Prinsip
Meningkatkan permeabilitas dinding sel Membentuk cavity ( lubang-lubang) Meningkatkan tekanan mekanik
Dapat menyebabkan rusaknya bahan aktif akibat oksidasi Ekstrak dapat tercemar oleh trace metal High Energy Cost untuk penggunaan large scale 14
Extraction by Electrical Energy
Penyarian dengan mengunakan tenaga listrik Prinsip Membuat cavity Menyebarkan tekanan gelombang yang dihasilkan oleh listrik dengn kecepatan Ultrasonic
15
Proses Ekstraksi Seksama/Menyeluruh
Exhaustive extraction: The complete removal of the desired extractive substance from material. Percolation : -
Plant material is exhaustively extracted by fresh solvent Only fresh solvent is used, Consumed a large quantity of solvent Takes a long time Inflkuenced by : Selectivity of solvent, solvent, Quantity Flow (Dropping rate) of the solvent, Temperatur
Repercolation - First extracted with fresh solvent and then some of percolate is used for exhaustive extraction by stagewise concentration in another percolator.
Continuous Countercurrent Extraction - Fresh plant material is brought into contact with loaded/charged solvent at the same time as fresh solvent is being brought into contact with already pre-extracted 16
PENGUAPAN/PEMEKATAN EKSTRAK Rotary evaporator (pelarut organik, Air sulit) Ekstrak kental
Kondensor Motor pemutar labu
Labu penampung solven Labu destilasi
Water bath 17
PRINSIP KERJA ROTAVAPOR
Penurunan titik didik solven akibat hisapan pompa vakum, suhu danadanya pemutaran labu yang meningkatkan permukaan penguapan e.x : Etanol terdestilasi suhu 30 C dengan cepat
18
SEPARATION
Why separate compounds? – to isolate or concentrate component(s) from a mixture – to separate a component(s) from other species that would interfere in the analysis
19
Methods of Separation
Extraction – washing clothes
Crystallization – drugs
Destillation – moonshine
Chromatography 20
Solvent Extraction
Extraction: transfer of a solute from one phase to another.
Can use most any combination of phases (solid, liquid, gas, supercritical fluid)
Solvent extractions use two immiscible liquids. – Typically aqueous/organic solvent 21
Solvent Extraction
Organic solvents less dense than water – diethyl ether, toluene, hexane
Organic solvents more dense than water – chloroform, CCl 4, dichloromethane
Like dissolves like so ideally, the extracting solvent should be similar to the solute (analyte) 22
Solvent Extraction
Separatory funnel
add second immiscible solvent
shake
23
KROMATOGRAFI
Teknik pemisahan fisik campuran komponen berdasarkan perbedaan migrasi komponen-kompon komponen-komponen en tersebut dari fase diam oleh pengaruh fase gerak
24
Klasifikasi Metode Kromatografi C H R O M A TO G R A P H Y
G AS
G SC
SFC
G LC
NP
L IQ U ID
C o lu m n
RP
P la n a r
IE C
SEC
G PC
TLC
P a p e r
G FC 25
Kromatografi Kromato grafi yang sering digunakan
Kromatografi Kertas
Kromatografi Lapis Tipis
KCKT
KGC
26
Pemilihan metode kromatografi didasarkan: – Sifat Kelarutan – Sifat keatsirian
Kromatografi Kertas: – Mudah larut dlm air (Karbohidrat, asam amino, senyawa fenolat, asam organik, basa asam nukleat
KLT: – Mudah larut lm lipid (Lipid, steroid, karotenoid, klorofil)
KGC – Mudah teratsirikan (Minyak atsiri, monoterpena, sesquiterpena, asam lemak)
KCKT – Sulit teratsirikan
27
Kromatografi Kertas
Eluasi desending satu arah atau kadang 2 arah
Kertas whatman 46 x 57 cm
Fase diam selulosa, alumina, silikat
Deteksi bercak berwarna atau berflouresensi UV setelah direaksikan
Fase gerak : Butanol: Asam asetat:Air 28
Prinsip : Partisi dua fase
Semakin banyak air migrasi semakin lambat
Semakin panyak pelarut organik migrasi semakin cepat (Rf tinggi)
29
Prosedur :
Pemilihan eluen(pelarut pengembang) – Eluasi sampel dengan berbagai eluen – Pilih yang bisa memisahkan senyawa tersebut
Fraksinasi dengan kromatografi kertas – – – – – –
Ekstrak yang akan ditotolkan ditotolkan berupa garis Jangan lupa di keringkan dengan hair dyer Eluasi dengan eluen terpilih (bisa bidimensional) Amati noda Ambil noda yang diinginkan dengan memotong kertas Ekatraksi dengan pelarut yg sesuai
30
Contoh: Isolasi Flavonoid
•Eluen : BAW (Butanol:Asam Asetat: Water) 4:1:5 (lapisan atas) •Penampak noda Uap amoniak kuning intensif •Ambil bagian yang kuning dipotong kecil-kecil •Ekstraksi 31
KLT
Eluasi : Asending (satu atau dua arah)
Fase diam: Selulosa, silika gel, celite, c elite, Poliamida, sephadex
KLT KLT ana anallitik tik : teba teball 0,1 0,1-0 -0,,25 mm
KLT Preparatif: tebal ad 1 mm
32
KROMATOGRAFI KOLOM
Kolom konvensional elusi berdasarkan gaya gravitasi Kromatografi Cepat Vacum Liquid Chromatography – Eluasi dengan bantuan pompa – Eluasi bisa secara gradien
Kromatografi Cair Kinerja Tinggi – Volume injeksi >> besar – Kolom juga jauh lebih besar dan panjang – Eluat dapat ditampung 33
Contoh Separasi dengan Kromatografi Kolom
34
Prosedur
Pemilihan Eluen untuk Fraksinasi Standar kurkumin dan ekstrak kurkuminoid yang telah dicuci dilarutkan dalam etanol 96% dan ditotolkan 2-5µl pada lempeng KLT. Lempeng KLT selanjutnya dieluasi dengan menggunakan eluen yang sesuai di dalam bak kromatografi sampai batas yang ditentukan. Amatilah lempeng pada lampu UV 254 nm dan 365 nm. Eluen dipilih apabila ekstrak kurkuminoid yang ditotolkan terpisah menjadi 3 noda yaitu kurkumin, bisdemetoksi kurkumin dan desmetoksi kurkumin. Lihat gambar dibawah ini. 35
36
Fraksinasi dengan Kromatografi Kolom Langkah-langkah untuk fraksinasi dengan kromatografi kolom adalah sebagai berikut: – Silika gel sebanyak 75 kali bobot ekstrak kurkuminoid dimasukkan dalam Erlenmeyer dan ditambahkan dengan eluen ± 2 cm diatas permukaan silika gel, dikocok pelan hingga merata dan masukkan dengan hati-hati ke dalam kolom kromatografi yang pada bagian bawahnya telah diberi glass wool . Kolom tersebut kemudian didiamkan selama 1 hari untuk memampatkan dan melihat ada tidaknya keretakan (lihat gambar dibawah ini).
37
Apabila kolom tidak retak, tambahkan eluen 0,5 cm diatas permukaan silika gel dan bila retak ulangi langkah a. Kemudian ke dalam kolom ditambahkan ekstrak kurkuminoid (1% bobot silika) yang telah dicampur dengan silika gel. Alirkan eluen dan tampung sebanyak ± 50 ml dalam Erlenmeyer (eluen ini belum membawa zat kimia tanaman sehingga dapat dibuang). Selanjutnya kran dibuka dan diatur penetesannya (1 tetes/detik) dan ditampung dalam vial atau tabung yang telah diberi nomor masing-masing vial 5 ml (lihat gambar dibawah ini). Pada setiap vial dengan kelipatan 10 dilakukan uji KLT untuk melihat noda yang dihasilkan. Apabila menghasilkan noda yang sama vial-vial tersebut digabung. Penetesan dihentikan apabila vial sudah tidak memberikan noda saat diuji KLT. 38
PEMURNIAN Metode pemurnian:
Rekristalisasi
Sublimasi
Kromatografi
Hasil ISOLAT (DIIDENTIFIKASI)
39
IDENTIFIKASI ISOLAT
Spektroskopi UV/Vis
Spektroskopi IR
Spektroskopi Massa
Spektroskopi Resonansi Magnetik Nuklir
40
Spektrometri UV/Vis
Data Kualitatif data sekunder
Berdasarkan spektra yang dimiliki
41
