DETEKSI ANTIGEN RABIES PADA JARINGAN OTAK DENGAN METODE FLUORESCENT ANTIBODY TECHNIQUE (FAT) 1. PRINSIP
Organ Organ target target virus virus penyeba penyebab b penyak penyakit it rabies rabies adalah adalah jaringan jaringan sistem sistem syaraf syaraf pusat pusat (SSP) (SSP) otak (khususnya, (khususnya, cerebellum, cerebellum, hipokampus, hipokampus, brain stem, stem, Ammon’s horn, horn, thalamus, cerebral cortex dan medulla oblong oblongata) ata).. e!an e!an yang yang menunju menunjukkan kkan gejala gejala klinis klinis rabies rabies atau mati akibat akibat penyakit penyakit rabies, rabies, banyak banyak ditemuka ditemukan n antigen antigen virus rabies rabies di dalam dalam air liur, air mata mata dan jaringan jaringan otak. otak. "alam "alam otak, otak, antigen antigen virus rabies terdapat dalam jumlah yang sangat banyak terutama pada thalamus, pons dan medulla. Organ lain, lain, seperti seperti gld salivari salivarius us memberik memberikan an sensitif sensitifitas itas dan spesifis spesifisitas itas yang yang bervaria bervariasi. si. #aringa #aringan n yang yang direkomendasikan untuk dikoleksi dan diuji adalah pool dari jaringan otak dan batang otak ( brain stem). stem). $dentifikasi agen infeksi atau diagnosis rabies menggunakan fluorescent antibody test (%&'), (%&'), yang direkomendasikan direkomendasikan oleh O dan O$, karena sensitif, sensitif, spesifik, dan akurat. *ji %&' %&' merupakan merupakan uji gold standard yang yang digunakan secara langsung pada preparat ulas ( smear ). ). $mmunoglobulin murni terhadap virus virus atau atau protei protein n nukle nukleoka okaps psid id rabies rabies yang yang sudah sudah dilab dilabel el deng dengan an fluorescein fluorescein isothiocyanat isothiocyanat (%$'+) ditambahkan ke preparat ulastekan dari sampel otak yang sudah difiksasi menggunakan aseton. &gregat protein nukleokapsid diidentifikasi dengan adanya fluoresens spesifik dari ikatan antara konjugat dan protein nukleokapsid (antigen &g - antibody &b) tersebut, saat dilihat di ba!ah mikroskop %&' ber!arna hijau apel yang berpendar dengan intensitas dan bentuk bervariasi.
2. PERAL ERALA ATAN ./ ./ 0un 0unting ting dan dan pin pinse sett . 0elas 0elas oby obyek ek gelas gelas slide slide .1 .1 0ela 0elas s pen penut utup up .2 .2 $nku $nkuba bato torr 134+ .5 6ikrosko 6ikroskop p %&' %&' ( Olymp Olympus us 7ikon 7ikon ) .8 .8 +a! +a!an pet petri ri .3 9emari 9emari pendin pendingin gin ( :ulka :ulkas s) .; .; 0ela 0elas s bea beaje jerr .< Pipe Pipett Paste Pasteur ur Spu Spuit it / ml ml
3. BAHAN BAHAN / REA REAGEN GENSIA SIA / PEREA PEREAKS KSII 1./ P=S p 3,2 1. 1. &set &seton on abso absolu lutt ding dingin in 1.1 &>uades 1.2 1.2 9aru 9aruta tan n eva evans ns blu blue e /?4 /?444 44 1.5 =uff =uffer er glis gliseri erin n 54@ 54@ (mou (mounti nting ng med media) ia) B 1.8 1.8 :onj :onjug ugat at Aabi Aabies es (=io (=iora rad d ), antibodi spesifik terhadap virus rabies dilabel %$'+ 1.3 #arin #aringa gan n otak otak kontro kontroll posit positif if 1.; #arin #aringa gan n otak otak kontro kontroll neg negati ative ve
4. PROSEDUR KERJA
2./ Pembuatan preparat slide tekan ? 2././ =uat lingkaran pada gelas obyek yang akan digunakan untuk membuat preparat tekan dengan menggunakan grafir intan 2./. 'ulis nomor kode spesimen pada ujung preparat 2./.1 9etakkan sampel pada ca!an petri dan potong bagian otak (hipokampus, medulla, pons) dan letakkan pada paper to!el kertas minyak 2./.2 'empelkan gelas obyek pada potongan otak, dimulai dari lingkaran yang dekat dengan nomor specimen, lalu tekan yang kuat. 9akukan hal yang sama pada lingkaran yang satunya. Pindahkan pada kertas to!el dan tekan yang sama di atas beberapa kali agar mendapatkan preparat tekan yang tipis. Preparat dikeringCanginkan sejenak 2./.5 =uat preparat kontrol positif rabies seperti di atas 2./.8 Preparat difiksasi dalam asetone absolut dingin pada suhu C4 o+ selama 14 menit dan dikeringC anginkan kembali 2./.3 Susun preparat dalam ca!an petri besar yang telah dialasi kertas saring basah (untuk menjaga kelembaban) 2./.; 'etesi preparat (D4,/ ml) dengan konjugate rabies yang sudah dilarutkan dengan pelarut konjugat pada lingkaran yang sudah tersedia. Aekomendasi ? * memperoleh hasil yang lebih kontras dan lebih baik %luorescentnya serta mendeteksi sample yang positif lemah 9o! Positif, dianjurkan konjuget =iorad dicampur dengan vans =lue / @ dengan pernbandingan ? 4,/ ml vans =lue / @ dicampurkan dengan ml konjuget =iorad.
C! P"#$%&' E' B*%" 1 + ( S&,- / 1 2000 ) &mbil / gram vans blue dicampur << ml &>uadest &>uabidest steril ( Stock / @ vans =lue ) Simpan dilemari es refrigerator suhu 2 - ; E +
2./.< $nkubasikan dalam inkubator selama 14 menit pada suhu 13 O+. 2././4 +uci dan rendam dengan P=S p 3,2 selama 5 menit sebanyak (dua) kali lalu dikeringC anginkan 2./.// =eri / tetes buffer gliserin 54@ sebagai mounting medium, lalu diberi gelas penutup 2./. / Periksa di ba!ah mikroskop %&' dg kebesaran 24x
. PENETAPAN HASIL
5.1 &gregat protein nukleokapsid virus Aabies diidentifikasi dengan adanya fluorescens spesifik dari ikatan antara protein nukleokapsid virus rabies dan konjugat, maka sampel dinyatakan Positif Aabies. &gregat akan ber!arna hijau apel dan bervariasi intensitas serta bentuknya. 5. Protein non antigen terlihat ber!arna keputihan dan latar belakang memberikan !arna merah.
*ji %&' Positif Aabies Sampel Otak (hipokampus)
(i) Evans Blue
(ii) tanpa Evans Blue
. DAFTAR PUSTAKA &nonim, 4/4, Procedures for Aabies and 9yssavirus "iagnosis $ncluding Aabies %luorescent &ntibody 'est (%&') and Firus $solation, &ustralian &nimal ealth 9aboratory, +S$AO 9ivestock &ustralia, p. /C/; &nonim, 4//, Aabies, $n O$ 'errestrial 6anual, Office $nternational des piGooties (O$). Pp. /C4 &nonim, 4/4, 6anual instruction of antiCrabies nucleocapsid conjugate, =iorad B
DETEKSI NEGRI BODIES RABIES PADA JARINGAN OTAK DENGAN PEARNAAN SELLERS5 1. PRINSIP e!an yang menunjukkan gejala klinis rabies atau mati akibat penyakit rabies, banyak ditemukan antigen virus rabies di dalam air liur, air mata dan jaringan otak. "alam otak, antigen virus rabies terdapat dalam jumlah yang sangat banyak terutama pada thalamus, pons dan medulla. Organ lain, seperti gld salivarius memberikan sensitifitas dan spesifisitas yang bervariasi. #aringan yang direkomendasikan untuk dikoleksi dan diuji adalah pool dari jaringan otak. Sel neuron yang terinfeksi rabies, pada uji histologi menunjukkan bentukan agregat material viral yang disebut H Negri BodiesI dalam sitoplasma neuron. 6eskipun demikian, teknik histologi sangat kurang sensitif dibandingkan dengan metoda imunologik, khususnya pada spesimen autolisis. Negri bodies merupakan benda inklusi kecil dengan diameter 4.5 - 4.3 Jm intrasitoplasma sel syaraf he!an yang terinfeksi Aabies. 7egri bodies dapat berbentuk bulat ( round ), ovular, ameboid, segitiga (triangular), atau oval (oblong). Negri bodies dapat dideteksi dengan pemeriksaan histologi jaringan otak dengan pe!arnaan SellersK. #umlah Negri bodies dapat lebih dari satu dalam sebuah neuron. :eberadaan dan konsentrasi Negri Bodies tergantung pada tingkat infeksi he!an yang bersangkutan. Negri Bodies dengan pengecatan SellersK terlihat merah magenta (asidofilik) dan mempunyai granula biru gelap di dalamnya (basofilik), serta strukur yang berbedaCbeda. $ni dapat dilihat diba!ah mikroskop. 2. PERALATAN ./ . .1 .2 .5 .8
0unting dan pinset 0elas objek gelas slide Penutup gelas objek Coplin jar atau staining dish 6ikroskop, perbesaran /444L 6inyak emersi
3. BAHAN / REAGENSIA 1./ Otak he!an 1. 6inyak emersi 1.1 Pe!arnaan SellersK 3.3.1 L!%&' A ? 6ethylen =lue 6ethyl &lkohol (=ebas &ceton)
/g /44 ml
1.1. L!%&' B =asic %uchsin
4,5 g
6ethyl &lkohol
54 ml
P"#$%&' P"6!'' S"**"!5 : +ampurkan kedua larutan & dan larutan = dengan perbandingan ? / dengan baik tanpa 3.3.2 disaring 1.1.1 "iamkan inkubasikan selama 2 jam sebelum digunakan 1.1.2 Simpan didalam ruang yang gelap hindari sinar cahaya pada suhu ruangan.
1.2 &ir kran yang mengalir (tap water )
4. PROSEDUR KERJA 2./ Pembuatan preparat slide tekan ? 2././ =uat preparat tekanulas dari otak anjing yang diuji dengan menekan organ pada kertas menggunakan gelas objek. 2./. 'ulis nomor specimen pada ujung preparat. 2./.1 =uat preparat kontrol positif rabies seperti di atas sebegai kontrol positif 2./.2 reparat yang masih basah dilakukan pe!arnaanfiksasi dalam larutan yang telah disiapkan selama 5 detik. 2./.5 =ilas slide dengan cepat pada air yang mengalir kran. 2./.8 :ering anginkan sampai kering tanpa ada noda di preparat tersebut. 2./.3 'etesi minyak immersi sebagai mounting. 2./.; Periksa di ba!ah mikroskop dengan pembesaran /444L
. INTERPRETASI DAN PENETAPAN HASIL :omponen jaringan akan ter!arnai sebagai berikut? 5./ Sel syaraf 5././ Sitoplasma - ber!arna biru atau biru keunguan 5./. 7uklei dan nukleoli - ber!arna biru tuagelap 5. #aringan interstitial - ber!arna merah muda 5.1 Serabut syaraf - ber!arna sangat merah muda 5.2 Sel darah merah - ber!arna merah tembaga 5.5 Spesimen dinyatakan HPositif AabiesI jika terlihat Negri Bodies yang ber!arna merah magenta dan adanya granula biru gelap serta mempunyai strukur yang beraneka ragam berbeda - beda (dapat berbentuk bulat (round ), ovular, ameboid, segitiga (triangular), atau oval (oblong).
HASIL LAB LAB UJI UJI SELLERS SELLERS HASIL Positif
BerwarnaMagentaOblong
. DAFTAR PUSTAKA Felleca, .6. dan %.'. %orrester, /<;/, 9aboratory 6ethods for "etecting Aabies, *.S "epartment of ealth and uman Services, Public ealth Service, +enters for "isease +ontrol, &tlanta, 0eorgia, p. /42C/43M /2;C/2<.
UJI BIOLOGIS RABIES PADA MENCIT 1. PRINSIP Aabies adalah penyakit Goonotik infeksius yang ditandai oleh encephalitis yang dapat berhubungan dengan paralisis, perubahan tingkah laku dan manifestasi neurologik yang dapat berakibat fatal. Aabies diakibatkan oleh virus neurotropik dari 0enus 9yssavirus, family Ahabdoviridae dan dapat menular ke semua jenis mammalia. Organ target virus penyebab penyakit rabies adalah jaringan sistem syaraf pusat (SSP) otak (khususnya, cerebellum, hipokampus, brain stem, Ammon’s horn, thalamus, cerebral cortex dan medulla oblongata). Pada he!an yang telah menunjukkan gejala klinis rabies atau mati akibat penyakit rabies, banyak ditemukan antigen virus rabies di dalam air liur, air mata dan jaringan otak. Oleh karena itu jaringan otak merupakan pilihan jenis specimencontoh yang harus dikirim untuk diagnosa rabies. "alam otak, antigen virus rabies terdapat dalam jumlah yang berlimpah terutama pada thalamus, pons dan medulla. Organ lain, seperti gld salivarius memberikan sensitifitas dan spesifisitas yang bervariasi. #aringan yang direkomendasikan untuk dikoleksi dan diuji adalah pool dari jaringan otak dan batang otak ( brain stem).
Pada kasus jika uji %&' menunjukkan hasil yang tidak dapat disimpulkan, atau kasus paparan rabies pada manusia, diperlukan uji lebih lanjut terhadap sampel yang sama dengan mengisolasi virus pada kultur sel atau uji inokulasi pada mencit. &tau melakukan uji ulang %&' terhadap sampel lain yang direkomendasikan. *ji inokulasi pada mencit dilakukan pada mencit baru lahir atau umur 1C2 minggu yang diinokulasikan intracerebral. Sampel yang digunakan adalah pool sampel otak dan diobservasi selama ; hari. #ika terdapat mencit yang mati antara hari keC5 sampai dengan hari keC; post inokulasi maka sampel otaknya dikonfirmasi dengan uji %&'. 2. PERALATAN ./ 0unting dan pinset steril . 6ortar dan pastel steril .1 Spuit / ml dengan jarum ;0 .2 :andang mencit beserta litter (berupa? sekam) 3. BAHAN 1./ 6encit umur 1C2 minggu (/C/2 g) sebanyak 5 ekor atau / koloni litter mencit baru lahir umur hari 1. P=S p 3,2 steril 1.1 &ntibiotik 1.2 "iethyl ter untuk anastesi 1.5 9arutan antiseptik dan kapas 4. CARA KERJA 2./ $nokulum disiapkan dengan membuat suspensi /4C4@ (!v) dari homogenate otak termasuk batang otak (seperti cortex, Ammons horn, thalamus, medulla oblongata ) dalam larutan buffer isotonik yang mengandung antibiotika, caranya ? 0erus potongan otak kiraCkira / gram sampai lembut, lalu tambahkan P=S ph 3,2 steril /4 ml untuk membuat suspensi /4 @ 9alu sentrifuse selama /4 menit. •
• •
&mbil 4,< supernatan dan tambahkan 4,/ antibiotik
2. 6encit dianastesi terlebih dahulu, kemudian diinokulasi dengan menyuntikkan inokulum secara $ntracerebral dengan dosis 4,4/ - 4,41 ml 2.1 6encit diobservasi selama ; hari
2.2 Setiap mencit yang mati menunjukkan gejalaCgejala rabies ( lumpuh, gemetar ) diuji terhadap rabies dengan uji %&'. #ika menggunakan mencit baru lahir maka setiap ekor bayi mencit tersebut diuji %&' pada hari keC5, 3, <, dan // post inokulasi. 2.5 #ika terdapat kematian mencit pada empat hari pertama post inouklasi maka dinilai sebagai non spesifik (kemungkinan akibat stres atau infeksi bakterial, dll)
. DAFTAR PUSTAKA &nonim, 4//, Aabies, $n O$ 'errestrial 6anual, Office $nternational des piGooties (O$). Pp. /C4
