ESCUELA PROFESIONAL DE BIOLOGÍA
PRÁCTICA Nº 04 Control Microbiológico de la Leche ASIGNATURA DOCENTE
INTEGRANTES
CICLO
: Micr Microb obio iolo logí gíaa de los los Ali Alime ment ntos os II : Blgo Blgo.. Díaz Díaz Zap Zapat ataa Alb Alber erto to Arias Matos Lisbeth Aycachi Inga I nga Rómulo Rómu lo : Chafloque Millones Alex M. Culqui Lozada Liliana : 2008 - I
Lambayeque, julio de 2008.
CONTROL MICROBIOLÓGICO DE LA LECHE I.
INTRODUCCIÓN
La leche leche como como produc producto to natura naturall analiza analizada da contien contienee microo microorg rgani anismo smoss deben deben ser estudi estudiado adoss por su utilid utilidad ad y otros por por la capacida capacidad d de alterar alterar la compos composició ición n y características organolépticas de la leche y derivados lácteos o por ser agentes causales de enfe enferm rmed edad ad en los los cons consum umid idor ores es,, es así así que que en ella ella pued pueden en enco encont ntra rars rsee microorganismos de los diferentes grupos: bacterias, hongos (mohos y levaduras) y virus, los cuales serán descritos brevemente a continuación, de acuerdo a su importancia en la industria láctea. La leche como producto natural utilizado en la elaboración de mantequilla es un componente importante que le da un valor nutritivo y además como producto que tiene un alto contenido de grasas que mayormente son, grasas saturadas, colesterol y calorías etc. MICROORGANISMOS DE IMPORTANCIA EN LECHE CRUDA A continuación presentamos una descripción de los principales microorganismos que pueden encontrarse en leche cruda.
BACTERIAS Las bacterias bacterias.. En la leche leche se pueden pueden encontrar encontrar diverso diverso género géneross y especie especiess bacterianas bacterianas.. Aquellas de mayor importancia importancia en la industria industria láctea son las llamadas llamadas bacterias lácticas y las bacterias coliformes. a) Bacterias Gram. Positivas:
Bacterias lácticas: son un grupo de bacterias de diferentes géneros, ampliamente distribuidas en la naturaleza. Se encuentran en el suelo y en cualquier lugar donde existan altas concen concentrac tracion iones es de carbohi carbohidra dratos tos,, proteín proteínas as desdob desdoblada ladas, s, vitami vitaminas nas y poco poco oxigeno. Son Gram positivas y su forma puede ser bacilar, cocoide u ovoide. Algunas tienen forma bifida ( Bifidobacterium) . Soportan pH 4 en leche. Son anaeró anaeróbic bicas as facultat facultativa ivas, s, mesófi mesófilas las y termófi termófilas las y de crecimi crecimient ento o exigent exigente. e. Pueden ser homofermentativas (más del 90% de su metabolismo resulta en ácido láctico) o heterofermentativas (producen además del ácido láctico, otros ácido ácidoss y gase gases) s).. Los Los prin princip cipale aless géne género ross de bacte bacteria riass ácido ácido lácti lácticas cas son: son: Lact Lactoco ococcu ccus, s, Leucon Leuconost ostoc oc,, Pedio Pediococ coccus cus,, Str Streptoco eptococcu ccus, s, Lactob Lactobaci acillu llus, s, Carnobac Carnobacteri terium, um, Entero Enterococc coccus, us, Vagococcu agococcus, s, Aerococ Aerococcus, cus, Tetragono etragonococc coccus, us, Alloiococcus y Bifidobacterium. Su estudio en el ámbito tecnológico es importante por lo siguiente: Son formadoras de textura y ayudan al establecimiento de las condiciones para la elaboración de ciertos productos lácteos. Por efecto de la acidez producida por la
ferme ferment ntac ació ión n de la lacto lactosa sa,, la leche leche pued puedee llega llegarr a coag coagul ular ar graci gracias as a la coalescencia de las caseínas al alcanzarse el pH iso-eléctrico, lo cual es deseable en la elaboración de yogurt y quesos. En la elaboración de crema y mantequilla una ligera acidificación permite acelerar el proceso y aumentar el rendimiento. Algunas especies producen polisacáridos (gomas, mucina), que aumentan la viscosidad de la leche cambiando su textura ( S. termophilus, Lb. bulgacricus, Lc. cremoris). Aportan sabor y aroma, ya que como parte de su metabolismo fermentativo se da la producción de acetaldehído, diacetilo, acetoina, acetona, lactonas, ácidos volátiles, alcohol y gas. El diacetilo es el principal responsable del aroma de la mantequilla. La acetoina lo es en el yogurt mientras que el ácido láctico aporta sabor a diversos productos fermentados. Además la producción de enzimas que intervienen en el afinado de los quesos por degradación de las proteínas y las grasas afectan notablemente las características organolépticas de los mismos. Ejercen efecto biopreservador manifestado en la prolongación de la vida útil de los productos elaborados con sus cultivos. Este efecto se lleva a cabo por varios mecanis mecanismos mos:: a) ciertas ciertas especi especies es produc producen en bacteri bacterioci ocinas nas ( Lactococcus Lactococcus lactis subsp. lactis, Enterococcus ) las cuales son proteínas que se comportan como antibióticos y que inhiben el crecimiento de bacterias relacionadas con estas; b) con la producción de ácido y descenso del pH se logra la inhibición de otras espe especi cies es bact bacter eria iana nass y la cons conser erva vaci ción ón de los los alim alimen ento tos; s; c) el efec efecto to biopreservador también se cumple gracias a la l a competencia por nutrientes que se da entre las diversas especies bacterianas. Aportan beneficios para la salud de los consumidores, el cual se ha descrito como efec efecto to prob probió ióti tico co.. Este Este pued puedee mani manife fest star arse se de mane manera ra espe especi cifi fica ca en la prevención y reducción de los síntomas en los cuadros diarreicos. Además se le han atribuido a las BAL, efecto preventivo de tumores, anticolesterolemico y modulador del sistema inmunológico.
Micrococcos : Débilmente fermentadores, forman parte de la flora inocua que contamina la leche cruda. Tienen poca actividad enzimática, por lo tanto son de muy poca importancia como agentes de adulteración en la leche. Sin embargo por ser la flora más abundante en leche cruda y tener cierta capacidad proteolítica pueden llegar a ser causante de alteraciones en leches pasteurizadas mal almacenadas.
Estafilococos: Son Son anae anaero robi bios os facu facult ltat ativ ivos os,, fuer fuerte teme ment ntee ferm fermen enta tado dore res. s. Son Son de gran gran importancia desde el punto de vista sanitario. Causan mastitis y pueden provocar enfermedades o intoxicaciones en los humanos. Staphilococus Staphilococus aureus aureus produce una exotoxina que causa fuertes trastornos intestinales en los humanos, la cual es term termor orre resi sist sten ente te,, por por lo cual cual no es dest destru ruid idaa con con la past pasteu euri riza zaci ción ón.. El Staphilococcus epidermidis se ve implicado en algunos casos de mastitis, por lo cual puede llegar a contaminar la leche.
Bacterias esporuladas : los Bacillus son bacterias aeróbicas con actividad enzimática variada producen acidific acidificació ación, n, coagul coagulació ación n y proteo proteolis lisis. is. Los Clostridium son son anaero anaerobio bioss estrict estrictos, os, produc producen en gas. gas. Alguno Algunoss produc producen en toxina toxinass patóge patógenas nas ( Clostridium Amboss géne género ross son son de poca poca impo import rtan anci ciaa en lech lechee crud cruda, a, su botulinum) . Ambo crecimi crecimiento ento es inhibi inhibido do por las bacteri bacterias as lácticas lácticas.. Cobran Cobran import importanc ancia ia en pro produ ducto ctoss lácteo lácteoss como como en leche leche past pasteu euri rizad zadas as,, ques quesos os fund fundid idos os,, lech leches es conc concen entra trada das, s, ques quesos os de past pastaa cocid cocida. a. Resi Resist sten en la past pasteu euriz rizac ació ión n por por su capacidad de producir esporas, las cuales solo se destruyen a temperaturas por encima de 100 ºC.
Otras bacterias Gram + que pueden encontrarse en la leche son Corynebacterium , bacterias propionicas, Brevibacterium estos últimos se encuentran en las cortezas de algunos quesos madurados almacenados en condiciones húmedas. b) Bacterias Gram. Negativas
Enterobacterias: los miembros de la familia Enterobacteriaceae son huéspedes normales del intestino de los mamíferos, por lo tanto su presencia en el agua y la leche se relaciona con contaminación de origen fecal. Las enterobacterias son menos abundantes en la leche que otras bacterias gran negativas, sin embargo, tienen una gran importancia desde dos puntos de vista, higiénico: ya que varias de estas especies especies tienen poder patógeno, de las cuales la más temible temible es la Salmonella y otras que pueden provocar trastornos gastrointestinales (Yersin bacterias as ersinia, ia, E. Coli, Coli, Shige Shigella lla)) ; y tecnológico: ya que son bacteri heteroferment heterofermentativas ativas,, grandes grandes productoras productoras de gas (carbónico (carbónico e hidrogeno) hidrogeno) además producen sustancias viscosas y de sabor desagradable, todo lo cual conduce a la alteración de la leche o subproductos. De las enterobacterias las más más comun comunes es enco encont ntrad radas as en los los prod produc ucto toss lácte lácteos os son son las del del grup grupo o Colif Colifor orme mess ( Escheric ). La Escherichia, hia, Entero Enterobact bacter er,, Klebsiel Klebsiella la y Citrobac Citrobacter ter determinación de su presencia indica calidad higiénica de la leche cruda y pasteurizada. Ente Entero roba bact cter eria iass más más comu comune ness de la lech lechee crud cruda: a: Escheri Escherichia chia coli, coli, Entero Enterobact bacter er aerógene aerógenes, s, Klebsiel Klebsiella, la, Citrobac Citrobacter ter,, Salmonel Salmonella, la, Shigella Shigella,, Proteus, Serratia. Los últimos dos géneros se consiguen poco frecuentes, son microorganismos inocuos pero por su poder proteolítico pueden provocar alteraciones en la leche.
Pseudomonas: Más del 50% de la flora Gram negativa negativa de la leche cruda esta representada representada por este género. Juegan un papel importante en la conservación de productos
lácteos, ya que además de ser psicrófilas, varias especies tienen un gran poder proteolítico y lipolítico. Además se ha descrito que algunas de estas enzimas resisten temperaturas por encima de los 80 ºC, por lo cual pueden causar alteraciones aún en productos elaborados con leches pasteurizadas,
Acromobacteriaceae : este grupo de bacterias no fermentan la lactosa, no son proteolíticas ni patógenas, pero representan las bacterias psicrófilas que crecen en las leches cons conser erva vada dass a baja baja tempe temperat ratur uras as,, algun algunas as pued pueden en prod produci ucirr sust sustan ancia ciass visc viscos osas as y pigm pigmen ento tos. s. Se han han desc descrit ritos os los los géne género ross Flavobacterium, Alcaligenes y Achromobacter .
Bacterias gran negativas diversas: Las Brucellas son bacterias patógenas para los animales y para el hombre, aunque aunque poco poco frecuen frecuente, te, pueden pueden llegar llegar a causar causar cuadro cuadross de mastiti mastitis. s. Se destruyen con la pasteurización. Mohos y Levaduras: No tienen importancia en leche fluida, si no más bien en los productos. Algunas espe especi cies es son son utili utilizad zadas as como como culti cultivo voss lácteo lácteoss para para el afina afinado do de los los ques quesos os madurados madurados como el Penicil Penicillium lium candidum candidum y Penicill Penicillium ium camemmbe camemmberti rti en los quesos de corteza blanca como el Camembert y el Penicillium Penicillium roqueforti roqueforti en los quesos de pasta azul. Las levaduras al igual que los mohos son de poca importancia en la leche liquida y son son fácil fácilme ment ntee dest destru ruid idos os a tempe temperat ratur uras as de past pasteu euriz rizaci ación ón.. En la leche leche se encuentran la especies Cándida cremoris , Sacharomices lactis , Sacharomices kefir . Torula kefir k efir se encuentra en los granos de kefir utilizados para producir esta bebida láctea, caracterizada por su sabor ácido-alcohólico, producto de la fermentación de la lactosa por estas especies.
I.
OBJETIVOS. Determinar la calidad de la leche
II.
EQUIPOS Y MA MATERIALES. Pipetas Graduadas Placas Petri de 100 mm de diámetro
Tubos de Dilución de 150mm x 15 mm Tubos Agar Plate Count Agar ENDO Solución salina fisiológica Estufa
Tubos tapa rosca. Tubos Aparatos Québec. Asa de Drigalsky. Baño maría
III. PROCEDIMIENTO
Aerobias Mesófilas Viables 3.1. Numeración De Bacterias Aerobias Recuento en placa por siembra de superficie: Placass con con agar agar cont contro rolad lado o deja dejado do una una noch nochee en estu estufa fa en cont contro roll de Placa esterilidad (Plate Count). Realizar diluci dilucione oness hasta hasta 10-3 Realizar 1 ml.
1 ml.
10-1 0.1 ml.
10-2 0.1 ml.
10-3 0.1 ml.
Agar Plate Count
DILUCIONES 10-3
cada dilució dilución n sembra sembrarr dos placas por por diluci dilución ón agrega agregando ndo 0.1ml. 0.1ml. del De cada inóculo y usando una espátula de Drigalsky expandir toda la muestra.
I
ncubar 30 ºC x y 48 horas.
a 24
Realizar 1º lectura a las 24 horas y la 2º lectura a las 48 horas. Seguidamente hacer el recuento de las colonias en UFC/mL. 3.2.
Numeración De Coliformes Totales Totales -1
-3
De las diluciones anteriormente hechas se toma de la dilución 10 hasta la 10 y
de cada uno se siembra por agotamiento y estría en placas de agar ENDO Seguidamente se lleva a incubación a temperatura de 37º/ 24 horas. Observar crecimiento de bacterias coliformes. 3.3.
Reducción de microorganismos viables Método de reducción de colorantes azul de metileno. Pipetear 1 ml de azul de metileno y agregar al dos tubos de tapa rosca, luego adicionar 10 ml de leche, de inmediato tapar los tubos y mezclar suavemente ( se invierte tres veces).
Verificar en el baño maría un control positivo y un negativo, un termómetro y la temperatura tiene que estar a 37ºC (al igual que de la leche).
Colocar los tubos en baño maría, tapar, cubrir y cada media hora observar. Aflojar ligeramente la tapa para que el contenido de la muestra alcance la temperatura del baño maría. Observar los tubos hasta que se complete 4 horas, cada vez que se controla se invierte suavemente por tres veces el contenido de la muestra.
III.
RESULTADOS
Numeración De Bacterias Aerobias Aerobias Mesófilas Viables
DILUCION 10-1
DILUCION 10-2
DILUCION 10-3
Tabla Nº 01 10-1
10-2
10-3
A las 48 horas
500
155
30
Recuento Total (UFC/mL)
5 x 10 4
1.5 x 10 4
0.3 x 10 4
Ufc/mL de muestra = 0.3 x 10 4
Presencia de Coliformes Totales
DILUCION 10-1
DILUCION 10-2
DILUCION 10-3
Reducción de microorganismos viables Método de reducción de colorantes azul de metileno.
El tiempo es inversamente proporcional al contenido de la muestra. Realizar una interpretación cuantitativa:
Mayor de 4 horas 3-4 horas 30 minutos a 3 horas Menor de 30 30 minutos minutos
-----> -----> ---- > ----- >
leche muy buena (A) leche buena (B) leche aceptable (C) leche inaceptable (D)
Resultados de la práctica:
A los 30 min.
A 1 hora
A 1 hora 30 min
A las 2 horas.
La leche se redujo a las 2 horas.
IV. ♠
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♠ ♠
CONCLUSIONES Se logró desarrollar el método de numeración de microorganismos (bacterias aerobias mesófilas viables). Mediante los cálculo de recuento de bacterias aerobias mesófilas viables se llego a un resultado de 0.3 x 10 4 UFC/mL en la muestra de leche procedente de …… ………………ya que los limites permisibles para la leche cruda son de 2 x 10 4 – 5 x 10 4, siendo aceptable para fines industriales. Se Determinó por el método de reducción del azul de metileno la calidad de la muestra (leche). No se observò presencia de bacterias coliformes termotolerantes. Se determinó que la muestra procesada (leche) era una leche aceptable(C) ya que la leche se redujo a las 2 horas.
V.
REFERENCIAS BI BIBLIOGRAFICAS
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