Florin Stănică
Microînmulţirea plantelor horticole
Editura INVEL-Multimedia Bucureşti, 2004
Referenţi ştiinţifici:
Prof. univ. dr. Corneliu Petrescu Prof. univ. dr. Alexandru Teodorescu
© 2004 Versiune electronicã INVEL-Multimedia Toate drepturile rezervate. Nici un fragment din această publicaţie nu poate fi reprodus, stocat într-un sistem de recuperare a informaţiilor sau transmis sub orice formă sau prin orice mijloace electronice, mecanice, fotocopiere, înregistrare sau de altă natură, fără permisiunea prealabilă, în scris, a editurii şi autorului.
INVEL-Multimedia din cadrul SC MAVI SERPICO TRADE SRL str. Fabrica de Chibrituri nr. 24-26, sector 5, Bucureşti Tel./Fax: 021/430.35.42, e-mail:
[email protected] Colecţia www.teze_de_doctorat.ro
ISBN 973-7753-07-0
Dedic această lucrare studenţilor şi colaboratorilor mei
Cuvânt înainte Într-o eră în care progresul ştiinţei şi tehnicii a dus omul în cosmos, în adâncurile oceanului, i-a permis să atingă viteze supersonice şi să dezvolte inteligenţa artificială, culturile in vitro de celule şi ţesuturi vegetale au apărut, au evoluat şi s-au dezvoltat în acelaşi ritm. Pătrunderea în universul celulei, în intimitatea proceselor fiziologice şi manipularea materialului genetic sunt realizări comparabile cu cele prezentate mai sus, având aceeaşi importanţă pentru umanitate. Suntem în prezent în plină revoluţie biotehnologică, materializată printr-un volum imens de aplicaţii practice ale culturilor in vitro în domeniul ştiinţelor agricole, biologice, medicale, în farmacologie şi industria alimentară, în industria cosmetică, a coloranţilor naturali şi a substanţelor bioactive. Cercetările în biotehnologie vizează rezolvarea unor probleme majore ale omenirii cum sunt: criza energetică, malnutriţia, valorificarea şi conservarea resurselor genetice, reciclarea materiei organice, luarea în cultură şi valorificarea terenurilor degradate, reducerea poluării mediului înconjurător. Apărută dintr-o necesitate obiectivă, lucrarea “Microînmulţirea plantelor horticole”, aflată la a doua ediţie, actualizată şi completată, tratează un domeniu care stă la baza oricărui tip de producţie agricolă: obţinerea de material săditor şi semincer cu înaltă valoare biologică. Concepută ca un instrument de lucru, “Microînmulţirea plantelor horticole” face în prima parte, o prezentare amplă a dotărilor laboratorului de culturi in vitro., o trecere în revistă a componentelor mediilor de cultură, pentru a insista în continuare, asupra modului de preparare şi sterilizare a acestora. Un capitol aparte este destinat sterilizării şi asepsiei în culturile in vitro. Materialul abundă în informaţii utile, tabele ajutătoare, scheme de lucru şi fotografii sugestive, utile organizării activităţii în domeniul culturilor in vitro. În a doua parte a lucrării, sunt prezentate pe larg principalele tehnici folosite pentru microînmulţirea plantelor in vitro. Sunt prezentate, în tabele sintetice, rezultatele cercetărilor pe tipuri de culturi, la principalele specii horticole.
4
Sunt prezentate, de asemenea alte tehnici de cultură in vitro cu aplicabilitate în ameliorarea plantelor horticole, conservarea resurselor genetice, fitopatologie. O noutate în literatura de specialitate românească este capitolul referitor la baby plant, o gamă de produse decorative obţinute in vitro şi deosebit de apreciate pe piaţă. Lucrarea se înscrie pe linia continuării tradiţiei învăţământului horticol bucureştean în domeniul biotehnologiilor aplicate în horticultură şi este un instrument util la îndemâna specialiştilor, cadrelor didactice, studenţilor, cercetătorilor şi tuturor celor care activează în acest domeniu de vârf al ştiinţei. Adresez cu această ocazie mulţumiri, colaboratorilor mei, şef lucrări dr. Monica Dumitraşcu, şef lucrări dr. Adrian Peticilă, drd. ing. Oana Diaconescu şi drd. ing. Ruxandra Gâlă, referenţilor ştiinţifici şi Editurii INVEL-Multimedia. Tuturor celor care se vor apleca asupra acestei lucrări, o vor studia şi analiza critic, le adresez mulţumirile mele şi invitaţia de a ne transmite opiniile lor la adresa
[email protected], ajutându-ne astfel, să îmbunătăţim ediţiile viitoare. Bucureşti, august 2004
Conf. univ. dr. Florin STĂNICĂ
5
CUPRINS CAPITOLUL 1. Istoricul culturilor in vitro CAPITOLUL 2. Laboratorul de culturi in vitro 2.1. Aspecte generale 2.2. Zona nesterilă 2.2.1. Camera de păstrare şi pregătire a materialului vegetal 2.2.2. Magazia de materiale 2.2.3. Magazia de substanţe chimice 2.2.4. Camera pentru pregătirea mediilor de cultură 2.2.5. Camera pentru autoclavarea mediilor de cultură şi presterilizarea materialului vegetal 2.2.6. Magazia pentru medii de cultură 2.2.7. Camera de creştere 2.2.8. Camera (spaţiile) de aclimatizare 2.2.9. Sera şi solariile 2.2.10. Spălătorul 2.3. Zona sterilă CAPITOLUL 3. Mediile de cultură şi prepararea lor. 3.1. Constituenţi cu rol nutritiv 3.1.1. Constituenţi minerali 3.1.1.1. Macroelementele 3.1.1.2. Microelementele 3.1.2. Constituenţi organici 3.1.2.1. Carbohidraţii 3.1.2.2. Aminoacizii 3.1.2.3. Vitaminele 3.2. Constituenţi cu rol fitoregulator. 3.2.1. Auxinele 3.2.2. Citochininele 3.2.3. Giberelinele 3.2.4. Alte substanţe cu rol fitoregulator 3.3. Constituenţi cu rol stabilizator. 3.3.1. Apa 3.3.2. Agenţii de solidificare 3.3.3. Stabilizatorii osmotici şi de pH 3.3.4. Substanţele antioxidante şi absorbante 3.4. Concentraţii. Prepararea soluţiilor stoc. 3.5. Prepararea mediului de cultură 3.6. Probleme care apar la pregătirea şi folosirea mediilor de cultură. CAPITOLUL 4. Sterilizarea şi asepsia în culturile in vitro. 4.1. Agenţi sterilizanţi 4.2. Sterilizarea vaselor de cultură şi a instrumentarului folosit 4.2.1. Închiderea vaselor de cultură 4.2.2. Sterilizarea vaselor de cultură 4.2.3. Sterilizarea instrumentarului
6
4.3. Sterilizarea mediului de cultură şi a apei 4.4. Dezinfectarea materialului vegetal 4.5. Contaminările şi detectarea lor CAPITOLUL 5. Microînmulţirea plantelor horticole 5.1. Consideraţii generale 5.2. Fazele microînmulţirii in vitro 5.2.1. Pregătirea materialului vegetal 5.2.2. Iniţierea şi stabilizarea 5.2.3. Multiplicarea 5.2.4. Înrădăcinarea 5.2.5. Aclimatizarea 5.3. Cultura de meristeme şi apexuri 5.3.1. Clasificarea meristemelor 5.3.2. Cultura de meristeme 5.3.3. Cultura de apexuri 5.4. Cultura de fragmente uninodale 5.5. Cultura de lăstari axilari CAPITOLUL 6. Devirozarea plantelor horticole prin culturi in vitro 6.1. Devirozarea prin culturi de meristeme 6.2. Microaltoirea 6.2.1. Microaltoirea in vitro 6.2.2. Microaltoirea in vivo 6.2.3. Microaltoirea ex vitro 6.3. Producerea plantelor devirozate prin alte tehnici in vitro CAPITOLUL 7. Organogeneza in vitro 7.1. Organogeneza directă 7.1.1. Organogeneza adventivă de lăstari 7.1.2. Organogeneza adventivă de rădăcini 7.2. Organogeneza indirectă CAPITOLUL 8. Embriogeneza somatică 8.1. Formarea embrionilor somatici 8.2. Embriogeneza somatică directă 8.3. Embriogeneza indirectă 8.4. Poliembrionia nucelară 8.5. Încapsularea materialului vegetal in vitro 8.5.1. Sămânţa sintetică 8.5.2. Încapsularea unor organe şi ţesuturi in vitro CAPITOLUL 9. Embriocultura in vitro la plantele horticole CAPITOLUL 10. Producerea haploizilor 10.1. Aspecte generale 10.2. Androgeneza in vitro 10.3. Fecundarea in vitro
7
CAPITOLUL 11. Cultura de calus in vitro. 11.1. Cultura de calus 11.2. Cultura de protoplaşti şi hibridarea somatică 11.3. Regenerarea plantelor dintr-o singură celulă CAPITOLUL 12. Baby plant 12.1. Consideraţii generale 12.2. Tipuri de produse şi materiale folosite la producerea de baby plant 12.2.1. Vase din sticlă 12.2.2. Alte materiale 12.3. Folosirea mediilor de cultură colorate BIBLIOGRAFIE SELECTIVĂ
8
CONTENTS CHAPTER 1. History of in vitro cultures CHAPTER 2. In vitro culture laboratory 2.1. General aspects 2.2. Unsterile area 2.2.1. Biological material preparation room 2.2.2. Materials storage room 2.2.3. Chemical storage room 2.2.4. Culture media preparation room 2.2.5. Culture media and biological material sterilization room 2.2.6. Culture media storage room 2.2.7. Growth chamber 2.2.8. Acclimation room 2.2.9. Greenhouse and tunnels 2.2.10. Washing room 2.3. Sterile area CHAPTER 3. Culture media and their preparation 3.1. Nutrients 3.1.1. Mineral compounds 3.1.1.1. Macro elements 3.1.1.2. Microelements 3.1.2. Organic compounds 3.1.2.1. Carbohydrates 3.1.2.2. Amino acids 3.1.2.3. Vitamins 3.2. Growth regulators 3.2.1. Auxins 3.2.2. Cytokinins 3.2.3. Giberellins 3.2.4. Other growth regulators 3.3. Stabilization compounds 3.3.1. Water 3.3.2. Gelling compounds 3.3.3. Osmotic and pH stabilizers 3.3.4. Antioxidants and absorbents 3.4. Concentrations. Preparation of stock solution. 3.5. Culture medium preparation 3.6. Problems connected to the culture media preparation and use CHAPTER 4. Sterilisation and asepsis for in vitro cultures 4.1. Sterilising agents 4.2. Culture vessels and tools sterilisation 4.2.1. Culture vessels closure 4.2.2. Culture vessels sterilisation 4.2.3. Tools sterilisation 4.3. Culture medium and water sterilisation
9
4.4. Biological material disinfection 4.5. Contamination and their detection CHAPTER 5. Horticulture plants micropropagation 5.1. General aspects 5.2. In vitro micropropagation stages 5.2.1. Biological material preparation 5.2.2. Initiation and stabilisation 5.2.3. Multiplication 5.2.4. Rooting 5.2.5. Acclimatisation 5.3. Meristem and apex culture 5.3.1. Meristem classification 5.3.2. Meristem culture 5.3.3. Apex culture 5.4. Single node culture 5.5. Axillary shoots culture CHAPTER 6. Horticultural plants virus elimination using in vitro cultures 6.1. Virus elimination using meristem cultures 6.2. Micrografting 6.2.1. In vitro micrografting 6.2.2. In vivo micrografting 6.2.3. Ex vitro micrografting 6.3. Virus free plant obtaining using other in vitro techniques CHAPTER 7. In vitro organogenesis 7.1. Direct organogenesis 7.1.1. Adventitious shoot organogenesis 7.1.2. Adventitious root organogenesis 7.2. Indirect organogenesis CHAPTER 8. Somatic embryogenesis 8.1. Somatic embryo formation 8.2. Direct somatic embryogenesis 8.3. Indirect somatic embryogenesis 8.4. Nucellar poliembriony 8.5. In vitro encapsulation of biological material 8.5.1. Synthetic seed 8.5.2. In vitro encapsulation of tissues and organs CHAPTER 9. In vitro embrioculture in horticultural plants CHAPTER 10. Haploid production 10.1. General aspects 10.2. In vitro androgenesis 10.3. Test-tube fertilisation
10
CHAPTER 11. In vitro callus culture 11.1. Callus culture 11.2. Protoplast culture and somatic hybridisation 11.3. Plant regeneration from a single cell CHAPTER 12. Baby plant 12.1. General considerations 12.2. Products and materials used for baby plant production 12.2.1. Glass ware 12.2.2. Other materials 12.3. Use of coloured culture media SELECTIVE REFERENCES
11
Capitolul 1 Istoricul culturilor in vitro Cultivarea in vitro a unor celule şi ţesuturi vegetale este o ramură a ştiinţelor biologice ale căror începuturi corespunde cu începutul secolului XX. Evoluţia sa de-a lungul timpului a fost demnă de secolul “vitezei” astfel încât, în aceşti ultimi ani, vorbim de un ansamblu de tehnici şi metode in vitro grupate generic sub numele de biotehnologii vegetale. Teoria care a stat la baza acestei ştiinţe a fost lansată însă cu mult timp înainte. În 1838, Schleiden şi Schwan au afirmat că celulele vegetale sunt, într-o oarecare măsură, autonome şi capabile să regenereze părţi din plante sau plante întregi. Această proprietate a fost numită totipotenţă şi a reprezentat o adevărată provocare pentru un mare număr de oameni de ştiinţă. Primele încercări nereuşite de a cultiva ţesuturi vegetale in vitro
s-au datorat lui
Haberlandt (1902). Au urmat apoi numeroase tentative care au deschis calea spre tot atâtea domenii noi de cercetare. Abia în 1939, după descoperirea rolului hormonilor în creşterea şi dezvoltarea plantelor, Nobecourt, Gautheret şi White au obţinut primele succese reale prin cultivarea in vitro timp de mai multe subculturi a calusului. După al doilea război mondial, culturile in vitro s-au dezvoltat rapid datorită multiplelor domenii de aplicabilitate: înmulţirea industrială a plantelor, genetică, ameliorarea plantelor, inginerie genetică, conservarea resurselor genetice, producţia industrială de substanţe utile. Trebuie adăugat şi rolul avut în dezvoltarea unor studii de anatomie şi fiziologia vegetală, fitopatologie, etc. Stadiul atins în prezent deschide perspective ample în zorii mileniului III în ceea ce priveşte manipularea materialului genetic şi dirijarea proceselor de înmulţire, creştere şi dezvoltare a plantelor în vederea obţinerii unor noi forme productive. Speranţele umanităţii se îndreaptă spre găsirea unor soluţii pe termen lung pentru asigurarea necesarului de hrană pentru o populaţie aflată în creştere rapidă. Aceste soluţii pot fi căutate în multitudinea de posibilităţi pe care biotehnologiile in vitro le au în ceea ce priveşte valorificarea superioară a resurselor genetice şi modelarea
12
acestora în folosul omului. Pe lângă obiectivul creşterii productivităţii ecosistemelor agricole, se urmăreşte obţinerea unor plante de cultură care să poată valorifica zonele neproductive, deşertice, sărăturate, etc. În acelaşi timp se are în vedere extinderea şi perfecţionarea tehnologiilor de obţinere a unor noi produse de biosinteză, cu aplicabilitate
în industria alimentară,
farmaceutică, în industria coloranţilor, zootehnie. Cineva spunea parafrazându-l pe Malraux, că: ”Secolul XXI va fi un secol al biotehnologiei sau nu va fi deloc”. În tabelul 1.1. sunt prezentate cele mai importante etape din evoluţia biotehnologiilor vegetale. Tabelul 1.1. Anul 0 1838
Istoricul culturilor vegetale in vitro Ipoteze, teorii, încercări, realizări 1 Teoria totipotenţei celulare
Autorii 2 Schleiden şi Schwan
1892
Plantele sintetizează substanţe care sunt distribuite polar
Sachs
1902
Primele încercări de culturi de ţesuturi vegetale
Haberlandt
1904
Prima încercare de embriocultură la crucifere
Hönnig
1909
Prima fuziune de protoplaşti nereuşită
Kuster
1922
Germinarea seminţelor de orhidee in vitro în absenţa
Kundson
simbionţilor 1922
Cultura in vitro a apexurilor de rădăcină
Robbins
1925
Embriocultura aplicată în încrucişările interspecifice la
Laibach
Linum 1929
Folosirea embrioculturii pentru înlăturarea
Laibach
incompatibilităţii la încrucişare 1934
Primele încercări nereuşite de cultivare a ţesutului
Gautheret
cambial la arbori şi arbuşti 1934
Cultivarea in vitro a rădăcinilor de tomate
White
1936
Embriocultura la diferite gimnosperme
La Rue
13
0 1939 1940
1 Creşterea timp de mai multe subculturi a calusului
Continuare tabelul 1.1. 2 Nobecourt,
obţinut din ţesuturi vegetale
Gautheret, White
Cultivarea ţesutului cambial de Ulmus şi studierea
Gautheret
formării lăstarilor adventivi 1941
Folosirea pentru prima dată a laptelui de cocos pentru
Van Overbeek
cultivarea embrionilor de Datura 1944
Prima cultură de Nicotiana tabacum pentru studierea
Skoog
formării de lăstari adventivi (organogeneza directă) 1945
Cultura unor specii de Asparagus in vitro
Loo
1946
Obţinerea primelor plante de Lupinus şi Tropaeolum
Ball
1948
Organogeneza directă de lăstari şi rădăcini la tutun sub
Skoog şi Tsui
influenţa raportului auxină/adenină 1950
Regenerarea unor organe din calus la Sequoia
Ball
sempervirens 1952
Obţinerea de plante de Dhalia devirozate prin culturi de
Morel şi Martin
meristeme 1952
Realizarea primelor microaltoiri
Morel şi Martin
1953
Obţinerea calusului haploid la Gingko biloba din polen
Tulecke
1954
Obţinerea unei plante întregi dintr-o singură celulă
Muir şi colab.
1955
Descoperirea chinetinei
Miller şi colab.
1956
Realizarea primelor culturi celulare în suspensie pentru
Tulecke şi Nickell
obţinerea de produşi secundari 1957
Descoperirea influenţei raportului citochinine/auxine
Skoog şi Miller
asupra proceselor de organogeneză 1958 1958
Regenerarea in vitro a unor embrioni somatici din nucelă
Maheshwari şi
la Citrus
Rangaswamy
Regenerarea de pro-embrioni din calus şi suspensii
Reinert şi Steward
celulare la Daucus carota 1959
Publicarea primei cărţi privind cultura de celule şi
Gautheret
ţesuturi vegetale 1960
Prima polenizare in vitro la Papaver rhoeas
14
Kanta
0 1960
1 Degradarea pereţilor celulari pentru obţinerea
Continuare tabelul 1.1. 2 Cocking
protoplaştilor 1960
Înmulţirea vegetativă a orhideelor prin culturi de
Morel
meristeme 1962
Formularea şi publicarea reţetei mediului de cultură
Murashige & Skoog
Murashige & Skoog 1964
Obţinerea primei plante haploide din grăunciori de polen
Guha şi Maheswari
la Datura 1964
Regenerarea de lăstari şi rădăcini din calus de Populus
Mathes
tremuloides 1965
Inducerea înfloririi în ţesutul de tutun cultivat in vitro
Aghion-Prot
1967
Inducţia florală la Lunaria annua prin vernalizare in vitro
Pierik
1969
Obţinerea plantelor haploide de tutun din grăunciori de
Bourgin şi Nitsch
polen 1969
Prima izolare reuşită de protoplaşti din suspensii celulare
Eriksson şi Jonassen
la Hapopappus gracilis 1970
Selecţia de mutanţi obţinuţi cu agenţi chimici in vitro
Carlson
1970
Obţinerea haploizilor la ovăz prin embriocultură
Kasha şi Kao
1970
Realizarea cu succes a fuziunii de protoplaşti
Power şi colab.
1971
Regenerarea primei plante din protoplaşti
Takebe şi colab.
1972
Realizarea hibridării interspecifice prin fuziunea de
Carlson şi colab.
protoplaşti la două specii de Nicotiana 1973
Folosirea citochininelor pentru întreruperea dormansului
Pierik şi colab.
la explante de capitul la Gerbera 1974
Inducerea lăstăririi axilare prin folosirea citochininelor în
Murashige şi colab.
cultura de apexuri la Gerbera 1974
Regenerarea de haploizi din protoplaşti la Petunia
Binding
hybrida 1974
Obţinerea de hibrizi prin fuziunea protoplaştilor haploizi
Melchers şi Labib
1974
Transformarea genetică în cultura de ţesuturi vegetale
Reinhard
15
0 1974 1975
1 Descoperirea rolului plasmei Ti în formarea tumorilor la
Continuare tabelul 1.1. 2 Zaenen şi colab.
Agrobacterium tumefaciens
Larebeke şi colab.
Selecţia pozitivă în culturi de calus rezistente la
Gengenbach şi Green
Helminthosporium maydis 1976
Iniţierea culturilor din apexuri de lăstari crioconservaţi
Seibert
la garoafă 1976
Hibridarea somatică interspecifică prin fuziunea de
Power şi colab.
protoplaşti între Petunia hybrida şi Petunia parodii 1977
Integrarea plasmidei Ti de la Agrobacterium
Chilton şi colab.
tumefaciens în genomul plantelor 1978
Hibridarea somatică între tomate şi cartof
Melchers şi colab.
1979
Folosirea co-cultivării pentru transformarea genetică a
Marton şi colab.
protoplaştilor vegetali cu Agrobacterium tumefaciens 1981
Introducerea termenului de variaţie somaclonală
Larkin şi Scowcroft
1982
Introducerea de ADN pur în protoplaşti. Transformarea
Krens şi colab.
cu ADN izolat devine posibilă 1982
Fuziune de protoplaşti prin electrostimulare
Zimmermann
1983
Hibridarea citoplasmatică intergenerică între ridiche şi
Pelletier şi colab.
rapiţă 1984
Transformarea celulelor vegetale cu plasmida ADN
Paszkowski şi colab.
1985
Infecţia şi transformarea discurilor foliare cu
Horsch şi colab.
Agrobacterium tumefaciens şi regenerarea de plante transformate După
Începe Era Organismelor Modificate Genetic
1985
(OMG)
16
Capitolul 2 Laboratorul de culturi in vitro 2.1. Generalităţi Activitatea în domeniul culturilor in vitro se desfăşoară în laboratoare cu structură şi dotare specifică. Mărimea acestor laboratoare variază de la câţiva zeci de metri pătraţi, în cazul structurilor cu finalitate didactică sau de cercetare, până la suprafeţe de mii de metri pătraţi în cazul complexelor industriale de microînmulţire (foto 2.1.).
Foto 2.1. Complexul industrial de microînmulţire Vitroplant, Cesena, Italia Dotarea laboratoarelor diferă în funcţie de volumul de material biologic care este inoculat şi crescut in vitro. Diferenţele se referă în primul rând la capacitatea unei anumite structuri din dotare şi nu la funcţiile acesteia. Una din condiţiile esenţiale ale realizării unui laborator este asigurarea curăţeniei impecabile. Acest lucru nu se referă doar la pardoseli şi pereţi, dar şi la aer. Acesta trebuie să fie lipsit pe cât posibil de particule de praf şi bine-nţeles de spori de ciuperci sau particule bacteriene care pot constitui surse de infecţie.
17
Pentru realizarea unei “curăţiri” a aerului se recomandă folosirea unor instalaţii de condiţionare prevăzute cu filtre de aer eficiente (ex. filtru HEPA). O soluţie alternativă ar fi folosirea unor instalaţii de condiţionare a aerului cu presiune pozitivă care sunt însă ceva mai costisitoare. O altă grupă de facilităţi se referă la controlul temperaturii în laborator. Acest lucru se realizează, pentru spaţiile comune, prin folosirea instalaţiilor de încălzire controlată cu diferite tipuri de agent termic. O atenţie deosebită se va acorda însă dirijării temperaturii în camerele de creştere, în camerele de aclimatizare şi în seră. Sistemele care se vor folosi vor fi prevăzute cu senzori şi sisteme de alarmare în caz de avarie pentru o reducere la minimum posibil riscul pierderilor. Laboratoarele industriale trebuie prevăzute şi cu grupuri electrogene care să facă faţă rapid penelor de curent. Nu vor lipsi în orice laborator sistemele de dublă protecţie, senzori de gaz, senzori de temperatură (pentru depistarea incendiilor) şi sistemele de alarmare corespunzătoare, lămpi de avarie, hidranţi, extinctoare etc. Laboratoarele vor fi dotate cu truse de prim ajutor şi cu instrucţiuni precise privind acordarea acestuia în caz de arsuri, intoxicaţii şi alte accidente posibile. Nu în ultimul rând se vor prevedea sisteme de protecţie antiefracţie şi de protecţie a datelor, informaţiilor şi tehnologiilor folosite. Laboratoarele de tip industrial (figura 2.2.) au suprafeţe de lucru mult mai ample, faţă de laboratoarele de cercetare sau didactice şi bine-nţeles, câteva structuri caracteristice. În toate cazurile suprafaţa unui laborator este împărţită în două zone: - zona nesterilă; - zona sterilă.
18
camere
aclimatizare
cameră transfer " în vivo"
cameră repaos
sală de şedinţă cameră medii
autoclave spălător
seră
cameră sterilă
cameră culturi
magazie cameră rece laborator biochimie virusologie microscopie birou
cameră ambalare
birou
birou
rampă livrare
Figura 2.2. Structura unui laborator industrial de microînmulţire (modificat după Gamborg, 1995) 2.2. Zona nesterilă Zona nesterilă este reprezentată de totalitatea spaţiilor în care asepsia nu este obligatorie. Această zonă este împărţită în mai multe încăperi care vor fi prezentate în continuare. 2.2.1. Camera de păstrare şi pregătire a materialului vegetal Pentru pregătirea materialului vegetal în vederea inoculării este nevoie de o încăpere curată, cu pereţi faianţaţi şi pardosiţi cu gresie. Dotările obligatorii se referă la apa curentă, canalizare şi curent electric (220 V, 50 Hz), iar cele opţionale la frigidere, dulapuri, mese, etc. În această încăpere, materialul vegetal iniţial provenit din câmp sau seră, este sortat, curăţat (prin spălare), fasonat, parafinat, eventual sterilizat superficial prin folosirea unor fungicide şi bactericide.
19
În cazul păstrării mai îndelungate a materialului vegetal (bulbi, rizomi, tuberobulbi, tuberculi, sâmburi, seminţe, ramuri etc.) acesta este ambalat corespunzător şi trecut în frigider la 3-4° C. 2.2.2. Magazia de materiale În funcţie de amploarea activităţii desfăşurate în laborator este necesară existenţa, în anumite situaţii, a unei magazii de materiale. În această magazie se va păstra o gamă largă de materiale cum ar fi: sticlăria nouă, folii din aluminiu, din polietilenă, ghivece noi, blocuri de repicat, tifon, vată, ambalaje pentru livrarea materialului vegetal, etichete etc. 2.2.3. Magazia de substanţe chimice Substanţele chimice folosite pentru prepararea mediilor de cultură, pentru sterilizarea materialului vegetal, spaţiilor şi instrumentarului se vor păstra într-o magazie special amenajată în acest scop. O astfel de încăpere este dotată cu: -
rafturi pentru substanţele care se păstrează la temperatura camerei;
-
dulapuri pentru păstrarea substanţelor la întuneric;
-
frigidere şi congelatoare pentru păstrarea unor hormoni, vitamine, soluţii stoc etc.
-
balanţe şi inventar specific: scafe, spatule, vase pentru cântărire etc.
Foarte important este ca fiecare recipient cu substanţe să fie bine închis, corect etichetat şi asigurat împotriva răsturnării, spargerii, deteriorării, etc. Pentru a uşura căutarea unei anumite substanţe se recomandă numerotarea recipienţilor şi anexarea pe uşa fiecărui dulap sau frigider a unui opis cu numerele de identificare şi conţinutul acestora. În acelaşi timp, substanţele puternic toxice, corozive, cancerigene, inflamabile, într-un cuvânt, periculoase, vor fi amplasate separat în locuri marcate corespunzător cu indicatoare de avertizare. Acidul clorhidric concentrat (HCl) şi hidroxidul de amoniu (NH4OH) nu trebuie păstrate în acelaşi loc, datorită riscului formării de NH4Cl toxic, prin combinarea vaporilor de clor şi amoniac.
20
Substanţele higroscopice trebuie păstrate în recipiente ermetic închise şi uneori în esicatore. Pentru a putea fi folosite substanţele păstrate în congelator se vor introduce de asemenea în esicatoare până vor atinge temperatura camerei. Măsura este obligatorie pentru enzime şi alte proteine şi are ca efect eliminarea condensării apei şi reducerea pierderilor de substanţă activă. Pentru cazurile când se lucrează cu substanţe volatile sau care emană gaze iritante sau toxice se recomandă ca în această magazie să existe şi o nişă cu ventilaţie forţată a aerului. 2.2.4. Camera pentru pregătirea mediilor de cultură Pregătirea mediilor de cultură este o operaţie foarte importantă care presupune existenţa unei camere prevăzută cu dotări specifice (Foto 2.3.)
Foto 2.3. Camera pentru prepararea mediilor de cultură la Vitroplant Cesena În ceea ce priveşte dotările şi instalaţiile de bază, trebuie precizat că încăperea trebuie să fie faianţată şi pardosită cu gresie sau materiale uşor lavabile. Mesele, de regulă una aşezată central şi celelalte lângă pereţi, trebuie să fie faianţate şi prevăzute cu minirafturi pentru sticlărie, etc. În cameră vor mai exista dulapuri pentru păstrarea sticlăriei curate.
21
Camera trebuie prevăzută cu instalaţii de apă curentă rece şi caldă (eventual cu un boiler), chiuvete antiacid, canalizare, instalaţie de gaz natural sau butelie, instalaţie de curent electric (220 V, 50 Hz). Toate instalaţiile de mai sus trebuie prevăzute cu sisteme de protecţie, robinete suplimentare, vane, circuite de împământare, tablouri cu siguranţe fuzibile, etc. conform normelor în vigoare. Din inventarul camerei pentru pregătirea mediilor de cultură nu trebuie să lipsească un aparat pentru distilat apă, un deionizator, plite cu agitator magnetic, plite diverse, eventual becuri cu gaze, cuptor de microunde, sisteme de filtrare (Millipore etc.), balanţă analitică cu patru zecimale, balanţă cu două zecimale, mixere, micropipete, pHmetru, distribuitoare de mediu, cronometru de laborator etc. Distribuitoarele de mediu pot fi simple de tipul unor seringi cu limitator gradat, pentru volume de mediu cuprinse între 1 şi 10-15 ml (foto 2.4. şi 2.5.), sau de dimensiuni mai mari de tipul unor cuve încălzite electric prevăzute cu pompe aspiro-respingătoare, pentru volume de mediu cuprinse între 25-200 ml (foto 2.6.).
Foto 2.4. Distribuitor-dozator pentru mediul de cultură (volume reduse)
Foto 2.5. Seringă pentru repartizarea mediului de cultură 22
Foto 2.6. Repartizarea mediului de cultură în vase mari, în flux industrial (Vitroplant) De asemenea, se foloseşte sticlărie specifică; pahare Berzelius, pahare Erlenmayer, baloane cotate, cilindri gradaţi, pipete, biurete, vase pentru apă distilată. După preparare mediul se repartizează în diferite tipuri de recipiente din sticlă sau mase plastice speciale. Pentru volume reduse de mediu se folosesc fie eprubetele, fie vasele Petri. Pentru cantităţi mai mari de mediu se folosesc recipiente din sticlă sau material plastic de forme şi mărimi diferite. Închiderea lor se face folosind diferite materiale şi soluţii tehnice (vezi subcapitolul 4.2.1.). 2.2.5. Camera pentru autoclavarea mediilor de cultură şi presterilizarea materialului vegetal După prepararea mediului de cultură şi repartizarea în vase acesta este trecut în camera de autoclavare. Această încăpere este dotată cu instalaţie de curent electric (recomandabil 380 V), instalaţie de gaz, instalaţie de alimentare cu apă şi autoclave.
23
Autoclavele sunt instalaţii complexe, prevăzute cu instrumente pentru controlul temperaturii şi presiunii, temporizatoare şi dispozitive de siguranţă folosite pentru sterilizare în mediu umed (autoclavare). Parametrii de lucru a unui autoclav sunt în general 121°C, pentru temperatură şi 1,1 atmosfere, pentru presiune. După sursa de energie autoclavele sunt de două feluri: electrice şi cu gaz, iar după tipul constructiv sunt verticale sau orizontale (foto 2.7. şi 2.8.). Volumul util al unui autoclav variază de la câţiva litri până la câteva sute de litri, în funcţie de cantitatea de mediu care se autoclavează în mod uzual.
Foto 2.7. Autoclav orizontal de capacitate redusă
Foto 2.8. Autoclav vertical de capacitate medie
În complexele industriale de microînmulţire se folosesc autoclave orizontale de mare capacitate prevăzute cu două uşi: -
una pentru umplere din camera pentru pregătirea mediului de cultură;
-
una pentru golire din camera pentru păstrarea mediului sau din zona sterilă.
În autoclave, vasele cu mediu se introduc în coşuri speciale sau în pupinele. În anumite situaţii în camera de autoclavare care se află în vecinătatea zonei sterile se face şi o presterilizare a materialului vegetal pregătit pentru inoculare. Presterilizarea se face prin imersarea acestuia în soluţii de fungicide şi/sau bactericide urmând apoi sterilizarea propriu-zisă sub hota cu filtru laminar.
24
2.2.6. Magazia pentru medii de cultură După autoclavare, mediile de cultură trebuie să fie păstrate cel puţin 24 de ore înainte de a fi folosite. Acest lucru se poate face într-o încăpere perfect curată situată în vecinătatea camerei de inoculare. Păstrarea trebuie făcută la întuneric pentru a preveni degradarea compuşilor fotolabili sub influenţa luminii. În acelaşi timp, temperatura de păstrare se recomandă să fie cât mai scăzută (ideal 3-4°C). Unele laboratoare industriale folosesc camere frigorifice special amenajate pentru păstrarea mediului de cultură, dar şi pentru păstrarea vaselor cu explante pentru eşalonarea producţiei de material vegetal în funcţie de cerinţe, comenzi, anotimp, etc. În laboratoarele mici păstrarea vaselor cu mediul de cultură se poate face în dulapuri bine închise în apropierea camerei sterile. Păstrarea mediului de cultură nu trebuie făcută pe o perioadă mai mare de 14 zile întru-cât creşte riscul deteriorării caracteristicilor acestuia. 2.2.7. Camera de creştere După inocularea explantelor pe mediul de cultură vasele sunt trecute în camera de creştere. Ca şi celelalte încăperi ale laboratorului, aceasta trebuie să fie perfect curată, faianţată şi să fie totodată dotată cu instalaţii specifice (Foto 2.9.).
Foto 2.9. Una din camerele de culturi ale firmei Vitroplant Cesena, Italia
25
Întreaga cameră este ocupată cu rafturi pe care se aşează vasele de cultură. Distanţa dintre două poliţe pe verticală este de minimum 40-50 cm, iar înălţimea totală în jur de 2 m. Lăţimea unei poliţe este de 1-2 m. Poliţele se realizează din materiale care să permită circulaţia aerului printre vase evitându-se astfel supraîncălzirea mediului de cultură. Pentru aşezarea eprubetelor pe rafturi se folosesc suporţi, de regulă înclinaţi, care permit o mai bună iluminare a explantelor. Un alt element important în camera de creştere este reprezentat de instalaţia de iluminat. Realizată în general din tuburi fluorescente distanţate la 15-20 cm unele de altele, această instalaţie trebuie să aibă nişte caracteristici tehnice bine stabilite. Astfel, intensitatea luminoasă trebuie să fie de 3000-4000 de lucşi. Se cunosc situaţii când se recurge la intensităţi mai reduse sau chiar la lipsa totală a luminii: - timp de 3-4 zile după inocularea meristemelor pentru reducerea oxidărilor; - în anumite culturi de calus; - în embriogeneza somatică la conifere; - în faza de inducţie înaintea fazei de organogeneză directă din limb foliar; Frecvent este nevoie de lumină diferit colorată pentru obţinerea unor rezultate mai bune la diverse tipuri de culturi. Interesează apoi lungimea ciclurilor lumină-întuneric. De regulă durata “zilei” este stabilită la 6-12 ore, restul până la 24 fiind ocupate de întuneric. Rezultatele obţinute de Teodorescu Al. şi colab. (1994, 1995) la ICPP Piteşti-Mărăcineni au dovedit că prin reducerea lungimii ciclurilor de lumină se realizează importante economii de energie. Pe baza rezultatelor obţinute, autorii recomandă reducerea duratei de iluminare cu 4-6 ore pe zi, respectiv realizarea unui fotoperiodism de 12-10 ore. Un alt parametru care trebuie controlat este nivelul temperaturii în camera de creştere. În general, temperatura folosită este 22-24°C±1°C, Trebuie precizat că în funcţie de specie, tipul de cultură şi scopul urmărit temperatura poate să varieze între 10 şi 32°C. În general, speciile provenite din zonele calde cresc bine la temperaturi mai ridicate (2628°C). Umiditatea este un alt factor esenţial. Valoarea optimă a umidităţii aerului în camere de creştere este de 80-85%, Scăderea umidităţii sub această valoare duce la deshidratarea rapidă a mediului de cultură cu consecinţe grave asupra explantelor.
26
Controlul factorilor de mediu în camera de creştere trebuie să fie făcut riguros, acest lucru influenţând direct mersul culturilor. Pentru a urmări evoluţia temperaturii şi umidităţii în camerele de creştere acestea sunt prevăzute cu termohigrometre. Orice avarie trebuie semnalată imediat prin intermediul unor sisteme de avertizare luminoase şi sonore. 2.2.8. Camera (spaţiile) de aclimatizare Aclimatizarea este etapa cea mai dificilă în desfăşurarea procesului de microînmulţire. Pentru reuşita acestei operaţii trebuie să se dispună de spaţii prevăzute cu instalaţii eficiente de iluminare, încălzire şi umidificare a aerului. În mod frecvent, în complexele industriale, aclimatizarea se face în solarii sau sere speciale (Foto 2.10.).
Foto 2.10. Sera cu dubla protecţie, folosită la aclimatizarea materialului microînmulţit (Vitroplant) Cu cât controlul factorilor de mediu este mai bun, cu atât se reduc riscurile pierderii de material în procesul aclimatizării. Dirijarea factorilor de mediu pe parcursul fazei de aclimatizare este prezentată în subcapitolul 5.2.5.
27
2.2.9. Sera şi solariile Materialul aclimatizat este trecut apoi în solarii sau sere pentru a-şi desfăşura primele faze de creştere înainte de livrare sau înainte de a fi folosit în câmp. Acest proces, numit fortificare, are loc în structuri prevăzute cu sisteme de control al factorilor de vegetaţie, în special umiditate şi temperatură (foto 2.11. şi 2.12.). Mărimea suprafeţelor ocupate cu sere şi solarii depinde de cantitatea de material înmulţit.
Foto 2.11. Seră folosită pentru fortificarea materialului aclimatizat (Vitroplant)
Foto 2.11. Viţă de vie în container fortificată într-un solar (Vitroplant)
28
O soluţie economică de realizare a unei sere de dimensiuni mai reduse este amplasarea acestei pe partea de sud a construcţiei care găzduieşte laboratorul. Acoperişul se poate construi cu o singură pantă, unul din pereţi fiind reprezentaţi de peretele clădirii (figura 2.2.). 2.2.10. Spălătorul Spălătorul este o încăpere prezentă în orice fel de laborator de microînmulţire. Aşa cum spuneam mai devreme de gardul de curăţenie depinde în bună măsură sănătatea culturilor şi bunul mers al activităţii. În spaţiul reprezentat de spălător se curăţă sticlăria şi celelalte componente ale instrumentarului folosit pentru realizarea culturilor in vitro. Încăperea trebuie să fie faianţată şi prevăzută cu instalaţii specifice de alimentare cu apă, canalizare, alimentare cu curent electric şi eventual gaze. În spălător trebuie să existe mai multe chiuvete (unele cu scurgător) alimentate cu apă caldă sau rece. În lipsa unei instalaţii de apă caldă aceasta se poate obţine cu ajutorul unui boiler electric sau cu gaze (tip Vaillant). Pentru spălarea sticlăriei mai sunt necesare vase din plastic de diferite dimensiuni, perii şi detergenţi. Din spălător sunt nelipsite scurgătoarele de tot felul pentru vase mari, pentru vase de cultură, pentru eprubete. Vor fi prezente şi recipiente cu amestec cromic folosit la spălarea sticlăriei (atenţie, este puternic toxic şi coroziv, vezi subcapitolul 4.2.) şi recipiente cu apă distilată folosită la clătire. În laboratoarele de mari dimensiuni se folosesc perii electrice pentru uşurarea spălării, sau chiar maşini şi instalaţii pentru spălat care efectuează toate operaţiile de spălare, clătire şi uscare a sticlăriei. După înlăturarea mediului de cultură din vase acestea se spală superficial în curent de apă fierbinte şi se trec apoi într-un vas cu apă caldă cu detergenţi. În cazul vaselor contaminate este obligatoriu ca acestea să fie autoclavate înainte de a fi deschise pentru a se evita răspândirea infecţiei în laborator. Vasele folosite pentru topirea mediului sau pentru distribuirea mediului cu agar vor fi spălate imediat cu apă fierbinte pentru a se evita răcirea agarului şi fixarea pe pereţii acestuia.
29
Tehnologia modernă presupune şi existenţa unor maşini de spălat cu ultrasunete, extrem de eficiente (foto 2.12.).
Foto 2.12. Maşină de spălat cu ultrasunete După spălarea propriu-zisă, sticlăria se clăteşte în apă curentă şi este trecută întrun alt vas cu apă distilată unde va fi lăsată timp de mai mult ore. Urmează apoi zvântarea pe scurgătoare şi depozitarea în dulapuri speciale destinate acestui scop, până în momentul folosirii. Mediul de cultură şi celelalte resturi se vor colecta în pungi din plastic care se vor lega şi duce în spaţii de colectare a gunoiului. Pentru laboratoarele mici uneori spălătorul face parte integrată din camera de pregătire a mediului de cultură În aceleaşi situaţii, în spălător se poate face şi pregătirea materialului vegetal pentru inoculare. Este vorba, în special de operaţiile de spălare, presterilizare şi eventual fasonare a materialului. În ceea ce priveşte organizarea activităţii de spălare a sticlăriei şi instrumentarului în laborator trebuie precizat că în micile laboratoare nu există personal angajat special pentru acest scop. De aceea trebuie instituită regula potrivit căreia fiecare din cei care lucrează în laborator trebuie să lase în urma sa aşa cum a găsit, adică curat. Fiecare îşi va spăla sticlăria folosită, o va depozita în locurile special destinate, în ordine şi va curăţa spălătorul la terminarea activităţii.
30
Tot în ansamblul de reguli după care trebuie organizată activitatea în laboratoarele didactice şi de cercetare se înscrie şi planificarea acţiunilor pe zile şi persoane, realizânduse astfel un flux continuu fără suprapuneri sau goluri. 2.3. Zona sterilă "Inima" laboratorul de culturi in vitro este reprezentată de camera sterilă. În acest spaţiu se execută toate operaţiile de sterilizare, inoculare şi transferuri pe mediul de cultură în condiţii sterile. Camera sterilă trebuie să fie ferită de orice sursă de praf şi murdărie. În acest sens ferestrele vor fi prevăzute cu un sistem de filtrare iar dacă este posibil încăperea va avea la intrare o cameră tampon. Laboratoarele mai sofisticate au instalaţii de climatizare cu presiune pozitivă de aer steril care împiedică pătrunderea prafului, sporilor sau altor forme ale agenţilor patogeni din exterior. În trecut sterilizarea spaţiului interior se realiza cu ajutorul unor lămpi cu ultraviolete. Era apoi obligatorie aerisirea încăperii pentru eliminarea ozonului care se formează. Cu această ocazie era posibil ca în încăpere să pătrundă din nou spori de ciuperci, bacterii şi alte microorganisme, iar operaţia era ineficientă. În plus, ozonul este toxic şi puternic mutagen şi creşte astfel riscurile expunerii personalului la accidente. Componenta de bază a camerei sterile este hota (nişa) sterilă. Folosind un sistem de filtrare complex hota creează, într-un spaţiu închis, un flux de aer steril care se deplasează cu o anumită viteză spre operator. Există mai multe tipuri constructive de hote care funcţionează pe acelaşi principiu: împingerea cu ajutorul unor ventilatoare a aerului printr-o baterie de filtre, reţinerea particulelor de praf şi a microorganismelor şi formarea unui flux de aer steril care iese din incinta sterilă, "împiedicând în acelaşi timp pătrunderea aerului nesteril din exterior. Cele mai folosite hote sterile sunt hotele cu flux laminar orizontal. Ele pot avea un post de lucru, două sau mai multe (foto 2.13.)
31
Foto 2.13. Hota sterilă cu flux laminar orizontal Pentru lucrări în care se folosesc agenţi patogeni sau transformări cu Agrobacterium tumefaciens se recomandă să se folosească hote sterile cu flux vertical care împiedică răspândirea acestor microorganisme în exterior (foto 2.14.).
Foto 2.14. Hota sterilă cu flux vertical În general, o hotă este alcătuită dintr-o baterie de ventilatoare în partea din spate, prefiltre care reţin particulele de praf mai grosiere şi bateria de filtre bacteriologice care reţine particule mai mari de 0,2 µm. În partea din faţă hota prezintă o minicameră cu un perete liber alcătuit dintr-o masă de lucru, acoperită cu tablă din inox, doi pereţi laterali transparenţi şi un sistem de iluminare cu tuburi din neon în partea de sus. Hotele de construcţie mai veche erau prevăzute şi cu lămpi de U.V. folosite pentru sterilizare. 32
În acelaşi timp hota prezintă una sau mai multe prize electrice pentru a asigura sursa de curent pentru microscoape, lupe binocular, minibalanţe, incineratoare (BactiCinerator) sau sterilizatoare electrice pentru instrumentar (foto 2.15.).
Foto 2.15. Hotă modernă pentru lucrări de cercetare (Vitroplant) Acolo unde există instalaţie cu gaz la hotă se ataşează 1-2 becuri Münsen cu gaz pentru flambarea instrumentarului (foto 2.16.). Hota mai este dotată cu întrerupătoare precum şi eventual cu un regulator de turaţie a ventilatorului care modifică viteza fluxului de aer. În timpul lucrului în hotă se vor găsi de asemenea, suporţi pentru instrumentar steril, (ace, spatule, pense, bisturie etc.), un pulverizator cu alcool pentru dezinfecţia exteriorului vaselor de cultură, a masei şi a mâinilor operatorului precum şi materiale pentru închiderea vaselor de cultură (folie de aluminiu, folie autosigilantă, etc.).
Foto 2.16. Dotare minimală într-o hotă cu flux laminar steril 33
În camera sterilă trebuie să mai existe scaune (eventual rotative, ergonomice, etc.) măsuţe pentru depunerea vaselor cu medii, a vaselor folosite la sterilizarea materialului, a sticlelor cu agenţi sterilizanţi şi apă, a materialului vegetal pregătit pentru sterilizare). Foarte practice sunt măsuţele multietajate cu rotile care se pot deplasa uşor dintr-un loc în altul (foto 2.17). Foarte importante sunt lucrările de întreţinere a hotei. Acestea constau în primul rând în curăţirea prefiltrelor cu ajutorul unor aspiratoare. Cele mai eficiente sunt cele care funcţionează fără sac de praf, cu colectarea impurităţilor în apă (tip Rainbow). În cazul folosirii intense, bateria de filtre trebuie schimbată anual.
Foto 2.17. Măsuţă multietajată cu rotile În acelaşi timp, se va acorda o atenţie deosebită curăţeniei în camera sterilă. Zilnic se va spăla podeaua cu apă şi detergenţi specifici, se vor şterge pereţii şi în general, se vor înlătura orice surse posibile de praf. La intrarea în camera sterilă se va schimba îmbrăcămintea şi încălţămintea, aceasta din urmă fiind principala sursă de praf şi agenţi contaminanţi. Înainte de începerea lucrului cu cel puţin 20-30 de minute, hota se porneşte pentru a se steriliza interiorul incintei. De asemenea, se pulverizează alcool de 96% pe partea interioară a acesteia şi pe vasele cu medii sau celelalte materiale care se introduc sub hotă.
34
Capitolul 3 Mediile de cultură şi prepararea lor Mediul de cultură reprezintă suportul fizic şi chimic necesar pentru creşterea şi dezvoltarea explantelor in vitro. Graţie unor cercetări minuţioase efectuate de-a lungul timpului un mare număr de cercetători au formulat diferite reţete de medii folosite pentru diferite tipuri de culturi in vitro la marea majoritate a speciilor vegetale. Momentul de răscruce în acest domeniu l-a reprezentat anul 1962, când T. Murashige şi F. Skoog au publicat reţeta de mediu care le poartă numele, realizată iniţial pentru culturi de ţesuturi de tutun. Acest mediu a fost apoi preluat cu succes în nenumărate situaţii, la cele mai diferite specii, fiind în prezent cea mai folosită reţetă de mediu, alături de varianta modificată Linsmaier&Skoog (LS, 1965). Diferenţa dintre cele două reţete constă în nefolosirea acidului nicotinic, piridoxinei, glicinei şi creşterea concentraţiei de tiamină la 0,4 mg/l, în cazul variantei modificate, LS. Alte reţete de medii larg folosite sunt B5 (Gamborg şi colab. 1968), N6 (Chu, 1978), Nitsch&Nitsch (NN, 1969). Pentru cultura in vitro a speciilor pomicole dar şi a altor plante lemnoase se folosesc mediile Quoirin&Lepoivre (QL, 1977), DKW (Driver&Kuniyuki, 1984) şi WPM Lloyd and McCown, 1980). Condiţiile pe care trebuie să le îndeplinească un mediu de cultură sunt: - să corespundă cerinţelor nutritive şi hormonale ale speciei cultivate pentru faza în care se găseşte (stabilizare, proliferare, calogeneză, înrădăcinare, etc.); - să asigure condiţii optime de creştere şi dezvoltare în ceea ce priveşte presiunea osmotică, pH-ul, umiditatea, etc. - să fie echilibrat din punct de vedere ionic; - să nu conţină ioni sau substanţe toxice; - să fie uşor de preparat şi reproductibil; - să fie stabil după autoclavare (să-şi menţină neschimbată compoziţia şi caracteristicile fizico-chimice;
35
- să fie ieftin şi să conţină cât mai puţini constituenţi naturali costisitori şi neomogeni; - eventual, să poată fi reciclat. Mediile folosite la cultura in vitro a explantelor vegetale au în general o structură complexă, fiind alcătuite dintr-un mare număr de constituenţi de natură diversă şi cu rol diferit. Aceşti constituenţi pot să fie grupaţi în: - constituenţi cu rol nutritiv: elemente minerale: macro şi microelemente şi elemente organice: zaharuri (ca sursă de carbon), aminoacizi (ca sursă de azot organic) şi vitamine; - constituenţi cu rol hormonal fitoregulator al creşterii şi dezvoltării explantelor in vitro: auxine, citochinine, gibereline şi alte substanţe cu rol stimulator sau inhibitor: acid abscisic, etilenă, colchicină, paclobutrazol, etc. - constituenţi cu rol în stabilizarea mediului de cultură: apa, agenţi de solidificare, stabilizatori osmotici şi de pH, antioxidanţi şi substanţe absorbante. 3.1. Constituenţi cu rol nutritiv 3.1.1. Constituenţi minerali Substanţele minerale care intră în componenţa mediilor de cultură sunt săruri care conţin cele 6 macroelemente fundamentale: azotul (N), fosforul (P), potasiul (K), calciul (Ca), magneziul (Mg) şi sulful (S) precum şi un mare număr de microelemente: fier (Fe), mangan (Mn), zinc (Zn), aluminiu (Al), bor (B), cupru (Cu), molibden (Mo), sodiu (Na), cobalt (Co) şi iod (I). 3.1.1.1. Macroelementele Concentraţia macroelementelor folosite variază în limite destul de largi, în mod obişnuit, folosindu-se cantităţi de 1-40 mM, respectiv, 300-19.000 mg/l. Microelementele se folosesc în concentraţii mult mai reduse de ordinul micromolilor, respectiv 0,0025-0,5 mg/l. În funcţie de concentraţia molară totală mediile de cultură se împart în trei categorii: - medii concentrate (36-50 mM): Murashige & Skoog, Quoirin & Lepoivre, Eriksson, etc.; - medii cu concentraţie mijlocie (27-35 mM): Nitsch&Nitsch; - medii cu concentraţie scăzută (7-26 mM): White, Heller; 36
Foarte importantă este compoziţia ionică a mediilor de cultură ştiindu-se că în soluţie sărurile disociază în ionii componenţi. Trebuie avut în vedere echilibrul acestor ioni şi posibilitatea de a se combina şi de a forma compuşi toxici greu solubili sau insolubili. În general toate mediile de cultură conţin următorii ioni: NH4+, K+, Ca2+, Mg2+, Na+, NO3-, PO43-, SO42-, Cl-. Prin folosirea preponderentă a sărurilor sub formă de cloruri creşte concentraţia ionului Cl- care nefiind folosit în nutriţie, are efect toxic asupra explantelor determinând clorozarea şi ulterior moartea acestora. Efecte similare are şi excesul de sodiu (Na+) din mediul de cultură. Dintre macroelemente un rol important este jucat de azot. Acesta este furnizat în mediul de cultură prin folosirea azotaţilor de amoniu, potasiu, calciu, sodiu, etc. În soluţie se găseşte atât azot sub formă nitrică (NO3-) cât şi sub formă amoniacală (NH4+). Rolul celor două forme de azot este diferit şi uneori cercetările efectuate au scos în evidenţă rezultate contradictorii. Astfel, într-o primă fază, s.a afirmat că ionul amoniu (NH4+) ar induce formarea embrionilor somatici la morcov spre deosebire de ionul nitrat (NO3-) care nu ar avea acest efect (Halperin şi Wetherell 1967, citaţi de Cachiţă, 1987). Totuşi experienţele lui Reinert şi colab. (1966), au dovedit că este posibilă obţinerea de embrioni din ţesut de morcov pe un mediu care conţinea numai ioni nitrat (NO3-). Important este raportul în care se găsesc cei doi ioni în mediul de cultură. În marea majoritate a reţelelor folosite, raportul NH4+/NO3- este de 1/2-1/3, putând să ajungă la 1/5. Azotul are un rol fiziologic deosebit de important, fiind indispensabil în metabolismul proteic şi glucidic. Lipsa azotului sau carenţa acestuia determină acumularea antocianilor în vacuole şi moartea rapidă a celulelor. La salată, absenţa azotatului de amoniu din mediul de cultură a determinat formarea calusului din cotiledoane fără a se obţine nici un fel de tip de regenerare. Fosforul are şi el un rol important în metabolismul general al explantelor prin formarea compuşilor nucleotizi cu valoare energetică ridicată (ADP şi ATP) care realizează captarea, păstrarea şi eliberarea energiei chimice şi care sunt determinanţi în biosinteza acizilor nucleici (Neamţiu şi colab. 1989).
37
După azot, cea mai mare pondere o deţine potasiul (K). Acesta s-a dovedit a fi de neînlocuit datorită rolului pe care-l are în reglarea permeabilităţii membranei celulare şi a vâscozităţii protoplasmei. Este deosebit de activ în cadrul schimburilor de ioni la nivelul membranelor celulare şi este cerut în cantităţi mai mari de către explantele tinere la nivelul cărora determină activarea diviziunii celulare. Carenţa potasiului se concretizează prin reducerea creşterii sau chiar involuţia explantelor de tutun. La aceeaşi specie şi la viţa de vie, cultivarea pe medii bogate în potasiu a avut ca efect stimularea creşterii explantelor (Heller 1947-1953, citat de Cachiţă, 1987). Calciul este prezent în majoritatea mediilor de cultură sub formă de clorură de calciu (CaCl2 .2H2O) sau azotatul de calciu (Ca(NO3)2 . 4H2O). Alături de potasiu, calciul are un rol important în reglarea permeabilităţii membranelor la nivel celular. Este cunoscut, de asemenea şi rolul antitoxic al calciului. Având în vedere faptul că este solicitat în cantităţi mai mari în metabolismul ţesuturilor senescente datorită acumulării în membrane, la culturile meristematice in vitro nevoile de calciu sunt mult mai reduse. Totuşi carenţa calciului determină necrozarea apexurilor la lăstarii cultivaţi in vitro iar lipsa lui duce la moartea celulelor. Mărirea concentraţiei de calciu din mediu prin adăugarea clorurii de calciu (CaCl2) trebuie făcută cu discernământ pentru că peste anumite limite se manifestă toxicitatea ionilor de clor (Cl-). La cultivarea gutuiului pe un mediu Quiorin & Lepoivre (1977) bogat în calciu apar uneori simptome de cloroză datorită blocării fierului (Stănică, 1996). Magneziul intră în compoziţia clorofilei şi carenţa sa determină perturbări importante în funcţionarea frunzei, ducând în final la moartea explantului. Relaţia Ca-Mg este foarte strânsă, cele două macroelemente putându-se chiar substitui în anumite reacţii metabolice. Sulful intră în compoziţia multor aminoacizi esenţiali şi este nelipsit din mediile de cultură unde se află în componenţa ionului sulfat (SO42-). Reducerea conţinutului de clor din mediul de cultură prin înlocuirea clorurilor cu sulfaţi are ca efect o creştere a concentraţiei sulfului.
38
Anumite medii de cultură sunt foarte bogate în sulf: DKW pentru nuc (Driver şi Kuniyuki, 1984), Litvay pentru conifere (Litvay şi Johnson, 1981). 3.1.1.2. Microelementele Microelementele folosite în culturile in vitro sunt în număr mai redus faţă de cele folosite în soluţiile nutritive complexe iar concentraţiile uzuale sunt asemănătoare pentru majoritatea mediilor de cultură. Dintre microelemente, fierul se administrează în cantităţi mai mari. Pentru a fi uşor asimilabil se foloseşte chelatul de fier (NaFeEDTA) care se pregăteşte din sulfat feros (FeSO4 . 7H2O) şi sare disodică a acidului etilen- diamino-tetraacetic (Na2EDTA . 2H2O). Raportul dintre cei doi compuşi trebuie să fie de 1:2 adică, pentru 100 µM FeSO4 . 7H2O, trebuie să se dizolve 200 µM de Na2EDTA.2H2O. Concentraţia uzuală a ionului Fe2+ este în jur 100 µeq. Excesul de fier bivalent (Fe2+) determină oxidarea acestuia la fier trivalent (Fe3+) şi formarea de fosfat feric care precipită şi creşte turbiditatea mediului de cultură. Fierul este catalizatorul multor procese redox şi are rol esenţial în fotosinteză, în activitatea citocromilor respiratori şi în sinteza proteică. Carenţa fierului se manifestă prin clorozarea ţesuturilor verzi şi blocarea diviziunilor celulare în ţesuturile meristematice. Manganul participă la o serie de activităţi enzimatice iar la conifere s-a dovedit că poate înlocui într-o anumită proporţie, magneziul (Clarkson şi colab., 1980, citat de Enescu V. şi colab. 1994). Are de asemenea un rol important în sinteza proteică. Carenţa manganului determină blocarea sintezei ARN-ului în rădăcinile de mazăre. Zincul este implicat în sinteza auxinei, a ARN-polimerazei şi a unor dehidrogenaze. Lipsa acestuia determină dereglări în sinteza triptofanului (precursor al auxinei endogene), îngălbenirea şi necroza ţesuturilor tinere. Aluminiul folosit numai în anumite medii de cultură (Heller) în cantităţi foarte mici are rol de catalizator al unor reacţii biochimice. Borul este utilizat sub formă de acid boric (H3BO3) în concentraţii relativ ridicate (1-10 mg/l). Rolul său preponderent se referă la reglarea proceselor de diviziune celulară şi creştere. Carenţa de bor se manifestă prin brunificarea şi necrozarea ţesuturilor.
39
Cuprul participă la multe reacţii redox şi este foarte important în embriogeneză. Se foloseşte sub formă de sulfat de cupru (CuSO4 . 5 H2O) în concentraţii de 0,025 mg/l (0,1 mM). Molibdenul se pare că are un rol important în activitatea nitrat-reductazei. Alături de iod intră în componenţa unor enzime şi participă la procesele nutriţionale ale explantelor. Cobaltul este folosit în concentraţii foarte scăzute sub formă de clorură de cobalt (CoCl2 . 6H2O). Rolul său în metabolismul ţesuturilor vegetale in vitro este necunoscut, ca de altfel cel al nichelului. 3.1.2. Constituenţi organici 3.1.2.1. Carbohidraţii Carbohidraţii (zaharurile) sunt folosite în culturile in vitro ca sursă de carbon şi energie, dat fiind faptul că explantele cultivate în astfel de condiţii au o nutriţie preponderent heterotrofă. Prin hidrolizarea carbohidraţilor celulele vegetale îşi procură cantitatea de energie necesară desfăşurării proceselor vitale. Trebuie spus că glucidele produse prin fotosinteză in vitro de către ţesuturile verzi nu satisfac nici pe departe nevoile energetice globale ale acestora şi nevoia de componenţi structurali cum ar fi unele polizaharide (celuloza şi amidonul). Dintre zaharuri cel mai mult folosită este zaharoza în concentraţie de 2-3%. La unele specii (Malus robusta) s-a folosit cu rezultate bune sorbitolul, în timp ce glucoza a fost folosită tot la specii lemnoase în concentraţie de 3%. În diferite experimente s-au folosit şi alte glucide cum ar fi: fructoza, maltoza, rafinoza sau chiar dextrina şi amidonul. În cantităţi crescânde de la 1% la 3%, zaharoza a stimulat creşterea explantelor de morcov (Gautheret, 1959), iar reducerea concentraţiei la 2-3%, a determinat alungirea lăstarilor la pin, molid şi larice (Aitken, J. şi colab. 1981, citaţi de Enescu V. şi colab. 1994). Trebuie precizat şi rolul important pe care îl au carbohidraţii în echilibrarea presiunii osmotice a mediului de cultură. Creşterea concentraţiei de zaharoză peste anumite limite are ca efect creşterea presiunii osmotice şi plasmolizarea celulelor explantelor.
40
O serie de cercetători au pus problema faptului că mediile de cultură artificiale prin concentraţia ridicată de carbohidraţi exercită o presiune osmotică "nenaturală" asupra explantelor. De aici necesitatea unor studii privind posibilităţile de reducere a cantităţilor de carbohidraţi din mediile de cultură precum şi găsirea altor substanţe cu rol similar (ESNA WG4, Buşteni, 1996). 3.1.2.2. Aminoacizii Aminoacizii sunt folosiţi în mediile de cultură şi ca surse suplimentare de azot organic. Pe lângă aceasta s-a dovedit că ei au rol în diferite procese inductive. Dintre aminoacizi, glicina este cel mai des folosită. Încă din 1939, White a subliniat că glicina stimulează creşterea rădăcinilor de tomate (Cachiţă, 1987). Gautheret (1959), de asemenea, subliniază rolul aminoacizilor în formarea calusului. Alţi aminoacizi ca glutamina, arginina şi prolina stimulează proliferarea calusului la pin (David H. şi colab. 1984). S-a constatat că în cazul folosirii aminoacizilor, izomerii levogiri (L) sunt mai eficienţi decât cei dextrogiri (D). Dozele de folosire a aminoacizilor variază de la 2 mg/l pentru glicină, la 10 mg/l pentru L-arginină şi cisteină şi până la 100 mg/l pentru asparagină şi L-tirozină. 3.1.2.3. Vitaminele Vitaminele sunt substanţe organice cu rol catalitic indispensabile creşterii şi dezvoltării explantelor in vitro. Termenul de vitamină - amină vitală, a fost introdus pentru prima dată de către Casimir Funk în 1911 şi ilustrează plastic importanţa deosebită pe care acest grup de substanţe o are pentru organismele vii. Spre deosebire de plantele din natură, ţesuturile şi organele cultivate in vitro nu au capacitatea de a-şi sintetiza întreaga gamă de vitamine necesare desfăşurării în bune condiţiuni a metabolismului. La începuturile culturilor in vitro s-a constat că prin adăugarea în mediul de cultură a unor substanţe naturale bogate în vitamine (lapte de cocos, sucuri de tomate şi banane, extract de endosperm de cereale, lapte de porumb, extracte de drojdie)are loc stimularea creşterii explantelor.
41
Ulterior o serie de cercetători au realizat reţete proprii de vitamine prin combinarea în diferite proporţii a vitaminelor cunoscute. Trebuie precizat că majoritatea vitaminelor folosite sunt termosolubile iar prin autoclavare are loc descompunerea acestora. Uneori produşii rezultaţi au la rândul lor un efect favorabil asupra culturilor (Hoza D., 1996). Ideal ar fi ca amestecurile de vitamine să se poate adăuga după autoclavarea mediului folosind filtrarea sterilă. Pentru mediile solide acest lucru este însă neaplicabil, fiind greu să se obţină difuzia vitaminelor în masa mediului. Principalele vitamine folosite la prepararea mediilor de cultură sunt folosite solitare sau, mai frecvent, în combinaţii mai mult sau mai puţin complexe. Tiamina (vitamina B1, aneurina) este nelipsită din majoritatea reţetelor de vitamine în concentraţii care variază de la 0,1 mg/l la amestecul de vitamine MS (Murashige&Skoog), la 0,4 mg/l la amestecul Walkey 1 şi 2 până la 5 mg/l la amestecul SH (Shenk şi Hidelbrandt), respectiv 10 mg/l la amestecul B5 (Gamborg). În toate cazurile, agentul solubilizant al tiaminei este acidul clorhidric. Acţiunea fiziologică a tiaminei constă în stimularea creşterilor vegetative şi deci sporirea biomasei produse in vitro. Piridoxina (vitamina B6) este de asemenea prezentă în marea majoritate a mediilor de cultură. Concentraţiile folosite variază în general între 0,1-1 mg/l, folosindu-se şi de această dată, ca agent de dizolvare acidul clorhidric. Se ştie că piridoxina este precursorul unor coenzime importante catalizând reacţii de bază în metabolismul aminoacizilor. Riboflavina (vitamina B2) este folosită doar în amestecurile de vitamine mai complexe (ex. Jacquillot) în concentraţii de 0,1-1,0 mg/l. Este rezistentă la temperaturile ridicate (se descompune la 280°C) şi la oxidanţi dar este sensibilă la radiaţiile U.V. Se pare că acţionează ca inhibitor al creşterii rădăcinilor şi are rol important în metabolismul celular. Acidul pantotenic (vitamina B5) este mai puţin utilizat ca atare. Gautheret (1945) precizează că acidul pantotenic stimulează creşterea calusului la salcie. O serie de cercetători au folosit însă cu succes pantotenatul de calciu în concentraţii de 0,5-2,5 mg/l. Acesta, este stabil termic până la temperaturi de 200°C şi nu este fotolabil.
42
Cobalamina (vitamina B12) este mai rar folosită. În epoca de pionierat a culturilor in vitro Reinert şi White (1956) citaţi de Gautheret (1959) au folosit-o cu bune rezultate la creşterea ţesuturilor tumorale. Vitamina B12 stimulează sinteza nucleoproteidelor. Acidul nicotinic (vitamina B3, niacina) aproape nelipsit din mediile de cultură, este rezistent la temperaturi înalte (punct de topire 234-237°C). Este solubil în apă şi se foloseşte în concentraţii de 0,5-5,0 mg/l. Are rol esenţial în metabolismul intermediar, în reacţiile de oxido-reducere fiind component al dehidrogenazelor (NAD+ şi NADP+). Biotina (vitamina H) este folosită în concentraţii reduse (0,1 mg/l). În soluţii acide sau neutre este stabilă dar se descompune prin încălzire. Are rol de coenzimă intervenind în numeroase procese metabolice. Stimulează creşterea ţesuturilor meristematice şi proliferarea celulelor. Acidul folic, folosit în concentraţii mici (0,01 mg/l în amestecul Jacquiot) are efect stimulator asupra creşterii ţesuturilor la lumină. Acest lucru s-ar datora descompunerii sale în acid para amino-benzoic. La întuneric acidul folic are efect toxic. Acidul para aminobenzoic, întâlnit în câteva amestecuri complexe de vitamine, se foloseşte în concentraţii de 1,0 mg/l. Este coenzima tirozinazei şi stimulează biosinteza acidului pantotenic şi a biotinei. Acidul ascorbic (vitamina C) se foloseşte în concentraţii ridicate
(1,0-100,0
mg/l) de regulă ca agent antioxidant al polifenolilor eliminaţi de anumite specii la cultura in vitro: stejar, măr, dafin (Stănică şi colab. 1994), fistic, etc. Prin autoclavare, vitamina C se distruge în bună parte. Rolul fiziologic al vitaminei C este complex, fiind un activator general al metabolismului celular. Vitamina E (tocoferolul) favorizează reacţiile de fosforilare şi formare a compuşilor macroergici, participând la numeroase sinteze enzimatice. În culturile in vitro, vitamina E măreşte sensibilitatea celulelor la auxine (Enescu V. şi colab., 1994). Inozitolul (mio-inozitol, mezo-inozitol, m-inozitol, hexahidroxi-ciclohexan) este un aditiv esenţial al mediilor de cultură fiind considerat de unii autori, vitamină, iar de către alţii, glucid. Se foloseşte de regulă în concentraţii de 100 mg/l dar se cunosc şi situaţii când a fost folosit în concentraţii de până la 1000 mg/l. Deşi nu se cunoaşte prea bine rolul fiziologic al inozitolului, se pare că acesta ar stimula diviziunea celulară. Folosit în concentraţii mari (250 mg/l) a stimulat creşterea
43
calusului de Fraxinus pensylvanica (Wolter K.E. şi Skoog F. 1966, citaţi de Enescu V şi colab. 1994). Aditivii naturali, folosiţi la început ca substanţe complexe stimulatoare în culturile in vitro (lapte de cocos, malţ, extracte din fructe, drojdie, endosperm, etc.), au fost abandonaţi între timp. Acest lucru se datorează faptului că era imposibil de a se obţine o compoziţie constantă a produselor respective, care să permită repetabilitatea mediilor de cultură. Un alt aditiv natural este cazeina hidrolizată, care nu este altceva decât un complex de aminoacizi, putând fi încadrată în rândul substanţelor folosite ca sursă de azot organic. Este folosită în concentraţii de 250 mg/l. 3.2. Constituenţi cu rol fitoregulator Hormonii vegetali, regulatorii de creştere, stimulatorii sau substanţele de creştere sunt compuşi organici, sintetizaţi de către plante în cantităţi foarte mici. Aceşti compuşi stimulează, inhibă sau modifică creşterea şi dezvoltarea unor organe. La plantele in vitro fitohormonii endogeni produşi de către explante sunt completaţi şi complexaţi cu hormoni exogeni introduşi în mediul de cultură. În funcţie de scopul urmărit se aleg tipurile de hormoni şi concentraţia optimă şi se determină astfel, sensul evoluţiei explantului respectiv, ca rezultantă a acţiunii concertate a acestora. Istoria descoperirii hormonilor de creştere este oarecum paralelă cu cea a culturilor in vitro. Descoperirea hormonilor şi studierea efectului lor asupra creşterii şi dezvoltării plantelor a modificat radical evoluţia cercetărilor in vitro. Primul care a intuit faptul că în plante ar exista substanţe care să controleze metabolismul acestora a fost Charles Darwin. Abia în anul 1931 Kögl şi Haagen-Smit au izolat din urina umană o substanţă pe care au denumit-o “auxina A”. Aceeaşi cercetători şi folosind aceeaşi sursă au purificat apoi (1934) o altă substanţă denumită hetero-auxina, care s-a dovedit a fi de fapt acidul α indolil acetic (AIA). Ulterior, la sfârşitul anilor ‘30, Gautheret, Nobecourt şi White au studiat rolul pe care îl are auxina în creşterea ţesuturilor in vitro. Prima citochinină izolată a fost chinetina (6 furfurilaminopurina) obţinută din spermă de heringi de către Miller şi colab. (1955). Doi ani mai târziu, Skoog şi Miller au
44
publicat date despre efectul raportului citochinină/auxină asupra proceselor de organogeneză. După descoperirea şi izolarea primilor hormoni de creştere s-a trecut la etapa următoare de sinteză a noi compuşi cu structură şi efect fiziologic asemănător. În prezent, se cunosc cinci grupe mari de hormoni de creştere: auxine, citochinine, gibereline, acid abscisic şi etilena. 3.2.1. Auxinele Auxinele sunt, în marea lor majoritate, compuşi naturali sintetizaţi de către plante şi acumulaţi în diferite organe, în concentraţii reduse. Auxinele sunt prezente mai ales în mugurii terminali, frunze tinere şi vârfuri de lăstari. Paralel cu izolarea compuşilor auxinici naturali s-au realizat compuşi de sinteză cu acţiune asemănătoare ca derivaţi ai iodului, naftalenului, acidului fenoxiacetic şi acidului benzoic. Acţiunea auxinelor este deosebit de complexă: - intervin în procesele de diviziune şi elongaţie a celulelor, în concentraţii mici stimulând diviziunea celulară, iar în concentraţii mari, alungirea; - modifică permeabilitatea membranelor celulare modificându-le în acelaşi timp, alte caracteristici fizice şi chimice; - influenţează pozitiv sinteza proteică prin stimularea sintezei ARN-ului ribozomal; - controlează procesele de dominanţă apicală, determinând inhibarea activităţii mugurilor axilari; - stimulează procesele de calusare şi ulterior determină formarea rădăcinilor. - în doze ridicate determină apariţia de hipertrofii (simple deformări) sau hiperplastii (tumori) Principalele auxine folosite în culturile in vitro sunt prezentate în tabelul 3.2.1. Sunt prezentate de asemenea, substanţele folosite pentru dizolvarea şi diluarea acestora, temperaturile de păstrare şi limitele concentraţiilor uzuale.
45
Tabelul 3.2.1. Principalele auxine folosite în culturile in vitro Specificaţie AIA Acid β indolilacetic AIA-L- Acid aspartic AIA-L- Alanină AIA-L- Fenilalanină AIA-L- Glicină IBA Acid indolilbutiric K-IBA Acid indolilbutiric, sare de K ANA Acid α naftilacetic 4-CPA Acid 4 clorfenoxiacetic Dicamba Acid 2 metoxi3,6-diclorbenzoic 2,4-D Acid 2,4 diclorfenoxiacetic 2,4,5 T Acid 2,4,5 triclorfenoxiacetic Picloram Acid 4-amino3,5,6-tricloropicolinic
Masă molec. 175,2 290,3 246,3 322,4 232,2 203,2
Solvent
Diluant
etanol NaOH 1N NaOH 0,5N NaOH 0,5N NaOH 0,5N NaOH 0,5N etanol NaOH 1N
Păstrare produs
Păstrare soluţie
Conc. mg/l
0°C
0°C
0,01-3,0
apă apă
0°C
0°C
0,01-5,0
apă
0°C
0°C
0,01-5,0
apă
0°C
0°C
0,01-5,0
apă
0°C
0°C
0,01-5,0
apă
-
-0°C
0,1-10,0
241,3
apă
-
0-5°C
0-5°C
0,1-10,0
186,2
NaOH 1N
apă
temp. cam.
0-5°C
0,1-10,0
186,6
etanol
apă
temp. cam.
0-5°C
0,1-10,0
221,0
etanol/ apă etanol NaOH 1N
apă
0-5°C
0-5°C
0,01-10,0
apă
temp. cam.
0-5°C
0,01-5,0
255,5
etanol
apă
temp. cam.
0-5°C
0,01-5,0
241,5
DMSO*
apă
temp. cam.
0-5°C
0,01-10,0
221,0
* DMSO – dimetilsulfoxid
Aşa cum rezultă din tabelul 3.2.1. solvenţii folosiţi pentru dizolvarea auxinelor sunt etanolul şi hidroxidul de sodiu (NaOH) 0,5-1,0 N. Temperaturile de păstrare a substanţelor şi respectiv a soluţiilor stoc sunt prezentate în acelaşi tabel. Stabilitatea auxinelor variază destul de mult. Astfel, AIA şi o bună parte din restul auxinelor, sunt fotolabile, în timp ce ANA şi 2,4 D sunt mai stabile.
46
3.2.2. Citochininele Citochininele sunt substanţe deosebit de active, cu rol fitoregulator al proceselor de creştere şi dezvoltare la plante. Prima citochinină descoperită (Skoog, 1956) a fost izolată din spermă de heringi şi denumită chinetină (6-furfuril-amino-purină). Aproximativ în aceeaşi perioadă s-a descoperit rolul stimulator al laptelui de cocos asupra formării de noi plantule in vitro. Ulterior s-a constatat că acest lucru se datorează faptului că laptele de cocos era bogat în citochinine naturale. Efectele citochininelor asupra explantelor cultivate in vitro sunt multiple: - stimulează diviziunea celulară; - au rol esenţial în formarea şi creşterea lăstarilor; - au rol important în procesele de regenerare adventivă a lăstarilor (organogeneză directă); - formarea rădăcinilor este în general inhibată sub acţiunea citochininelor; - stimulează de asemenea formarea lăstarilor axilari şi creşterea ratei de multiplicare; - întârzie procesele de senescenţă şi determină creşterea conţinutului de clorofilă în explante. Acţiunea citochininelor se corelează cu cantitatea de auxine prezente în mediu. Astfel spus, este esenţial raportul auxine:citochinine în determinarea şi reglarea unor procese vitale de creştere şi dezvoltare a explantelor. Principalele citochinine şi substanţe cu efect similar folosite în culturile in vitro sunt prezentate în tabelul 3.2.2. Dintre acestea BAP (6 benzil-amino-purină) sau BA (benziladenina) este cel mai mult folosită. Zeatina, produs bioactiv izolat din porumb, are o activitate fitoregulatoare importantă. La actinidia a stimulat formarea unui număr mare de lăstari adventivi din explante de rădăcină, internod, frunză (organogeneză directă) şi calus (organogeneză indirectă). Efecte asemănătoare are şi 2 iP (2 izopentiladenina), DPU (difenil ureea), tidiazuronul (1 fenil-3-(1,2,3, tiadiazolpentil) uree), CPPU (N-2-cloro 4 piridil N-fenilurea), care la fel ca şi zeatina sunt substanţe foarte costisitoare.
47
Toţi aceşti derivaţi ai fenil-ureei determină lăstărirea adventivă puternică la diferite tipuri de explante şi specii, efectul fiind mult mai puternic decât al citochininelor “clasice”, chiar la concentraţii inferioare. Datorită efectelor spectaculoase a devenit chiar o modă folosirea tidiazuronului în cercetări cât se poate de diverse. Există şi autori (Horgan, 1986) citat de Pierik (1987) care susţin că derivaţii fenilureei (DPU) inhibă de fapt activitatea citochinin oxidazei şi în acest fel concentraţia citochininelor rămâne ridicată iar activitatea este mai intensă. Adenina a fost folosită pentru prima dată de Skoog şi Tsui în 1948, observându-se efectul de stimulare a formării lăstarilor adventivi pe explante de tulpină de tutun. Concentraţia la care este folosită variază destul de mult între 2-120 mg/l. Frecvent adenina este înlocuită cu hemisulfatul de adenină care este mult mai solubil în apă. Sunt prezentate de asemenea, substanţele folosite pentru dizolvarea şi diluarea acestora, temperaturile de păstrare şi limitele concentraţiilor uzuale. Tabelul 3.2.2. Principalele citochinine folosite în culturile in vitro Specificaţie Adenină Adenină sulfat BAP (BA) 6-Benzilaminopurină (Benziladenină) BAR Benzilaminopurină ribozid BPA N-benzil-9(2-tetrahidropiranil)-adenină Chinetină 6 furfurilaminopurină KR Chinetină ribozid 4 CPPU N-2-clor-4piridil-Nfeniluree DPU Difeniluree
Masă molec. 135,1
Păstrare produs temp. cam. temp. cam.
Păstrare soluţie 0-5°C
Conc. mg/l 50-250
0-5°C
50-250
apă
temp. cam.
0-5°C
0,1-5,0
NaOH 1N
apă
0°C
0°C
0,01-5,0
309,4
NaOH 1N
apă
0°C
0°C
0,1-5,0
215,2
NaOH 1N NaOH 1N
apă
0°C
0°C
0,1-5,0
apă
0-5°C
0-5°C
0,01-5,0
Solvent
Diluant
apă
Na
184,2
apă
Na
225,3
NaOH 1N
357,4
347,3 247,7
DMSO*
apă
0-5°C
0-5°C
0,001-0,1
212,3
DMSO
apă
temp. cam.
0-5°C
0,1-1,0
48
Tabelul 3.2.2. continuare Specificaţie 2 iP 2 izopentiladenină 2 iPR 2 izopentiladenină ribozid
Specificaţie Tidiazuron 1 fenil-3-(1,2,3tidiazolpentil) uree Zeatină
Masă molec.
Solvent
Diluant
Păstrare produs
Păstrare soluţie
Conc. mg/l
203,2
NaOH 1N
apă
0°C
0°C
1,0-30,0
335,4
NaOH 1N
apă
0°C
0°C
0,01-10,0
Masă molec.
Solvent
Păstrare produs
Păstrare soluţie
Conc. mg/l
220,2
DMSO
apă
temp. cam.
0-5°C
0,0010,05
219,2
NaOH 1N
apă
0°C
0°C
0,01-5,0
Diluant
* DMSO – dimetilsulfoxid
3.2.3. Giberelinele Giberelinele sunt substanţe hormonale mai puţin folosite în culturile in vitro. Prima giberelină a fost descoperită în 1926 de către Kurosawa ca produs al ciupercii Giberella fujikuroi. În
prezent se cunosc un număr mare de gibereline
(aproximativ 50) notate cu GA1…….GAn. Dintre acestea cel mai mult folosit este acidul giberelic – GA3 (tabelul 3.2.3). Prin autoclavare, 90% din activitatea biologică a GA3 se pierde, motiv pentru care este nevoie ca sterilizarea acestuia să se facă prin filtrare. Rolul fiziologic al giberelinelor nu este pe deplin cunoscut. Se ştie că ele au ca efect: - stimularea alungirii lăstarilor, fiind recomandate în acest sens după stabilizarea culturii de meristeme pentru formarea noilor lăstari; - înlăturarea dormansului la seminţe şi embrioni şi stimularea germinării; - reglarea formării auxinelor endogene; - controlul proceselor de formare a florilor dar şi a fructelor partenocarpice etc.; - inhibarea formării lăstarilor şi rădăcinilor adventive.
49
Tabelul 3.2.3. Gibereline şi alţi fitoregulatori folosiţi în culturile in vitro Specificaţie GA3 - Acid giberelic ABA - Acid abscisic Acid t-cinamic
Masă molec. 246,4 264,3 148,2
Acid succinic Floro-glucinol
160,2 126,1
Triacontanol
438,8
Colchicină
399,4
Solvent
Diluant
etanol
apă
NaOH 1N etanol/ac etonă apă apă
apă apă Na Na
eter/ benzen apă
apă Na
Păstrare produs temp. cam. 0°C
Păstrare soluţie 0-5°C
Conc. mg/l 0,01-5,0
0°C
0,1-10,0
temp. cam. 0-5°C temp. cam. 0-5°C
0-5°C
0,1-10,0
0-5°C 0-5°C
0,1-10,0 <162,0
temp. cam.
0-5°C 0-5°C
3.2.4. Alte substanţe cu rol fitoregulator Pe lângă auxine, citochinine şi gibereline se cunosc o gamă largă de substanţe cu rol fitoregulator, dintre care o bună parte sunt folosite şi în culturile in vitro. În tabelul 3.2.3. se prezintă câteva dintre aceste substanţe. Acidul abscisic este cunoscut ca inhibitor al creşterii şi dezvoltării plantelor, determinând intrarea acestora în repaus. Folosirea lui la culturile in vitro este limitată datorită efectelor negative pe care le are. Există totuşi situaţii când, utilizat în concentraţii reduse, poate regla creşterea şi dezvoltarea explantelor în primele faze ale embriogenezei somatice. Etilena este produsă de celulele, ţesuturile şi organele cultivate in vitro. În mod normal nu se folosesc tehnici prin care acest gaz (C2H4) să fie introdus din exterior în vasele de cultură. Problema care se pune însă este tocmai reducerea cantităţii de etilenă care se acumulează în atmosfera vaselor de cultură prin folosirea unor sisteme de închidere care să permită difuzia acesteia în exterior. Efectele etilenei în cele mai multe situaţii sunt negative: - determină oprirea creşterii explantelor; - induce fenomenul de senescenţă şi determină căderea frunzelor; - determină inhibarea procesului de embriogeneză somatică. Există totuşi numeroase studii care au dovedit că etilena poate stimula anumite procese biologice sau că, creşterea concentraţiei de etilenă din vasele de cultură a coincis
50
cu inducţia sau stimularea acestora. Astfel, se ştie că după divizarea calusului cantitatea de etilenă produsă este mai mare. La calusul de tutun odată cu creşterea concentraţiei de etilenă la lumină, a avut loc şi formarea de lăstari adventivi (organogeneza indirectă). La explantele de bulbi de crin prin creşterea concentraţiei de etilenă s-a stimulat diferenţierea de bulbi adventivi (organogeneza directă). De asemenea, prin mărirea concentraţiei de CO2 şi etilenă s-a constatat o creştere a numărului de lăstari adventivi pe cotiledoane de Pinus radiata. Se pare că o anumită concentraţie de etilenă este necesară şi pentru inducţia diviziunii în suspensiile celulare la Acer. Se cunoaşte că etilena este implicată în transportul auxinelor. Totodată, 2,4 D induce formarea etilenei în timp ce azotatul de argint, poate fi folosit pentru inhibarea sintezei de etilenă. Acidul 2 cloretilfosfonic (ACEP) se descompune în etilenă şi acid fosforic. În horticultură este folosit sub denumirea comercială de Ethrel sau Ethephon cu 40% substanţă activă. Cercetările privind efectele ACEP asupra culturilor in vitro sunt numeroase (Cachiţă, 1987). În general această substanţă este folosită în mediul de cultură pentru rolul de precursor de etilenă pe care îl are. Folosind ACEP în culturile de meristeme la garoafe în concentraţii de 0,1 şi 1,0 mg/l s-a observat formarea unui mare număr de muguri dintr-un singur meristem (Cahiţă, 1987). Efecte stimulatoare au fost observate de către aceeaşi autoare la minibutaşii de crizanteme, gerbera, cartof şi protocormul de Cymbidium. Floroglucinolul este un compus fenolic folosit de regulă ca inhibitor al auxin oxidazei (AIA-oxidazei). Aplicat împreună cu auxinele determină stimularea formării rădăcinilor adventive datorită efectului sinergic care apare. În lipsa auxinelor, floroglucinolul stimulează formarea lăstarilor adventivi. Colchicina se foloseşte în special atunci când se urmăreşte mărirea gradului de ploidie prin dublarea numărului de cromozomi. Amestecurile de substanţe de origine vegetală au fost folosite mai frecvent la începuturile perioadei moderne a culturilor in vitro. Amestecuri ca: laptele de cocos, sucul de tomate, portocale, ananas, seva de mesteacăn, piureul (praful) de banane, extractele de drojdie, de endosperm de cereale etc.,
51
au dovedit efecte stimulatoare asupra creşterii şi dezvoltării explantelor in vitro datorită compoziţiei complexe pe care le au. Principalul inconvenient pe care îl prezintă aceste amestecuri este compoziţia variabilă de la caz la caz, fapt care face ca rezultatele obţinute să nu fie repetabile în alte condiţii. Firmele producătoare oferă astfel de amestecuri condiţionate sub formă de praf, suspensii sau soluţii. De exemplu, pudra de banane poate fi folosită în concentraţii de 40 g/l, în timp ce laptele de cocos în concentraţii de 5-20%. Laptele de cocos poate fi obţinut şi în laborator printr-o pregătire sumară după extragerea din nuci. Astfel, după o prealabilă filtrare se face sterilizarea acestuia prin autoclavare timp de 15 minute la 121°C. Se lasă apoi să se răcească şi a doua zi este din nou filtrat şi păstrat, până în momentul folosirii, în congelator la –20°C. Eventualele proteine care precipită sunt îndepărtate ulterior prin filtrare. 3.3. Constituenţi cu rol stabilizator 3.3.1. Apa Apa este unul dintre componenţii cei mai importanţi ai mediilor de cultură, ea reprezentând în jur de 95% din volumul acestora. Element vital, apa mediază majoritatea proceselor metabolice care au loc în explantele cultivate in vitro. În vasele de cultură, apa urmează un circuit relativ închis, în sensul că este preluată de către explante, eliminată prin transpiraţie în atmosferă, se condensează în bună parte pe pereţii vaselor sau la suprafaţa mediului şi reintră în circuit. Condensarea apei pe capace şi pe pereţii vaselor de cultură este mai accentuată în camerele de creştere în care poliţele rafturilor sunt încălzite de lămpile fluorescente aflate dedesubt (în caz de izolare necorespunzătoare). Pierderile de apă din vasele de cultură sunt ceva mai mari în camerele de creştere neclimatizate şi cu umiditatea aerului redusă. În acest caz, se constată în timp o deshidratare a mediului vizibilă prin scăderea pronunţată de volum şi apariţia de crăpături în mediu.
52
Acest lucru este cu atât mai periculos cu cât, în paralel, are loc creşterea concentraţiei în săruri şi zaharuri a mediului şi deci creşterea presiunii osmotice a mediului. Apa folosită pentru prepararea mediilor de cultură trebuie să fie în mod obligatoriu distilată. Mai mult, se recomandă folosirea apei bidistilate care prezintă un grad de puritate superior. Distilarea trebuie făcută în distilatoare din sticlă (tip Pyrex) întru-cât distilatoarele metalice pot elibera diferiţi ioni (Cu2+, Pb2+) în procesul de distilare (foto 3.1.). Chiar distilatoarele din sticlă trebuie spălate foarte bine când sunt noi şi de regulă, apa rezultată din Foto 3.1. Aparat din sticlă pentru bidistilarea apei
primele 2-3 distilări nu se foloseşte. În timpul exploatării, periodic, se va proceda la
spălarea cu acurateţe a distilatorului cu apă deionizată. Apa deionizată se obţine cu ajutorul unor aparate speciale numite deionizatoare, prevăzute cu cartuşuri filtrante speciale care reţin ioni existenţi în apa de robinet. Pentru o deionizare mai eficientă debitul de apă lăsat să treacă prin deionizator trebuie să fie cât mai mic posibil. Se impune, de asemenea, înlocuirea periodică a filtrelor. Trebuie spus că pe lângă deionizare şi distilare, există şi alte procedee de purificare a apei, cum ar fi de exemplu, osmoza inversă. Ideal este însă să se combine toate cele trei proceduri. Atunci când se ştie că apa de la reţea este încărcată cu ioni de tot felul (Pb2+, Ca2+, Mg2+ etc.), chiar cu germeni, sau că ea provine din foraje şi este bogată în săruri, se recomandă ca la intrarea în laborator să se monteze o instalaţie de filtrare. O astfel de instalaţie presupune montarea unei baterii de cartuşe filtrante alese în funcţie de compoziţia chimică a apei şi conţinutul acesteia în suspensii, germeni etc. Există filtre pentru săruri de Ca, de Mg, filtre cu cărbune pentru germeni, etc. Pe lângă faptul că intră în componenţa mediilor de cultură, apa mai este folosită în procesul de sterilizare a materialului vegetal înainte de inoculare. În acest scop se foloseşte apa bidistilată care se autoclavează în prealabil şi care se foloseşte la clătirea materialului vegetal după dezinfecţia cu diferiţi agenţi sterilizanţi. 53
De asemenea după clătire, explantele rămân în recipiente cu apă distilată sub hotă până în momentul inoculării. Atunci când se lucrează cu explante provenite de la specii care emit uşor fenoli se recomandă dizolvarea în apă distilată sterilă a unor substanţe antioxidante. Frecvent se foloseşte polivinilpirolidona (PVP) în concentraţie de 0,1%. În încheiere trebuie precizat că apa deioniozată şi bidistilată produsă în laborator trebuie păstrată în recipiente din plastic etichetate şi închise. Sticla obişnuită nu se recomandă pentru că ea elimină ioni nedoriţi de plumb, sodiu, arsenic, etc. 3.3.2. Agenţii de solidificare Mediile de cultură folosite pentru creşterea explantelor in vitro se pot realiza sub formă lichidă sau solidă (de fapt semisolidă). Mediile solide necesită adăugarea unor agenţi de solidificare care leagă apa şi absorb celelalte componente ale mediului. Condiţiile pe care trebuie să le îndeplinească un bun agent de solidificare sunt: -
să fie inert şi să nu fie contaminat; să permită circulaţia (difuzia) substanţelor minerale, apei, gazelor; să fie stabil după autoclavare; să aibă un punct de solidificare scăzut; să fie ieftin; eventual, să poată fi recuperat şi refolosit. Dintre agenţii de solidificare, agarul este cel mai larg folosit la culturile in vitro şi
nu numai. Agarul este un polizaharid obţinut din alga roşie Gelidium amansii care trăieşte în Oceanul Indian şi Marea Chinei. Se prezintă sub formă unei pulberi galbenă murdară care se topeşte în apă la o temperatură apropiată de 100°C, soluţia devenind translucidă şi se întăreşte la o temperatură de 32-35°C. Se foloseşte în concentraţie de 0,6-1,0%. Cel mai bun agar este cel produs de firma Difco Bacto (Noble agar). Există şi sortimente speciale cum ar fi agarul bacteriologic, agarul tip A, E, M, agarul purificat, agarul spălat, folosite în lucrări speciale de microbiologie, culturi de celule şi protoplaşti. În lipsa agarului pulvis se poate folosi şi agarul sub formă de solzi sau plăci care trebuie înmuiat în apă şi spălat repetat cu apă bidistilată, întru-cât este mai puţin pur. Agaroza este formată tot din coloizi marini, prezintă un grad înalt de purificare şi este folosită pentru culturi de protoplaşti sau de celule. Gelifică la mai puţin de 30°C (2630°C) fiind utilizată la prepararea mediilor cu compuşi termolabili. 54
Acidul alginic este un acid poliuronic (acidul anhidro β-D-manuronic) care are capacitatea de a se gelifica. Este ideal pentru culturi de protoplaşti şi suspensii celulare dar şi pentru încapsularea embrionilor somatici sau a explantelor de diferite feluri în vederea obţinerii seminţelor artificiale. Soluţiile apoase de acid alginic se gelifică la temperatura camerei în prezenţa unor cationi (în special a calciului). Lichefierea mediului gelificat se poate realiza prin adăugarea unor agenţi de chelatare (ex. citraţii). Formarea capsulelor de alginat pentru încapsularea protoplaştilor sau embrionilor somatici se face prin adăugarea în prealabil a acidului alginic (1,75-4,00%) într-o soluţie cu concentraţie scăzută de calciu (2mM). După amestecare se face sterilizarea prin filtrare (0,45 µm) sau autoclavarea. Odată obţinut alginatul, se introduc explantele timp de 1-2 secunde, după care una câte una acestea sunt trecute într-o soluţie de CaCl2 (50 mM) unde vor rămâne timp de 45 de minute pentru formarea capsulei. Phytagelul (Gelrite) este un heteropolizaharid natural obţinut prin purificare dintrun substrat bacterian şi format din acid glucuronic, ramnoză şi glucoză. Este cunoscut şi sub numele de gumă Gellan. Produce un gel dens, perfect limpede, la o concentraţie de doar 1,5-2,0%. Se gelifică în soluţie apoasă la 27-31°C. Uneori determină apariţia vitrificării Agargelul este un amestec agar + phytagel care îmbină calităţile celor doi componenţi. În concentraţie de 0,35-0,50% produce un gel semitransparent mult folosit pentru detectarea contaminărilor. În acelaşi timp este cunoscut pentru reducerea vitrificărilor. Este mai ieftin ca agarul normal. Se gelifică la 26-28°C. Transfergelul conţine hidroxietilceluloză şi se obţine prin sinteză. Este folosit în concentraţie de 2,5% pentru încapsularea embrionilor somatici, a minibutaşilor şi apexurilor precum şi în tehnicile de “seed drilling” (semănare în flux lichid). Împreună cu soluţiile nutritive cu care se amestecă formează un amestec vâscos care se autoclavează. Prin autoclavare pH-ul soluţiei scade cu 0,5-1 unităţi. Pentru autoclavare trebuie folosite recipiente cu volum de 4 ori mai mare decât cel al soluţiei care conţine Transfergel. Pe lângă substanţele prezentate mai sus se mai pot folosi şi alţi agenţi solidificanţi de tipul gelatinei (10%), biogelurilor (Biogel P 200), silicagelurilor sau gelurilor de poliacrilamidă folosite în tehnicile de electroforeză a proteinelor. Nici unul din aceste
55
produse nu pot concura însă agarul. Compoziţia chimică a câtorva agenţi solidificanţi este prezentată în tabelul 3.3.1. (Sigma Plant Culture, 1994, Catalogue). Tabelul 3.3.1. Compoziţia chimică a câtorva agenţi solidificanţi (%) Cenuşă
Ca
Mg
K
P
Na
Agar
2-5
0,30
0,10
0,01
0,01
0,5
Agar bacteriologic
3-7
0,17
0,09
0,80
-
3,1
Agar tip A
5-6
0,01
0,01
0,1
0,17
1,8
Agar tip E
3-4
0,02
0,02
0,07
0,13
1,2
Agar tip M
3-6
0,09
0,14
0,07
0,01
1,4
Agar consistent
3-4
0,03
0,00
0,07
0,09
0,72
Agar purificat
2,0
0,02
0,01
0,01
0,01
0,35
Agar spălat
2,2
0,15
0,08
-
-
0,38
Agaroză
<1
-
-
-
-
-
-
0,17
0,01
2,3
-
10,1
AgargelTM
4-5
0,25
0,06
0,04
0,08
1,05
PhytagelTM
9,5
0,85
0,35
1,70
0,15
0,45
Acid alginic
3.3.3. Stabilizatorii osmotici şi de pH Prin combinarea unor cantităţi diferite de substanţe minerale şi organice (în special zaharuri) se obţin medii de cultură care au potenţiale osmotice diferite. Calcularea potenţialului osmotic al unui mediu de cultură este destul de dificilă fiind nevoie de o cunoaştere exactă a maselor moleculare şi gradului de disociere a sărurilor folosite. Mult mai simplă este însă măsurarea potenţialului osmotic şi eventual corectarea acestuia. Zaharurile au în general o pondere mai mare în determinarea potenţialului osmotic al unui mediu faţă de sărurile minerale. Yoshida şi colab. (1973), citat de Pierik (1987), a demonstrat cât de diferită este contribuţia celor două grupe de compuşi la formarea potenţialului osmotic al mediului de cultură (tabelul 3.3.2.).
56
Tabelul 3.3.2. Ponderea sărurilor minerale şi zaharurilor în realizarea potenţialului osmotic al mediului de cultură Mediul de cultură
White Hildebrandt Heller Murashige&Skoog
Potenţialul osmotic Săruri minerale Zaharuri % din bari % din total bari total
0,43 0,67 0,96 2,27
22,75 31,45 19,16 50,78
1,46 1,46 4,05 2,20
77,25 68,55 80,84 49,21
Dacă potenţialul osmotic depăşeşte valoarea de 3 bari, activitatea explantului încetează datorită imposibilităţii folosirii apei din mediu. Creşterea potenţialului osmotic al mediului, atunci când este necesar, poate fi făcută prin adăugarea de manitol, iar mai nou, de polietilenglicol (PEG), până la atingerea valorii dorite. Un alt element important al mediului de cultură este pH-ul acestuia. În mod obişnuit pH-ul mediului de cultură trebuie să aibă valoarea 5,5. Oricum se pot folosi şi medii de cultură cu valori ale pH-ului cuprinse între 5,0-6,5. Scăderea valorii pH-ului sub 5,0 aduce după sine o serie de probleme: -
mediul nu se solidifică;
-
AIA şi GA3 devin instabile;
-
vitamina B1 şi acidul pantotenic se descompun;
-
anumite săruri precipită. Nici pH-ul prea ridicat (peste 7,0) nu este admisibil datorită blocării fierului,
apariţiei clorozei şi altor dezechilibre fiziologice. Oricum rolul valorii pH asupra creşterii şi dezvoltării explantelor in vitro este mai puţin cunoscut. Într-o experienţă de calogeneză şi organogeneză indirectă la specii şi hibrizi din genul Actinidia s-au obţinut rezultate superioare pe mediul cu pH-7 faţă de varianta cu pH 5,5 (Stănică F. şi colab., 1994, Stănică F., 1998). Se ştie că în urma autoclavării valoarea pH a mediului scade cu 0,3-0,5 unităţi. De asemenea, valoarea pH poate scădea în timpul unei subculturi cu 0,5 unităţi (Skirvin şi colab. 1986, citat de Pierik 1987).
57
Ţinând cont de aceste modificări la prepararea mediului de cultură valoarea pH trebuie corectată prin titrare cu soluţii de baze (NaOH, KOH 0,1N) sau de acizi (HCl sau acizi organici 0,1N) până la valoarea dorită. Corectarea valorii pH se va face după aducerea la volum cu apă distilată a mediului înaintea adăugării agarului şi zaharozei. Unii autori recomandă corectarea pHului după introducerea zaharozei şi înainte de introducerea agarului. 3.3.4. Substanţele antioxidante şi absorbante Una din problemele care apar în timpul cultivării in vitro a explantelor vegetale este emisia de fenoli şi oxidarea rapidă a acestora având ca efect brunificarea mediului de cultură şi blocarea creşterii. Pentru prevenirea acestui fenomen la speciile cu predispoziţie, se recurge la folosirea unor substanţe antioxidante, fie pentru tratarea explantelor înainte de inoculare, fie chiar pentru introducerea în mediul de cultură. Acidul ascorbic (vitamina C) intră mai rar în compoziţia unor amestecuri de vitamine, fiind însă folosit ca antioxidant în doză de 1-100 mg/l. Prin autoclavare acidul ascorbic se descompune şi de aceea el se va steriliza numai prin filtrare (0,22 µm). Acidul citric se foloseşte frecvent ca antioxidant în cantitate de 150 mg/l în amestec cu acidul ascorbic. Soluţia astfel obţinută poate fi folosită pentru îmbăierea explantelor timp de 5-30 minute după secţionare şi înainte de inoculare. Polivinilpirolidona (PVP) este un antioxidant larg folosit în culturile in vitro. Acest polimer are capacitatea de a absorbi substanţele din grupa fenolilor reducând astfel oxidarea acestora. PVP se poate introduce în mediul de cultură în cantitate de 250-1000 mg/l sau poate fi adăugat în apa distilată sterilă la clătirea explantelor în procesul sterilizării şi la păstrarea acestora până la inoculare (0,1%). DIECA (dietil-ditiocarbonat) este folosită de asemenea în apa de clătire a explantelor în concentraţii de 2 g/l pentru reducerea oxidării. DIECA este nelipsită de la protejarea împotriva oxidării a zonelor secţionate la realizarea microaltoirii in vitro sau “ex vitro” (vezi subcapitolul 6.2.). Efect antioxidant au şi alte substanţe cum ar fi tioureea şi diferiţi aminoacizi: Lcisteina, glutamina, arginina şi aspargina care însă sunt mai puţin folosite în acest scop.
58
Cărbunele activ este obţinut prin carbonizarea la temperaturi ridicate a lemnului în prezenţa aburului. Se obţine astfel o structură microporoasă caracterizată printr-o capacitate foarte mare de a absorbi o serie de compuşi din mediul de cultură. Cărbunele vegetal are o mare capacitate de reţinere a 5 hidroximetilfurfurolului (inhibitor de creştere care apare datorită descompunerii zaharozei în timpul autoclavării), a unor fenoli sau tanini (care sunt responsabili de procesul de brunificare), a unor auxine, citochinine, a etilenei, a unor vitamine şi a chelaţilor de Fe şi Zn. Acţiunea pozitivă a cărbunelui activ a fost observată în special la conifere în procesele de alungire a lăstarilor la pinul maritim, Sequoia, dar şi la Clematis (Gâlă şi colab. 2003) (foto 3.2.). De asemenea, s-au obţinut rezultate superioare la folosirea cărbunelui activ, în embriogeneza somatică la Anemone şi Nicotiana. Foarte frecvent, cărbunele activ este folosit în faza de înrădăcinare a explantelor pe medii fără hormoni, în concentraţie de 0,2-0,3%, datorită efectului benefic materializat prin absorbţia unor produşi de secreţie dar mai ales prin crearea întunericului în zona formării noilor rădăcini.
Foto 3.2. Mediu de cultură cu cărbune activ la Clematis
59
3.4. Concentraţii. Prepararea soluţiilor stoc Aşa cum am afirmat până aici mediile de cultură au o compoziţie complexă care se modifică în funcţie de specii, tipul de explant (organ), vârsta explantului, scopul urmărit etc. Conţinutul în elemente nutritive, fitoregulatoare şi cu rol stabilizator este mult diferit de la caz la caz. Fiecare component are o anumită pondere în realizarea mediului final. De aceea, compoziţia mediului este dată de tipul substanţelor şi de concentraţia acestora. De la caz la caz, concentraţia unui component poate fi exprimată în: - % de volume: ex. 5% reprezintă 50 ml din produsul respectiv adăugaţi la 950 ml apă; - % de masă: pentru agar, zahăr sau alte componente solide: ex. 2%, reprezintă 2 g în 100 ml de mediu sau 20 g în 1000 ml mediu preparat. Acest mod de exprimare a concentraţiei este notată în literatura de specialitate de limbă engleză w/v, adică: weight/volume; - miligram/litru (mg/l; mg.l-1) reprezintă 0,001 g/litru. Frecvent pentru acest tip de concentraţie se foloseşte exprimarea cu ajutorul puterilor, astfel: 1 g/l= 1 . 10-3 1 mg/l = 1 . 10-6 - microgram/litru (µg/l; (µg . l-1) reprezintă 0,001 mg/l sau 1 . 10-9; - părţi pe milion (ppm). 1 ppm reprezintă o parte dizolvată într-un milion de părţi de acelaşi ordin de mărime, de ex. 1 mg în 1000 ml (1.000.000 µl) este echivalent cu 1 ppm. În concluzie: 1 mg/l = 1 . 10-6 = 1 ppm şi 1 g/l = 1 . 10-3 = 1000 ppm - moli. Conform Asociaţiei Internaţionale de Fiziologia plantelor, cel mai corect mod de exprimare a concentraţiilor într-un mediu de cultură o reprezintă concentraţia molară. Acest lucru permite o comparare corectă a două substanţe diferite. Ştiind că 1 mol este reprezentat de o cantitate de substanţă egală cu masa moleculară, este mai corect să se compare de exemplu, efectul unui mol de IBA (203,2) cu al unui mol de ANA (186,2) decât să se compare efectul unei cantităţi de câte 1 mg/l din fiecare hormon de mai sus. Acelaşi lucru este valabil atunci când se compară concentraţiile totale ale sărurilor din două medii diferite. Cunoscând masa moleculară a unei substanţe (de exemplu 225,3 pentru BAP) concentraţia molară se poate exprima astfel:
60
- 1 mol de BAP este echivalent cu o concentraţie de 225,3 g/litru; - 1 mM de BAP este echivalent cu o concentraţie de 0,2253 g/litru; - 1 µM de BAP este echivalent cu o concentraţie de 0,0002253 g/litru = 0,2253 mg/l; Transformarea din concentraţie molară (M) în concentraţie exprimată în unităţi de masă (g/l) se face folosind următoarea formulă: concentraţia molară (M) . masa moleculară = X g/l. concentraţia molară (mM) . masa moleculară = X mg/l. De exemplu, dacă concentraţia dată de BAP este de 2,2 µM, concentraţia echivalentă exprimată în mg/l va fi: 2,2 µM . 225,3 = 495,66 µg/l ≈ 0,5 mg/l Invers, dacă iniţial concentraţia a fost exprimată în unităţi de masă se poate afla concentraţia molară împărţind valoarea respectivă la masa moleculară. În tabelul 3.4.1. sunt prezentate masele moleculare ale substanţelor folosite la prepararea mediilor de cultură. Tabelul 3.4.1. Masele moleculare ale substanţelor folosite la prepararea mediilor de cultură Formula Masa Substanţa chimică moleculară
Macroelemente Azotat de amoniu Sulfat de amoniu Clorură de calciu Azotat de calciu Sulfat de magneziu Clorură de potasiu Azotat de potasiu Difosfat de potasiu Difosfat de sodiu
NH4NO3 (NH4)2SO4 CaCl2.2H2O Ca(NO3)2.4H2O MgSO4.7H2O KCl KNO3 KH2PO4 NaH2PO4.2H2O
80,04 132,15 147,02 236,16 246,47 74,55 101,11 136,09 156,01
H3BO3 CoCl2.6H2O CuSO4.5H2O MnSO4.4H2O KI Na2MoO4.2H2O ZnSO4.7H2O Na2EDTA.2H2O FeSO4.7H2O
61,83 237,93 249,68 223,01 166,01 241,95 287,54 372,25 278,03
Microelemente Acid boric Clorură de cobalt Sulfat de cupru Sulfat de mangan Iodură de potasiu Molibdat de sodiu Sulfat de zinc Sodiu EDTA Sulfat de fier (feros)
61
Formula chimică
Substanţa
Tabelul 3.4.1. continuare Masa moleculară
Zaharuri Fructoză Glucoză Manitol Sorbitol Zaharoză
C6H12O6 C6H12O6 C6H14O6 C6H14O6 C6H22O11
180,15 180,15 182,17 182,17 342,31
Vitamine şi aminoacizi Acid para-aminobenzoic Acid ascorbic (C) Acid folic (vit. Bc, vit. M) Acid nicotinic (B3) Biotină (H) Cianocobalamină (B12) Glicină Inozitol L-Cisteină HCl L-Glutamină Pantotenat de calciu Piridoxină (B6) Riboflavină Tiamină (B1)
C6H12O6 C19H19N7O6 C6H5NO2 C10H16N2O3S C63H90CoN14O14P C2H5NO3 C6H12O6 C3H7NO2S.HCl C5H10N2O3 (C9H16NO5)2Ca C6H11NO3.HCl C12H17ClN4OS.HCl
137,0 176,12 441,40 123,11 244,31 1357,64 75,07 4180,16 157,63 146,15 476,53 205,64 376,37 337,29
Auxine 2,4-D- acid 2,4 diclorfenoxiacetic AIA- acid 3 indolil acetic ANA- acid α naftil acetic ANOA- Acid β naftoxiacetic IBA- acid 3 indolil butiric PCAA- Acid paraclorfenoxiacetic
Citochinine AD – Adenină AdSO4- Sulfat de adenină BA sau BAP (6-benziladenină sau 6 benzilaminopurină 6 Furfurilaminopurină SD 8339 Zeatină
C8H6O3Cl2 C10H9NO2 C12H10O2 C12H10O2 C12H13NO2 C8H7O3Cl
221,04 175,18 186,20 202,20 203,23 186,59
C5H5N5.3HO (C5H5N5)2.H2SO4.2H2O C12H11N5
189,13 404,37 225,20
C10H9N5O C17H19N5O C10H13N5O
215,21 309,40 219,20
C19H22O6
346,37
C15H20O4 C22H25NO6 C6H6O3
264,31 399,43 126,11
Gibereline GA3-Acid giberelic
Alte componente Acid abscisic Colchicină Floroglucinol
62
Pentru substanţe mai complexe a căror masă moleculară nu este cunoscută, aceasta se calculează prin adunarea maselor atomice ale elementelor care o compun (Tabelul 3.4.2.). Se va ţine cont dacă substanţa respectivă se află în stare hidratată sau nu (“sic”) pentru a adăuga valoarea masei moleculare a apei. În tabelul 3.4.2. este prezentat conţinutul în săruri minerale a mediilor Murashige&Skoog şi Gamborg (B5) având concentraţia exprimată în mg/l, respectiv mM, pentru macroelemente şi µg/l, respectiv µM, pentru microelemente. Tabelul 3.4.2. Conţinutul în săruri minerale a mediilor de cultură Murashige&Skoog şi Gamborg (B5) Substanţa Murashige & Skoog Gamborg B5 Macroelemente mg/l mM mg/l mM NH4NO3 1.650 20,6 (NH4)2SO4 134 1,0 KNO3 1.900 18,8 2500 24,7 CaCl2 . 2H2O 440 3,0 150 1,0 . MgSO4 7H2O 370 1,5 250 1,0 KH2PO4 170 1,25 NaH2PO4 150 1,0 Total 4.530 45,15 3.184 28,7 Microelemente µg/L µM µg/L µM KI 830 5,0 750 4,5 H3BO4 6.200 100,0 3.000 48,8 MnSO4 . H2O 16.000 94,6 10.000 59,1 ZnSO4 . 7H2O 8.600 30,0 2.000 7,0 Na2MoO4 . 2H2O 250 1,0 250 1,0 . CuSO4 5H2O 25 0,1 25 0,1 . CoCl2 6H2O 25 0,1 25 0,1 Total 31.930 230,8 16.050 120,6 Total general 4.561,93 45,38 3.200,05 28,82 Se observă, în final, că cele două medii diferă atât în ceea ce priveşte compoziţia cât şi în ceea ce priveşte concentraţia totală. Revenind la necesitatea folosirii concentraţiilor molare, printr-un calcul simplu se observă că în cazul concentraţiei exprimate în mg/l, mediul MS este doar cu 142,5% mai concentrat decât mediul B5. Cât despre concentraţia molară, se constată că de fapt diferenţa este de 157,46%. Aşa cum reiese din tabelul de mai sus pentru prepararea unui mediu este nevoie, în medie, de 4-5 săruri conţinând macroelemente, de 7-8 săruri cu microelemente, de chelat de fier, de amestecuri de 2 sau mai multe vitamine, de aminoacizi şi de un număr mai mare 63
sau mai mic de hormoni de creştere. La toate acestea se adaugă zaharoza, agarul şi eventual cărbunele activ. Pentru prepararea unui litru de mediu ar fi nevoie în jur de 20-25 de cântăriri şi tot atâtea dizolvări, diluări etc. ceea ce înseamnă un volum considerabil de muncă. Lucrurile s-ar complica şi mai mult atunci când este vorba de microelemente care s-ar cântări în cantităţi de ordinul microgramelor. Creşte în plus, riscul de apariţie a unor erori şi de nerespectarea reţetelor. Pentru înlăturarea acestor neajunsuri se recurge la prepararea unor soluţii stoc concentrate formate din amestecuri de macro şi microelemente, vitamine care în momentul preparării mediilor se diluează corespunzător concentraţiei şi reţetei de mediu folosite. Diverşi autori recomandă să se folosească 5-6 soluţii stoc diferite pentru prepararea unui mediu: -
soluţie stoc de macroelemente;
-
soluţie stoc de microelemente;
-
soluţie stoc de chelat de fier;
-
soluţie stoc de vitamine;
-
soluţie stoc de aminoacizi;
-
soluţie stoc de hormoni.
Concentraţia acestor soluţii stoc variază între 10 X şi 1000 X (cu X se notează concentraţia normală). De exemplu, o soluţie stoc de macroelemente Murashige&Skoog cu o concentraţie 10 X va conţine de 10 ori mai mult azotat de amoniu (16.500 mg/l) decât o soluţie cu concentraţia normală X (1.650 mg/l). Acelaşi lucru este valabil şi pentru celelalte săruri care alcătuiesc soluţia de macroelemente. Atunci când compuşii sunt mai stabili şi în laborator se prepară cantităţi mari de mediu, se folosesc soluţii stoc cu concentraţii ceva mai mari (100 X, 1000 X). Frecvent soluţia stoc de macroelemente are concentraţia 10 X, iar celelalte (microelemente şi vitamine) concentraţia de 100 X.
64
Pentru a afla ce cantitate din soluţia stoc se va folosi pentru a prepara un anumit volum de mediu se aplică formula: volumul de soluţie stoc = concentraţia cerută . volumul de mediu concentraţia soluţiei stoc De exemplu, pentru a afla ce cantitate din soluţia stoc de vitamine, care are o concentraţie 100 X este necesară pentru a prepara 2 l de mediu calculul este: Y ml de soluţie stoc = X . 2 l = 0,02 l = 20 ml 100 X Tabelul nr. 3.4.3. este un tabel ajutător pentru a afla cantitatea de soluţie stoc necesară pentru a prepara un anumit volum de mediu cu concentraţia cunoscută (X). Tabelul 3.4.3. Calculul diluţiei pentru trecerea de la o anumită soluţie stoc la soluţia normală Nr. ml din soluţia stoc necesari pentru un mediu cu Concentraţia concentraţia normală X soluţiei stoc 0,250 l 0,500 l 1l 2l 3l 10 l 250 500 1.000 2.000 3.000 10.000 1X 10 X
25
50
100
200
300
1.000
100 X
2,5
5
10
20
30
100
200 X
1,25
2,5
5
10
15
50
1000 X
0,25
0,5
1
2
3
10
Prepararea soluţiilor stoc Cunoscând concentraţiile finale (normale) în diferite componente ale unui mediu de cultură se poate trece la prepararea soluţiilor stoc. Acest lucru este posibil prin mai multe căi. Una dintre ele ar fi cântărirea pentru fiecare tip de mediu şi component a unor cantităţi de 10, 100 sau 1000 de ori mai mari decât concentraţia normală, dizolvarea, amestecarea soluţiilor şi adăugarea de apă bidistilată până la volumul de 1 litru. S-ar obţine astfel o soluţie stoc de 10, 100 sau 1000 de ori mai concentrată de macro şi microelemente sau vitamine. Atunci când însă, într-un laborator se folosesc frecvent 4-5 medii de cultură diferite şi se prepară zilnic cantităţi mari de mediu se poate apela la o soluţie mai practică şi mai
65
puţin laborioasă. Aceasta constă în primul rând în simplificarea operaţiilor de cântărire şi permite o folosire mai judicioasă a substanţelor, evitându-se învechirea soluţiilor stoc. Metoda presupune existenţa a două tipuri de soluţii stoc: -
soluţiile mamă;
-
soluţiile stoc propriu-zise.
Soluţiile mamă se obţin prin cântărirea, pentru fiecare sare în parte, a unei cantităţi constante (de exemplu 100 g pentru macroelemente şi 10 g sau 1 g pentru microelemente). După dizolvare volumul soluţiei se aduce la un litru obţinându-se astfel o soluţie cu concentraţia 100 g/l, respectiv 10g/l, sau 1 g/l. Soluţiile obţinute se păstrează în sticle etichetate aşezate în ordine. Soluţiile stoc propriu-zise de concentraţie 10 X, 100 X sau 1000 X se obţin prin diluarea unui anumit volum din fiecare soluţie mamă corespunzătoare sărurilor care intră în componenţa soluţiilor stoc respective. Calculul volumului de soluţie mamă necesar pentru a obţine 1 l de soluţie stoc este următorul: Y ml soluţie mamă = concentr.soluţiei normale (mg/l) . concentr.soluţiei stoc concentraţia soluţiei mamă (g/l) Exemplu: Dacă soluţia normală a mediului Murashige&Skoog conţine 1650 mg/l NH4NO3 şi concentraţia soluţiei mamă de NH4NO3 este de 100 g/l, să se calculeze câţi ml de soluţie mamă vor fi necesari pentru a obţine un litru de soluţie stoc de macroelemente cu concentraţia 10 X. Y ml de soluţie mamă NH4NO3
= 1650
mg/l NH4NO3 . 10(X) = 165 ml 100 g/l NH4NO3
În tabelele 3.4.4. şi 3.4.5. sunt prezentate cantităţile (ml) de soluţii mamă necesare pentru prepararea unui litru de soluţie stoc de macroelemente (10X) şi respectiv, de microelemente (100X), la câteva dintre mediile de cultură cele mai folosite. O problemă care poate apărea la prepararea soluţiilor stoc din soluţii mamă este apariţia precipitaţilor insolubili. Principala cauză este formarea unor compuşi insolubili în calciu, ionul fosfat şi magneziu. Pentru a evita acest lucru este indicat să se respecte o anumită ordine la adăugarea soluţiilor. Astfel se vor introduce prima fată soluţiile cu azot apoi cele cu magneziu,
66
urmează cele cu calciu şi în final cele cu fosfor. Este de la sine înţeles că fiecare sare trebuie în prealabil integral dizolvată în soluţia mamă. Riscul apariţiei precipitaţiilor se poate evita şi prin prepararea unor soluţii stoc de concentraţie mai redusă (10X). Un alt compus de bază al mediului de cultură este chelatul de fier. Fierul nu este accesibil plantelor decât dacă este legat de un agent de chelatare. În cazul mediilor pentru culturile in vitro, agentul de chelatare folosit este Na2EDTA, sarea disodică a acidului etilendiaminotetraacetic (C10H14N2O8Na2.2H2O). Ca sursă de fier se foloseşte sulfatul feros hidratat cu 7 molecule de apă .
(FeSO4 2H2O). De regulă se foloseşte o soluţie stoc 200X de chelat de fier care se prepară astfel: - se cântăresc 7,45 g de Na2EDTA.2H2O şi se dizolvă în 900 ml de apă distilată până devine perfect limpede. La nevoie se încălzeşte uşor; - se cântăresc 5,52 g sulfat feros şi se dizolvă în restul de apă; - se amestecă cele două soluţii obţinându-se 1 l de soluţie 200x de chelat de fier de culoare galbenă. La prepararea unui litru de mediu de cultură din soluţia stoc de chelat de fier se vor lua 5 ml (pentru 1 l de mediu) cantitate care conţine 27,8 mg de sulfat feros (100 µM) şi respectiv 37,25 mg Na2EDTA (200 µM).
67
Tabelul 3.4.4. Prepararea unui litru de soluţie stoc de macroelemente (10X) din soluţiile mamă la câteva medii de cultură
Substanţa NH4NO3
Quoirin & Schenk & Murashige & Conc. Nitsch & Nitsch Gamborg B5 Lepoivre Hildebrandt Skoog sol. Conc.sol. Soluţie Conc.sol. Soluţie Conc.sol. Soluţie Conc.sol. Soluţie Conc.sol. Soluţie mamă normale mamă normale mamă normale mamă normale mamă normale mamă (g/l) mg/l ml. mg/l ml. mg/l ml. mg/l ml. mg/l ml. 100 1650 165 400 40 720 72,0
KNO3
100
1900
190
2500
250
1800
180
2500
250
950
95,0
CaCl2 · 2H2O
100
440
44
150
15
-
-
200
20
166
16,6
MgSO4 · 7H2O
100
370
37
250
25
360
36
400
40
90,3
9,03
KH2PO4
100
170
17
-
-
270
27
-
-
68
6,8
Ca(NO3)2 · 4H2O
100
-
-
-
-
1200
120
-
-
-
-
(NH4)2SO4
100
-
-
134
13,4
-
-
-
-
-
-
NaH2PO4 · H2O
100
-
-
150
15
-
-
-
-
-
-
NH4H2PO4
100
-
-
-
-
-
-
-
-
-
-
68
Tabelul 3.4.5. Prepararea unui litru de soluţie stoc de microelemente (100X) din soluţiile mamă la câteva medii de cultură
Substanţa KI
Murashige & Quoirin & Schenk & Gamborg B5 Nitsch & Nitsch Conc. Skoog Lepoivre Hildebrandt sol. Conc.sol. Soluţie Conc.sol. Soluţie Conc.sol. Soluţie Conc.sol. Soluţie Conc.sol. Soluţie mamă normale mamă normale mamă normale mamă normale mamă normale mamă (g/l) mg/l ml. mg/l ml. mg/l ml. mg/l ml. mg/l ml. 10 0,83 8,3 0,75 7,5 0,08 0,80 1,0 10,0 -
H3BO3
10
6,20
62,0
3,00
30,0
6,20
62,0
5,0
50,0
10,0
100,0
MnSO4 · H2O
10
16,00
160,0
10,00
100,0
0,76
7,60
10,0
100,0
18,9
189,0
ZnSO4 · 7H2O
10
8,60
86,0
2,00
20,0
8,60
86,0
1,0
10,0
10,0
100,0
Na2MoO4 · 2H2O
1
0,25
25,0
0,25
25,0
0,250
25,0
0,1
10,0
0,25
2,5
CuSO4 · 5H2O
1
0,025
2,5
0,025
2,5
0,025
2,50
0,2
20,0
0,025
2,5
CoCl2 · 6H2O
1
0,025
2,5
0,025
2,5
0,025
2,50
0,1
10,0
-
-
69
Tabelul 3.4.6. Amestecuri de vitamine folosite frecvent la prepararea mediilor de cultură Necesar pt. 100 ml Concentraţia normală (X) soluţie 100 X Amestec mg/l µM mg Murashige&Skoog Acid nicotinic 0,5 4,0 5,0 Piridoxină - HCl 0,5 2,4 5,0 Glicină 2,0 26,6 20,0 Tiamina - HCl 0,1 0,3 1,0 Walkey 1 Acid nicotinic 0,5 4,0 5,0 Piridoxină - HCl 0,5 2,4 5,0 Glicină 5,0 66,6 50,0 Tiamina - HCl 0,4 1,2 4,0 Walkey 2 Inozitol 100,0 560,0 1000,0 Tiamina - HCl 0,4 1,2 4,0 Jacquillot Acid nicotinic 1,0 8,1 10 Acid folic 0,01 0,02 0,1 Acid p-aminobenzoic 1,0 7,3 10,0 Biotina 0,1 0,4 1,0 Pantotenat de calciu 0,5 1,0 5,0 Riboflavina 0,1 0,26 1,0 Tiamina - HCl 1,0 3,0 10,0 Gamborg B5 Acid nicotinic 0,1 8,1 10,0 Piridoxină - HCl 1,0 4,9 10,0 Tiamina - HCl 10,0 29,6 100,0 Aşa cum se poate observa, raportul dintre cele două componente trebuie să fie de 1:2 pentru ca soluţia să fie stabilă. Orice exces de fier bivalent (Fe2+) duce la oxidarea acestuia în Fe trivalent (Fe3+) urmată de formarea fosfatului feric care precipită. Soluţiile de vitamine care se folosesc la prepararea mediilor de cultură sunt amestecuri mai mult sau mai puţin complexe, diverşi autori propunând reţeta proprie. Concentraţiile soluţiilor stoc variază în general între 100x şi 1000x. Păstrarea acestor soluţii se face de regulă în frigider la 0-5°C, uneori fiind necesară păstrarea în congelator (amestecul Kao&Michayluk – cod Sigma K-3129). În tabelul 3.4.6. sunt prezentate reţetele câtorva amestecuri de vitamine folosite mai frecvent la prepararea mediilor de cultură.
70
Mai trebuie reţinut că piridoxina şi tiamina se dizolvă cu câteva picături de acid clorhidric în timp ce acidul folic, bistina şi acidul nicotinic se dizolvă mai uşor la cald (nu se vor depăşi 35-37°C). Cum marea majoritate a vitaminelor sunt termolabile nu s-ar recomanda introducerea lor în mediu înainte de autoclavare. Soluţia este sterilizată prin filtrare, folosind filtre bacteriologice de 0,2 µm şi introducerea în mediul autoclavat înainte de răcirea acestuia. Soluţiile de hormoni Aşa cum am precizat în capitolul 3.2. mediul de cultură trebuie să conţină şi o serie de substanţe fitoregulatoare care practic determină sensul evoluţiei explantelor. În funcţie de tipul de explant, de tipul de cultură şi de scopurile urmărite se apelează la o anumită combinaţie de hormoni. De regulă, se urmăreşte realizarea unui raport auxine: citochinine optimal dar în acelaşi timp pot fi adăugaţi şi alţi hormoni cu acţiune stimulatoare. Pentru fiecare tip de hormon se prepară soluţii stoc concentrate care în momentul folosirii se diluează până la concentraţia precizată în protocol. Date despre solvenţii folosiţi, modul de diluare şi temperatura de păstrare a soluţiilor stoc se regăsesc în tabelele 3.2.1; 3.2.2.; 3.2.3 şi 3.2.4. Cel mai frecvent se prepară soluţii stoc care conţin 1 mg din hormonul respectiv într-un ml de soluţie. În acest sens, se dizolvă 100 mg de hormon folosind câţiva ml de solvent după care se dizolvă în apa distilată până se ajunge la volumul de 100 ml. După etichetare soluţia stoc se păstrează aşa cum am precizat mai devreme. 1 mg/ml = 1000 mg/l = 1.10-3 În mediile de cultură concentraţia hormonilor variază, în general, între 0,1 şi 10,0 mg/l. Pentru a prepara un anumit mediu se aplică formula de mai jos sau se face un raţionament simplu: Volum de soluţie stoc necesar = Concentraţia hormonului în mediul normal . Volum de mediu Concentraţia soluţiei stoc
Volum de soluţie stoc de BAP necesar = 0,5mg/l . 3 l 1000 mg/l
71
=
1,5 l = 1,5 ml soluţiei stoc BAP 1000
În tabelul 3.4.5. sunt calculate câteva diluţii în funcţie de concentraţia dorită de hormoni, volumul de mediu de preparat şi concentraţia soluţiei stoc. Tabelul 3.4.5. Cantitatea de soluţie stoc necesară pentru a prepara un anumit volum de mediu cu concentraţia hormonilor cunoscută Concentraţia dorită (finală) - mg/l 250 ml 0,004 0,02 0,04 0,4 0,04 0,2 0,4 4,0 0,4 2,0 4,0 40,0 4,0 20,0 40,0 400,0
500 ml 0,002 0,01 0,02 0,2 0,02 0,1 0,2 2,0 0,2 1,0 2,0 20,0 2,0 10,0 20,0 200,0
1000 ml 0,001 0,005 0,01 0,1 0,01 0,05 0,1 1,0 0,1 0,5 1,0 10,0 1,0 5,0 10,0 100,0
2 litri 0,0005 0,0025 0,005 0,05 0,005 0,025 0,05 0,5 0,05 0,25 0,5 5,0 0,5 2,5 5,0 50,0
10 litri 0,0001 0,0005 0,001 0,01 0,001 0,005 0,01 0,01 0,1 0,05 0,1 1,0 0,1 0,5 1,0 10,0
Soluţia stoc de hormoni Concentraţia Necesar mg/l ml 0,01 0,1 0,5 1,0 10,0 0,10 0,1 0,5 1,0 10,0 1,0 0,1 0,5 1,0 10,0 10,0 0,1 0,5 1,0 10,0
Atunci când concentraţia soluţiei hormonale se exprimă cu ajutorul puterilor, raţionamentul este acelaşi:
1 mg/l = 1 . 10-6
Dacă concentraţia dorită de hormoni este, de exemplu 0,5 .10-6 şi se prepară 3 l de mediu având o soluţie stoc cu concentraţia de 1.10-3 se vor folosi 1,5 ml de soluţie stoc. Volumul de soluţie stoc necesar = 0,5.10-6 . 3 l = 1,5.10-3 l = 1,5 ml soluţie stoc 1.10-3 Frecvent se prepară soluţii stoc hormonale cu concentraţia 1.10-4 şi mai rar 1.10-3. 3.5. Prepararea mediului de cultură Prepararea mediului de cultură constă dintr-o suită de etape. După analizarea reţetei care se va folosi, se scot sticlele cu soluţiile stoc din frigider sau alte locuri de păstrare şi se aliniază în ordinea de pe reţetă. Alăturat propunem spre exemplificare modelul de reţetă de la Facultatea de Agricultură din Perugia, Italia (Standardi, A.), care conţine mediul folosit pentru faza de menţinere a actinidiei (tabelul 3.5.1.).
72
Într-un pahar Berzelius de dimensiuni corespunzătoare se pun aproximativ 400 ml de apă bidistilată după care se adaugă pe rând cantităţile (volumele) stabilite pentru fiecare soluţie stoc în parte, măsurate cu cilindri gradaţi sau pipete. Este indicat ca vasul cu mediu să fie plasat pe o plită cu agitator magnetic, uşurându-se astfel dizolvarea şi amestecarea componentelor. Fiecare substanţă introdusă se marchează pe reţetă pentru a evita omisiunile sau folosirea de două ori. După ce s-au introdus toate substanţele cu excepţia agarului se aduce la semn cu apă bidistilată şi se trece la corectarea pH-ului amestecând continuu. În funcţie de valoarea pH măsurată se titrează cu soluţie 0,1 N de KOH (NaOH) sau respectiv HCI, până la valoarea dorită. Se adaugă apoi agentul gelificant cântărit în prealabil şi se pregăteşte mediul pentru autoclavare. Din acest moment, se cunosc două practici diferite. Una dintre ele presupune autoclavarea mediului în vase de mare capacitate (1-2 l), urmată de repartizarea mediului topit în vasele de cultură sub hota sterilă. Vasele de cultură au fost în acest caz, sterilizate în prealabil prin autoclavare, în etuvă, sau la producător (în cazul vaselor de unică folosinţă). Avantajul acestei metode ar fi că necesită volume de spaţiu mai mici pentru autoclavare dar, după părerea noastră, este mai laborioasă întrucât necesită sterilizarea prealabilă a vaselor de cultură, creşte riscul infectării mediului în timpul distribuirii şi nu este aplicabilă la cantităţi mari de mediu (pe scară industrială). A doua posibilitate constă în topirea agarului în vasul iniţial cu mediu prin agitare pe o plită electrică sau baie marină. Agarul este topit când mediul devine limpede şi are culoare albă gălbuie. Acest lucru are loc când începe să apară primele bule de aer pe fundul vasului, semn că în scurt timp mediul dă în clocot.
73
U.Ş.A.M.V. – Bucureşti Facultatea de Horticultură
Tabelul 3.5.1.
FIŞA DE PREPARARE A MEDIULUI DE CULTURĂ Mediul (nr./sigla): specia:
actinidia
ml/recipient: 100
S 2,5
, preparat în 25/08 , pentru faza: multiplicare
, ml de mediu necesari: 100, recipiente:
, pH măsurat:
4,32 , pH dorit:
vase sticlă ,
5,5 , pH corectat cu
2,5 ml
de NaOH 0,1 N. Componente
Conc. Conc. dorită sol. mamă Săruri minerale Macroelemente Quoirin&Lepoivre X 10X Microelemente Quoirin&Lepoivre X 1000 X Chelat de fier X 200 X Vitamine / Aminoacizi Amestec Walkey 2 X 100 X Inozitol Gibereline GA-3 10-6 10-6 Altele Auxine ANA; AIA; IBA Altele Citochinine Benziladenina (BAP) 10-6 10-7 Altele Diverse
Zaharoza Altele Agar Altele
Cant. totală ml (g)/l 100 1 5 10
1
10
Zaharuri 2,5 %
25
Substanţe gelificante 0,7 %
7
Cantitatea totală de soluţii mamă ml: 127 Apa distilată pentru aducere la volum ml: 850 Substrat preparat de: ..............................................
74
,
ml (g) ptr. ml
În continuare, mediul este repartizat în vasele de cultură fie direct, fie cu ajutorul unor dispozitive care măsoară repetitiv şi debitează acelaşi volum de mediu. În eprubete se introduc în general 5-8 ml de mediu. În laboratoarele industriale, mediul este topit în cuve din inox prevăzute cu pompe aspiro-respingătoare cu debit reglabil. După repartizare vasele de cultură se închid (vezi subcapitolul 4.2.1.), se etichetează, precizând pe fiecare sigla mediului (eventual varianta) şi data preparării. Urmează apoi sterilizarea prin autoclavare. Atunci când se folosesc substanţe termolabile a căror sterilizare se face prin filtrare (0,2 µm), acestea se vor introduce în mediu după autoclavare, înainte de solidificarea acestuia. Mediul trebuie să fie cald dar nu fierbinte (35-37°C). Se va amesteca continuu pentru o cât mai bună omogenizare. O altă situaţie se întâlneşte la folosirea mediului de cultură în dublu strat. Acest tip de mediu prezintă un strat solid (cam 75-80% din volum) iar la suprafaţă are un strat de mediu lipsit de agentul gelificant. Pentru prepararea acestui mediu care prezintă multe avantaje (Stănică şi colab., 1996) înainte de introducerea agarului se separă cam 20-25% din volumul total şi se autoclavează separat. Mediul lichid se va repartiza după autoclavare şi răcirea (solidificarea) stratului bazal, sub hotă, în condiţii sterile. Pentru a reduce numărul de manipulări şi riscul infecţiilor, acest lucru se poate face şi în momentul inoculării, practic, după inocularea explantelor pe mediul solid. 3.6. Probleme care apar la pregătirea şi folosirea mediilor de cultură Prima problemă care poate apărea la prepararea mediilor de cultură este formarea unor precipitate insolubile. Aşa cum am mai precizat, cauza este nerespectarea ordinii la amestecarea unor compuşi, iar efectul este formarea fosfaţilor insolubili. Frecvent sărurile cu calciu se dizolvă şi se folosesc pentru prepararea unor soluţii stoc, separate de cele de macroelemente şi se adaugă doar în momentul preparării mediului. S-a mai observat formarea de precipitat atunci când se adaugă calciul şi fosforul şi mediul are pH-ul în jur de 5,6. Pentru reducerea riscului precipitării se recomandă folosirea unor soluţii stoc mai diluate de macroelemente (10X).
75
O altă problemă este nesolidificarea mediului de cultură după răcirea acestuia. Dintre cauze amintim: - cantitate prea mică de agar, sub 5-6 g/l; - depăşirea temperaturii la autoclavare; - ph-ul prea mic al mediului de cultură (sub 5,5); - agar foarte vechi. Mediile de cultură sunt amestecuri nutritive complexe şi constituie un suport ideal pentru instalarea şi dezvoltarea rapidă a unor microorganisme de tipul bacteriilor şi ciupercilor. Sursele de infecţii şi cauzele apariţiei acestora în mediile de cultură sunt multiple: -
soluţii stoc învechite, infectate cu bacterii şi ciuperci;
-
vase de cultură provenite din culturi infectate puternic, nespălate şi nedezinfectate corespunzător;
-
curăţenie deficitară în laborator;
-
autoclavare necorespunzătoare fie prin nerespectarea timpului,
fie a
temperaturii şi presiunii recomandate; -
închiderea necorespunzătoare a vaselor de cultură şi infectarea după autoclavare;
-
hotă necorespunzătoare care nu asigură sterilizarea totală a aerului în timpul inoculărilor;
-
tehnică de lucru deficitară, operatorul putând fi principalul vector al unor agenţi contaminanţi;
-
material biologic infectat şi deci sterilizat necorespunzător;
-
condiţii de curăţenie necorepunzătoare în camera de creştere;
-
o serie de acarieni, tripşi etc. pot pătrunde în vasele de cultură şi transporta agenţi contaminanţi.
În general în mediile de cultură se întâlnesc două tipuri de infecţii. Cele de origine bacteriană se caracterizează prin apariţia în jurul explantelor, la suprafaţa mediului sau în interior, a unui halou translucid de culoare albă-gălbuie sau divers colorat (foto 3.3. a). În mediile lichide creşte turbiditatea acestora. Infecţiile bacteriene sunt însoţite frecvent de un miros puternic, neplăcut.
76
Infecţiile micotice se recunosc prin formarea unor reţele miceliene pe care pot apărea fructificaţii de diferite culori (negre la Aspergillus sp., verzi-albăstrui la Penicillium etc.) (foto 3.3. b). Prezenţa fructificaţiilor creşte riscul răspândirii infecţiei în vasul de cultură dar şi în afara lui.
a b Foto 3.3. Infecţii mixte cu bacterii şi ciuperci în faza de iniţiere-stabilizare in vitro Dacă o infecţie este depistată în fază incipientă şi ea a afectat un singur explant dintr-un vas se poate încerca salvarea celorlalte explante, mai ales dacă este vorba de un material valoros. În acest sens, se vor repasa de urgenţă explantele aparent sănătoase în eprubete şi se va urmări evoluţia lor. O altă soluţie este sterilizarea explantelor aparent sănătoase şi repasarea lor, individual, pe un mediu nou.
a b Foto 3.4. Infecţii în faza de multiplicare in vitro (a– bacterii, b-Penicillium) Mediul poate de asemenea să-şi schimbe culoarea devenind brun ca urmare a emiterii de fenoli de către explante (foto 3.5.); prin oxidare aceşti fenoli determină 77
brunificarea mediului. Întrucât schimburile explantelor cu mediul se reduc drastic, se impune de urgenţă înlăturarea zonelor brunificate şi pasarea pe un mediu nou.
Foto 3.5. Emisie de fenoli în faza de iniţiere la mesteacăn (Betula pendula Laciniata) Pentru reducerea brunificărilor în continuare se poate apela la introducerea în mediu a unor substanţe antioxidante: - PVP (250-1000 mg/l); cărbune activ (0,2-3,0%); acid citric, acid ascorbic, tiouree, etc.; aminoacizi: L-cisteină, glutamină, arginină şi asparagină. Atunci când mediul este păstrat timp îndelungat înainte de a fi folosit sau închiderea vaselor de cultură este defectuoasă şi/sau umiditatea din camera de cultură este foarte scăzută, se constată deshidratarea mediului. Acest lucru este sesizat printr-o scădere puternică de volum şi eventual, prin apariţia de crăpături în mediu (foto 3.6.) .
Foto 3.6. Deshidratarea şi crăparea mediului la Gasteria sp. Explantele, în aceste condiţii, suferă datorită lipsei apei şi concentrării sărurilor şi zaharurilor (creşte mult presiunea osmotică). Se impune de urgenţă pasarea pe un alt mediu. 78
În anumite situaţii, la cultivarea unor explante pe mediu se observă că ţesuturile acestora cresc neuniform şi au un aspect vitros. Fenomenul denumit vitrificare sau sticlozitate este determinat de un ansamblu de factori care ţin în primul rând de mediul de cultură dar, uneori şi de materialul biologic înmulţit. Transformările pe care le suferă explantele vitrificate sunt multiple şi ele afectează cloroplastele, membranele şi mezofilul frunzelor, meristemele etc. Se constată o reducere a conţinutului în clorofilă şi o creştere a cantităţii de apă din frunză (aceasta ocupă până şi ţesuturile lacunare, Cachiţă, 1987) (foto 3.3.).
Foto 3.7. Lăstari vitrificaţi, regeneraţi din peţiol de kiwi (Actinidia sp.) Cauzele producerii acestui fenomen sunt legate de deficitul de agar, excesul de etilenă, excesul ionilor de NH4+, excesul de citochinine, în special BAP etc. Pentru salvarea explantelor vitrificate se impun o serie de măsuri: -
reducerea concentraţiei de săruri a mediului;
-
creşterea conţinutului de agar (determină reducerea capacităţii proliferative);
-
folosirea agarului hidrolizat reduce la minimum riscul apariţiei vitrificării;
-
folosirea unor inhibitori ai producerii de etilenă: ioni de argint, CaCl2, dinitrifenolul;
-
creşterea dozei de zaharoză.
Vitrificarea rămâne o problemă controversată şi se impun noi cercetări pentru elucidarea tuturor faţetelor acestui fenomen negativ.
79
Capitolul 4 Sterilizarea şi asepsia în culturile in vitro 4.1. Agenţi sterilizanţi Sterilizarea şi asepsia în culturile in vitro se realizează prin folosirea unor mijloace fizice şi chimice. Mijloacele chimice sunt reprezentate de un număr mare de agenţi sterilizanţi cu origine şi compoziţie diversă. Alcoolul etilic este folosit de regulă în concentraţie de 70%, deoarece alcoolul absolut (96%) determină deshidratarea rapidă a materialul vegetal. Calculul diluţiei alcoolului de 96% se face după schema de mai jos:
alcool 96%
70 ml alcool 70%
apă 0%
26 ml apă
Cunoscând concentraţia iniţială a alcoolului (96% volume alcool) se scade concentraţia dorită (70% volume alcool) şi se obţine, pe linia apei, cantitatea în ml, sau numărul de părţi de apă folosite la diluţie. Repetând apoi acelaşi lucru pe a doua diagonală, se obţine pe linia alcoolului cantitatea de alcool concentrat care va fi folosită, exprimată în ml sau părţi. În general, timpul de sterilizare în alcool este scurt (30-60 de secunde) însă se poate prelungi atunci când explantele sunt protejate de solzi, catafile etc. După introducerea în alcool, explantul se va spăla rapid prin plonjare în apa distilată. Sterilizarea în alcool este urmată frecvent de o sterilizare cu hipoclorit de sodiu sau calciu. Pentru fructe uscate, sâmburii, seminţele de orhidee sau unele plante puternic contaminate (muşcată), sterilizarea se face prin introducerea explantelor în alcool de 96%, flambarea rapidă şi răcirea în apă distilată sterilă.
80
Hipocloritul de sodiu (NaClO, apa de Javel) este folosit ca agent înălbitor pentru rufe. Majoritatea produselor comerciale conţin 10-20% substanţă activă. Pentru sterilizare se foloseşte însă o soluţie cu o concentraţie de 1,0-2,0%. Rareori concentraţia ajunge la 8,0%. Trebuie reţinut că hipocloritul de sodiu se descompune uşor şi nu poate fi păstrat o perioadă îndelungată. Hipocloritul de calciu (Ca(ClO)2) se foloseşte în situaţiile în care hipocloritul de sodiu se dovedeşte a fi toxic. Hipocloritul de calciu este condiţionat sub formă de pudră care se dizolvă destul de dificil în apă. Pentru prepararea soluţiei dezinfectante se dizolvă 35-100 g hipoclorit într-un litru de apă. Se face apoi filtrarea soluţiei prin vată sau hârtie de filtru cu pori mari pentru a înlătura particulele nedizolvate. Acestea, provoacă de regulă necrozarea ţesuturilor. Timpul de sterilizare variază între 5 şi 30 de minute, în funcţie de tipul de explant. După dezinfectarea cu hipoclorit de calciu, care este puternic alcalin, se recomandă introducerea în prima apă de spălare a unei cantităţi reduse de acid clorhidric pentru extragerea ionilor toxici de Cl-. Operaţia este urmată de 4-5 spălări succesive cu apă distilată. Trebuie precizat că suprafeţele secţionate ale explantelor se înălbesc sub acţiunea clorului. Aceste zone vor fi eliminate în momentul pregătirii explantului pentru inoculare întrucât celulele sunt moarte. Hipocloritul de calciu în soluţie este ceva mai stabil şi poate fi păstrat o perioadă îndelungată. Clorura mercurică (sublimatul, HgCl2) este o otravă puternică care se foloseşte sub formă de soluţie în concentraţie de (0,01-0,1%) timp de 2-15 minute. Concentraţia şi timpul de sterilizare se vor reduce în cazul organelor şi ţesuturilor tinere. Efectul sterilizant este puternic şi după folosire, sunt necesare 2-3 clătiri cu apă distilată sterilă. Apa oxigenată (perhidrolul) se poate folosi cu succes la sterilizarea materialului vegetal în concentraţie de 10-12%. De regulă, este folosită pentru prima sterilizare timp de 5-15 minute. Are avantajul că pătrunde în profunzime şi curăţă materialul vegetal prin efervescenţa pe care o produce. Apa oxigenată nu se recomandă să fie folosită la dezinfectarea explantelor provenite de la speciile cu conţinut ridicat de polifenoli deoarece determină oxidarea rapidă a acestora şi deci, brunificarea ţesuturilor.
81
Apa bromată (1-2%) se foloseşte timp de 2-10 minute şi are un efect sterilizant foarte bun. Azotatul de argint (1%) se foloseşte timp de 4-30 minute. Antibioticele preparate în soluţii de 4-100 mg/l pot fi folosite ca agenţi sterilizanţi mărind eficacitatea sterilizării. Pentru amestecul penicilină + streptomicină (1 mg/l) durata sterilizării este de 2 ore. În tabelul 4.1.1. sunt prezentate câteva dintre antibioticele şi substanţele antimicotice folosite mai frecvent ca agenţi sterilizanţi la dezinfectarea explantelor sau mediului de cultură. Prezenţa antibioticelor în mediu poate să determine apariţia unor mutaţii mai ales la culturile susceptibile în acest sens: culturi de calus, culturi de celule, etc. Din acest motiv, folosirea lor este relativ limitată. În anumite situaţii, se apelează însă la antibiotice pentru înlăturarea unor infecţii latente periculoase, dacă acestea au afectat un material biologic valoros. Pregătirea soluţiilor de antibiotice este relativ simplă. În marea lor majoritate antibioticele se prezintă sub formă de pulberi solubile în apă sau în câţiva solvenţi (DMSO, DMF, etanol, HCl, NaOH etc.). Fiecare preparat are marcată pe etichetă şi activitatea biologică exprimată în µg/mg sau unităţi/mg. În funcţie de aceasta se va calcula concentraţia soluţiei care se va prepara, respectiv cantitatea de antibiotic care se va folosi, astfel: cantitatea de antibiotic = volumul de mediu x concentraţia dorită activitate După solubilizarea în solventul corespunzător, antibioticul se va dilua cu apă distilată până la volumul dorit. Păstrarea soluţiei se face de regulă în frigider la 0-5°C, iar perioada de păstrare variază de la o zi până la trei luni sau chiar la un an. Majoritatea antibioticelor sunt termolabile motiv pentru care se recomandă sterilizarea lor prin filtrare prin membrane speciale (acetat de celuloză). Alte substanţe care pot fi folosite pentru sterilizare sunt clorura de var (de uz sanitar), cloramina, formolul, permanganatul de potasiu, etc.
82
Tabelul 4.1.1. Principalele antibiotice şi antimicotice folosite în culturile in vitro Specificaţie Amfotericină B Ampicilină Cicloheximidă Cloramfenicol Eritromicină Gentamicină sulfat Kanamicină Neomicin sulfat Nistatin Penicilină G Streptomicină sulfat Tetraciclină
Masă molec. 924,1 371,3 281,4 264,3 148,2 160,2 582,6 908,9 926,1 372,5 1457,4 444,4
Solvent
Diluant
DMSO, DMF apă etanol apă + NaOH HCl, etanol apă apă apă suspensie/apă apă apă apă
apă apă apă apă apă apă apă apă apă apă apă Na
Păstrare produs 0-5°C 0-5°C 0-5°C temp. cam. temp. cam. 0-5°C temp. cam. temp. cam. -0°C temp. cam. 0-5°C -0°C
Concentraţia folosită 2,5 mg/l 100 mg/l 10 µg/l 5 µg/l 100 mg/l 50 mg/l 100 mg/l 50 mg/l 50 mg/l 100.000 U/l 100 mg/l 10 mg/l
4.2. Sterilizarea vaselor de cultură şi a instrumentarului folosit 4.2.1. Închiderea vaselor de cultură Vasele de cultură trebuie prevăzute cu dopuri şi capace adecvate care să prevină deshidratarea mediului de cultură, pătrunderea unor agenţi contaminaţi din exterior şi acumularea unor gaze nocive în atmosfera vasului (CO2, etilenă etc.). În acelaşi timp, acestea trebuie să permită aprovizionarea cu oxigen din exterior. Principalele mijloace şi materiale folosite pentru închiderea vaselor de cultură sunt: - dopurile din vată. De regulă, se realizează prin învelirea vatei cu tifon după o prealabilă presare a acesteia. Aceste dopuri au dezavantajul că nu pot fi sterilizate prin flambare în momentul folosirii. O altă variantă este reprezentată de dopurile din vată învelite într-o folie de aluminiu care înlătură în bună măsură dezavantajele primelor. Având în vedere că la prima sterilizare dopurile de vată elimină o substanţă toxică, înainte de folosirea dopurilor noi, se va face autoclavarea acestora. Periodic, este necesar ca această autoclavare de siguranţă să se repete. - dopurile din plută pot fi folosite pentru eprubete, vase Erlenmayer şi alte vase de cultură cu deschiderea îngustă. Este necesară de asemenea autoclavarea lor, iar în cazul în care provin de la vase cu mediu infectat, se vor lua măsuri suplimentare de sterilizare (foto 4.1.). - dopurile din cauciuc, sunt practice pentru că se pot spăla şi dezinfecta uşor în alcool. Sterilizarea prin flambare în momentul inoculării este contraindicată şi trebuie
83
realizată rapid pentru a evita aprinderea cauciucului şi degajarea gazelor toxice în atmosfera vasului de cultură (foto 4.2.).
Foto 4.1. Dopuri din plută
Foto 4.2. Dopuri din cauciuc
- dopurile din steristop sunt realizate dintr-o celuloză poroasă. Acestea trebuie de asemenea, protejate cu folie de aluminiu pentru a le face mai practice. - capacele metalice trebuie să aibă un sistem adecvat de fixare la gura vasului de cultură. Sunt opace şi necesită pentru etanşare folosirea foliei de aluminiu sau a foliei de plastic autosigilante. În acelaşi fel, se pot utiliza capace din plastic rezistent la autoclavare. În cazul capacelor prevăzute cu filet se va avea grijă ca la închidere să nu se înşurubeze prea tare, pentru a se evita vidarea interiorului prin autoclavare şi pentru a permite circulaţia aerului după inoculare. - capacele din sticlă au avantajul că permit pătrunderea luminii pe la partea superioară a vasului de cultură. Necesită sisteme suplimentare pentru fixare şi etanşare. În anumite situaţii, pentru acoperirea vaselor de cultură se pot folosi vase Petri. - folia de aluminiu este mult folosită la închiderea vaselor de cultură. Poate fi refolosită dar are dezavantajul că uneori permite pătrunderea agenţilor patogeni din exterior şi infectarea mediului de cultură. - folia din material plastic (Parafilm, Vitafilm, folia din PVC, folia din polipropilenă) poate fi folosită ca atare sau de regulă este folosită pentru etanşarea corespunzătoare a altor sisteme de închidere prezentate anterior. Etanşarea trebuie să evite deshidratarea mediului de cultură dar să permită schimbul activ de gaze între atmosfera interioară şi exterior. La alegerea sistemului şi materialului pentru închiderea vaselor de cultură (Pierik, 1987), trebuie ţinut cont de faptul că:
84
- dacă vasul este închis ermetic nu este posibilă schimbarea de CO2, O2 şi etilenă cu exteriorul. Acumularea CO2 şi etilenei în interior precum şi lipsa oxigenului au consecinţe nefaste. De regulă, polipropilena şi folia de aluminiu subţire etanşează perfect nepermiţând realizarea acestor schimburi gazoase. Cultivarea explantelor de Magnolia soulangeana în vase de cultură ermetic închise a determinat clorozarea plantelor datorită acumulării excesive de CO2 şi etilenă. În aceste situaţii se impune folosirea unor substanţe speciale absorbante ale etilenei (Ethy-sorb). În prezent se realizează capace din polipropilenă prevăzute cu membrane semipermeabile care înlătură aceste neajunsuri. - anumite materiale sintetice folosite pentru realizarea vaselor de cultură, a dopurilor sau capacelor elimină etilena care se poate acumula astfel în atmosfera interioară şi poate declanşa simptome de toxicitate. - în cazul unui vas de cultură închis etanş, evaporarea apei din interior este blocată. În acest caz, umiditatea foarte ridicată determină apariţia vitrificării. - sistemele de închidere opace reduc accesul luminii în interiorul vasului de cultură. Pentru eprubete situaţia se poate rezolva prin aşezarea acestora în camera de cultură, în poziţie înclinată, pe suporţi speciali. Prin răcirea mediului ţinând eprubetele înclinate, se realizează în plus mărirea suprafeţei de contact a acestuia cu atmosfera vasului şi uşurarea schimburilor gazoase. 4.2.2. Sterilizarea vaselor de cultură Recipientele din sticlă trebuie supuse unei sterilizări prealabile. După spălarea acestora se autoclavează pentru eliminarea unor compuşi toxici înainte de folosire pentru cultură. Vasele de cultură folosite trebuie spălate cu atenţie cu apă caldă şi detergent, clătite repetat cu apă distilată sau apă deionizată şi zvântate cu grijă. Spălarea se face manual sau mecanic, folosind dispozitive simple cu perii rotative sau maşini de spălat performante. Există şi dispozitive speciale de spălat cu ultrasunete (foto 2.7.). Pentru vasele care se curăţă greu se recomandă folosirea amestecului cromic în care vasele se menţin timp de patru ore. Amestecul cromic se obţine din bicromat de potasiu şi acid sulfuric. Pentru început se prepară 100 ml de soluţie saturată de bicromat de potasiu prin dizolvarea la cald a 30 g
85
de bicromat de potasiu în 70 ml apă distilată. Se adaugă apoi treptat (agitând balonul în apă rece), 300 ml de acid sulfuric concentrat. Preparatul are o culoare brună-portocalie, este foarte toxic, coroziv şi oxidant. După folosire se recuperează şi se poate refolosi. Când se uzează culoarea devine verde. Vasele spălate cu amestec cromic se vor clăti cu atenţie, fără a face stropi care bine-nţeles sunt corozivi. În cazul vaselor de cultură cu medii puternic infectate, după o spălare corespunzătoare se impune sterilizarea acestora în etuvă la 160°C, timp de cel puţin 3 ore. Se va evita depăşirea temperaturii de 180°C pentru a se evita deteriorarea calităţii sticlei. Celelalte obiecte de sticlărie care se folosesc, se ambalează în hârtie sau folie de aluminiu şi se sterilizează în etuvă la 120°C, timp de 1-2 ore. Sterilizarea se poate face şi la umed în autoclav la 120-121°C, reducând timpul de autoclavare la 30-40 de minute. În acest caz, se recomandă folosirea foliei de aluminiu, a foliei autosigilante sau a unor pupinele speciale pentru autoclavare. Dopurile şi capacele, în funcţie din materialul din care sunt confecţionate, se spală şi se sterilizează prin autoclavare. În cazul în care culturile sunt sănătoase, pentru reducerea cheltuielilor şi a pierderilor de timp se va face sterilizarea vaselor de cultură şi a mediului prin autoclavare, după repartizarea acestuia. În prezent, se folosesc o serie de recipiente de cultură sau auxiliare de diferite forme şi mărimi de unică folosinţă. Acestea se livrează în pungi din polietilenă etanşe care se deschid în momentul folosirii, sub hota cu flux laminar. La producător, recipientele din plastic se sterilizează prin radiaţii gamma (2000 r) sau mai frecvent, cu oxid de propilenă. 4.2.3. Sterilizarea instrumentarului Instrumentarul metalic folosit la secţionarea explantelor şi la pasarea lor pe mediu (bisturie, ace spatulate, pense etc.) trebuie sterilizat frecvent. Acest lucru se face de regulă, înaintea şi în timpul lucrului, prin flambare. În acest sens sub hotă va exista un recipient cu spirt (96% vol. alcool) în care instrumentele respective se introduc. Se face apoi flambarea propriu-zisă la flacăra unui bec de gaz sau a unei spirtiere şi aşezarea pe un suport pentru a
86
se răci. Se recomandă ca, după fiecare explant manipulat, să se facă sterilizarea prin flambare a instrumentelor şi schimbarea acestora cu altele sterile. Foarte importantă este înlocuirea periodică a alcoolului folosit pentru flambare, deoarece prin evaporare, concentraţia sa scade, arderea este necorespunzătoare. Există astfel riscul ca sterilizarea să fie ineficientă, infecţia transmiţîndu-se prin intermediul instrumentelor. Un alt mijloc folosit pentru sterilizarea instrumentelor este sterilizatorul (incineratorul) electric (foto 4.3.). Acesta prezintă un corp găurit din cărămidă refractară în interiorul căruia, cu ajutorul unor rezistenţe electrice, temperatura creşte până la aproximativ 871°C. Timpul de sterilizare este de 1 minut.
Foto 4.3. Sterilizator electric pentru instrumentar O altă variantă o reprezintă sterilizatorul cu bile din sticlă (foto 4.4.) între care se introduc instrumentele de sterilizat. Şi în acest caz, temperatura de sterilizare este în jur de 250°C, iar timpul de sterilizare de 10-15 secunde. În nici un caz instrumentele nu se vor lăsa în interior mai mult de 1 minut, chiar dacă sterilizatorul este prevăzut cu un termostat. Timpul de răcire este de aproximativ 30-60 de secunde.
Foto 4.4. Sterilizator electric cu bile din sticlă
87
Sterilizatoarele prezentate sunt foarte eficiente împotriva germenilor rezistenţi la căldură (flambare) şi la alcool. Este vorba de bacterii din genul Bacillus, aşa-numitele “bacterii curate”, care supravieţuiesc sterilizării obişnuite prin flambare. Pe lîngă instrumentele cu care se lucrează, este nevoie să se sterilizeze la introducerea sub hota sterilă, lupele binocular, microscoapele, vasele cu mediu proaspăt sau cele provenite din camera de culturi şi în general, orice obiect care se introduce din afară. Sterilizarea se face în acest caz prin pulverizarea obiectelor respective cu alcool (96% vol. alcool) şi prin ştergere cu vată îmbibată în alcool. 4.3. Sterilizarea mediului de cultură şi a apei Întrucât mediul de cultură reprezintă un suport ideal pentru creşterea unor bacterii şi ciuperci nedorite se impune sterilizarea acestuia înainte de folosire. În cazul în care se poate face autoclavarea mediului în aceeaşi zi, după corectarea pH-ului, acesta se va păstra în frigider, urmând ca zaharoza şi agarul să fie adăugate înainte de autoclavare. Pentru a repartiza mediul de cultură în vase, după ce s-a făcut corectarea pH-ului şi s-au adăugat agarul, zaharoza şi eventual cărbunele activ, se aşează recipientul cu mediu pe o plită electrică cu agitator magnetic pentru solubilizarea agarului.
Foto 4.5. Plită electrică cu agitator magnetic
88
Operaţia este încheiată când mediul devine perfect transparent şi dispar particulele de agar aflate în suspensie. Acest lucru este marcat şi de apariţia primelor bule de aer la fundul vasului, indicând începutul fierberii. Pentru dizolvarea agarului în mediul de cultură se folosesc şi recipienţi speciali din oţel inoxidabil, prevăzuţi cu rezistenţe electrice şi agitare magnetică. Pentru repartizarea mediului de cultură în vase se pot folosi seringi dozatoare de mică capacitate (1-10 ml) care permit reglarea volumului de mediu distribuit (foto 2.4. şi 2.5.) precum şi dozatoare cu pompe aspiro-respingătoare pentru volume mai mari de mediu (50-100 ml/vas) (foto 2.6.). După repartizarea mediului vasele de cultură se închid şi se etichetează precizând sigla mediului şi data preparării. Autoclavarea se face în autoclave speciale electrice sau cu gaz, prevăzute cu instrumente pentru controlul temperaturii şi presiunii, temporizatoare şi dispozitive de siguranţă. Timpul de sterilizare este corelat cu volumul de mediu existent în vasele de cultură variind în general de la 15 minute la 30-40 de minute. Timpul minim de autoclavare este compus de fapt din timpul necesar mediului de cultură pentru a ajunge la temperatura de 121°C, la care se adaugă 15 minute de sterilizare propriu-zisă la aceeaşi temperatură. Temperatura optimă pentru autoclavare este de 121°C în prezenţa aburilor ceea ce corespunde cu o presiune de 1 atm (1,05 kg/cm2). Alţi autori (Gautheret, 1959) recomandau autoclavarea mediilor la 115°C timp de o oră (volume de 3-5 litri) şi repetarea autoclavării după 24 ore. Această tehnică ar reduce degradarea unor componenţi termolabili. În lipsa unor autoclave speciale, sterilizarea mediului se poate face şi în oale de gătit sub presiune (tip Kukta). Şi în acest caz se va face sterilizarea mediului introducând în oală un strat corespunzător de apă pentru formarea aburilor. Timpul de sterilizare se va măsura din momentul în care ies primii aburi din supapa de siguranţă.
89
Tabelul 4.3.1. Corelaţia dintre timpul minim de sterilizare şi volumul de mediu existent în vasul de cultură Volumul de mediu din vas Timpul minim de autoclavare ml min 25 20 50 25 100 28 250 31 500 35 1000 40 2000 48 4000 63 În toate cazurile, pentru a se realiza răcirea rapidă a mediului, autoclavele vor fi deschise numai după ce s-a realizat depresurizarea incintei. Substanţele termolabile: giberelinele, zeatina, ureea, piridoxina, tiamina, glutamina, etc. se vor steriliza prin filtrare, după autoclavarea mediului de bază. Sterilizarea prin filtrare se poate realiza şi pentru întreaga cantitate de mediu (fără agar). Acest lucru este posibil folosind nuci filtrante din sticlă cu porozitate de 1 micron (filtru Jena tip F şi Pyrex tip 5H) sau filtre de unică folosinţă tip Millipor (foto 4.6.) cu porozitate de 0,5-0,2 microni. În primul caz se folosesc seringi şi vase din sticlă în timp ce sistemul Millipor presupune folosirea unor seringi de unică folosinţă. Filtrele Millipor trebuie spălate înainte de folosire cu apă distilată sterilă pentru a îndepărta urmele de detergent pe care le conţin. Sterilizarea prin folosirea la rece este o metodă greoaie şi poate fi aplicată doar pentru mediile lichide. Uneori pentru uşurarea filtrării se folosesc dispozitive de filtrare care se racordează la pompa de vid (foto 4.7.).
Foto 4.6. Filtre de unică folosinţă
Foto 4.7. Sistem de filtrare sub vid 90
Sterilizarea “la rece” a unor substanţe termolabile, se poate face şi prin amestecarea acestora (dizolvarea) cu alcool etilic, eter etilic, acetonă în incintele sterile. După evaporarea substanţelor sterilizante, substanţa termolabilă se repartizează în mediu. O altă practică folosită, este introducerea unor substanţe sterilizante în mediul de cultură. Aceste substanţe împiedică dezvoltarea ciupercilor şi bacteriilor. Ca agenţi sterilizanţi se foloseşte o gamă largă de antibiotice (penicilină, streptomicină, cloranfenicol), conservanţi alimentari (salicilat, etc.) sulfamide, oxid de propilenă (1 ml, la 20 ml mediu). Apa folosită pentru diferite faze ale culturilor in vitro, dar mai ales pentru clătirea explantelor după sterilizare, trebuie să treacă şi ea printr-un proces de sterilizare. Acest lucru se realizează prin autoclavare în recipiente din sticlă. Închiderea vaselor nu se va face etanş, pentru a se permite aburilor sub presiune să intre în interior. Frecvent, în apa folosită pentru sterilizare se introduc substanţe antioxidante (PVP, 0,1%). 4.4. Dezinfectarea materialului vegetal Înaintea folosirii pentru culturile in vitro, materialul vegetal trebuie pregătit cu minuţiozitate. Această pregătire diferă în funcţie de provenienţa materialului respectiv: câmp sau spaţii protejate. Materialul vegetal provenit din câmp are un grad de infecţie sporit, motiv pentru care înainte de a fi folosit trebuie supus unor operaţii suplimentare de pregătire: -
mugurii se vor folosi înainte de a se deschide şi când sunt încă protejaţi de catafile;
-
dacă materialul este reprezentat de ramuri cu muguri acestea se vor parafina la vârf şi vor fi puse în vase cu apă pentru forţare. În prealabil, se recomandă îmbăierea lor într-o soluţie de fungicid (Topsin 0,1%; Ronilan, Rovral, Benlate);
-
dintre lăstari se vor alege întotdeauna lăstarii cei mai tineri şi porţiunile finale ale lăstarilor;
-
dacă este posibil, plantele se vor transfera din câmp în containere, în sere sau camere de creştere şi se vor folosi numai părţile crescute ulterior. Reducerea gradului de infecţie a materialului iniţial provenit din spaţii închise (sere, solarii) se poate face prin:
-
reducerea atacului de insecte vectoare care pot transporta agenţi patogeni;
91
-
prevenirea atacului de bacterii şi ciuperci prin aplicarea tratamentului cu fungicide sistemice şi de contact;
-
irigarea plantelor folosind sisteme de udare la sol: picurare, scurgerea la suprafaţă etc.
-
păstrarea la valori scăzute a umidităţii în sere;
-
zvântarea plantelor înainte de dezinfectare. Tipul de organ folosit pentru inoculare este de asemenea determinant pentru alegerea modului de dezinfectare şi a agentului sterilizant. În general, bulbii, tuberculii, rădăcinile tuberizate şi alte organe subterane, au un
grad ridicat de infecţie. Dacă este posibil, aceste organe vor fi puse în prealabil la forţare pentru a obţine noi creşteri (lăstari) care vor fi folosite apoi pentru inoculare. Dacă însă se urmăreşte inocularea unor muguri, fragmente de disc, catafile etc., se va spăla foarte bine materialul şi se vor lua măsuri suplimentare de dezinfectare. Mugurii pubescenţi, ramurile cu lentile numeroase, tulpinile, lăstarii sau frunzele pubescente se dezinfectează greu datorită fixării germenilor pe formaţiunile respective şi datorită dificultăţii cu care agentul sterilizant pătrunde la suprafaţa organului respectiv. Reducerea tensiunii superficiale a lichidului dezinfectant se face prin adăugarea câtorva picături de detergent lichid (Tween 20 sau 80). Pentru a favoriza pătrunderea dezinfectantului în profunzime, sub solzi sau printre perişori, se poate face şi dezinfectarea sub vid folosind un vas ataşat la o pompă de vid (foto 4.7.). Metoda de dezinfectare folosită va ţine seama întotdeauna de natura suprafeţelor care urmează să fie dezinfectate. Se va lua în calcul de asemenea, permeabilitatea epidermelor sau învelişurilor pentru agentul sterilizant şi se va ţine cont de modul în care acesta poate afecta viabilitatea ţesutului ţintă. La dezinfectarea unor explante aflate în organe de rezervă, rizomi, bulbi, tuberculi, a unor muguri (atunci când se urmăreşte prelevarea meristemelor, a unor sâmburi şi seminţe protejate de endocarp sau tegumente puternice, a unor fructe uscate etc., se pot folosi concentraţii ridicate şi timpi de dezinfecţie mari. Pentru îmbunătăţirea efectului dezinfectant se recomandă câteva măsuri: - înlăturarea părţilor exterioare ale organelor: solzi protectori, catafile, etc. - spălarea intensă cu apă a materialului vegetal înainte de dezinfectare;
92
- scufundarea explantelor pentru câteva secunde în alcool de 70% înaintea dezinfectării chimice. Operaţia are ca scop eliminarea bulelor de aer de la suprafaţa explantului şi uşurarea pătrunderii agentului chimic; - adăugarea unor detergenţi (Tween 20 sau 80) în soluţia de dezinfectat în concentraţie de 0,08-0,12% pentru reducerea tensiunii superficiale a acesteia; - agitarea în timpul dezinfectării, manual, sau cu un agitator magnetic; - folosirea dezinfectării sub vid pentru o mai bună impregnare a explantului cu agentul dezinfectant. 4.5. Contaminările şi detectarea lor Cauzele apariţiei infecţiilor în vasele de cultură pot fi multiple: -
dezinfectarea ineficientă a inoculilor iniţiali;
-
infecţii interne;
-
tehnică de lucru necorespunzătoare: mâini murdare, masă de lucru nesterilizată, unelte nesterilizate, îmbrăcăminte murdară, instrumentar nesterilizat corespunzător etc.
-
hotă improprie: filtre îmbâcsite cu praf, flux de aer necorespunzător ca uniformitate şi viteză, orificii în filtre sau la locurile de îmbinare etc.
-
alcool pentru flambarea instrumentarului contaminat. Prin folosirea îndelungată sub hotă alcoolul se evaporă şi scade concentraţia;
-
vasele de cultură au pe pereţii exteriori agenţi patogeni (păstrare în spaţii neadecvate);
-
camera de inoculare murdară, nespălată şi nedezinfectată periodic;
-
camera de inoculări nu este sterilă;
-
accesul persoanelor străine neechipate corespunzător;
-
pătrunderea în vasele de cultură a unor vectori (acarieni etc.) etc. În anumite situaţii culturile sunt aparent sterile dar în momentul divizării explantelor şi trecerii pe un alt mediu, sau prin pasarea pe un mediu bogat, se constată o infecţie masivă. Acest lucru se datorează faptului că agentul patogen se află în ţesuturi sau nu se dezvoltă pe un mediu sărac. Infecţiile latente (interne) reprezintă o problemă serioasă pentru culturile in vitro.
Ele se datorează unor agenţi patogeni aflaţi în interiorul plantei şi care nu pot fi distruşi prin dezinfecţie exterioară.
93
Pentru rezolvarea acestei probleme ar fi posibilă cultura de meristeme şi folosirea antibioticelor în mediul de cultură. Acestea din urmă însă, au deseori efecte fitotoxice. În mod normal, se folosesc combinaţii de antibiotice diferite pentru a obţine un efect acceptabil. Unii autori afirmă că folosirea antibioticelor stimulează creşterea explantelor. Pentru identificarea infecţiilor latente se recomandă cultivarea unor explante pe medii bogate care conţin peptone sau triptone (2-3%) sau folosirea unor soluţii pentru incubat care devin tulburi în prezenţa bacteriilor. Există bacterii Bacillus licheniformis, B. subtilis rezistente la mijloacele comune de sterilizare care terorizează laboratoare întregi (în laboratoarele din S.U.A. au fost denumite “Fantoma albă” - “White ghost”). Tabelul 4.5.1. Medii folosite pentru identificarea infecţiilor bacteriene latente Substanţa PPLO (Difco) Triptone Glucoză Fructoză Zaharoză Sorbitol Extract de drojdie (soluţie 25%) Ser de cal Roşu de fenol Peptone de cazeină Peptone de soia Agar NaCl NH3PO4 K2HPO4 MgSO4 . 7H2O
A g/l 21,0 10,0 1,0 1,0 10,0 70,0 100,0 (ml) 200,0 25,0 -
94
B g/l 1,0 5,0
C g/l 15,0 -
D g/l 24,0 2,4
5,0 15,0 1,0 -
5,0 15,0 5,0 -
1,2 1,2 1,2 0,48
Capitolul 5 Microînmulţirea plantelor horticole 5.1. Consideraţii generale Microînmulţirea plantelor in vitro prezintă o serie de avantaje (Pierik, 1987) care au impus-o în faţa celorlalte metode de înmulţire: generativă şi vegetativă clasică: - înmulţirea in vitro este mult mai rapidă decât in vivo, într-un an dintr-un explant fiind posibil să se obţină peste 1 milion de exemplare; - multe specii care nu pot fi înmulţite in vivo sau care se înmulţesc greu, pot fi înmulţite in vitro în urma parcurgerii unui proces de juvenilizare; - creşterea plantelor înmulţite in vitro este mai puternică fapt datorat juvenilizării şi devirozării. La căpşun, Cameron şi colab. (1986) a observat că, creşterea mai puternică a explantelor obţinute in vitro se datorează modificărilor survenite în schimburile gazoase ale acestora; - este posibilă obţinerea şi înmulţirea plantelor libere de virusuri cu toate avantajele care decurg de aici; - plantele cultivate in vitro pot fi transportate în condiţii de siguranţă fitosanitară desăvârşite putând fi schimbate, exportate sau importate; - pentru iniţierea unui culturi in vitro este nevoie de o cantitate redusă de material biologic. Pentru amelioratori acest lucru este foarte important încât se poate realiza o selecţie drastică a materialului biologic şi în plus, se pot înmulţi indivizi deosebiţi obţinuţi prin hibridări sau mutante apărute; - se realizează importante economii de teren, spaţiu, energie şi combustibil; - oferă posibilitatea controlului total al factorilor de mediu, fapt ce duce la creşterea productivităţii şi eficienţei culturilor şi la înlăturarea periodicităţii producţiei determinată de anotimpuri. Se poate, de asemenea planifica producţia de plante obţinute in vitro în funcţie de necesităţile concrete ale pieţii; - înmulţirea in vitro permite obţinerea plantelor pe rădăcini proprii, înlăturând altoirea cu toate dezavantajele pe care aceasta le presupune; - materialul produs in vitro poate să fie conservat prin diferite metode şi folosit în momentul în care este cerut;
95
- pentru ameliorarea plantelor microînmulţirea in vitro oferă avantaje suplimentare: • se scurtează timpul necesar producerii şi lansării unui soi; • se pot obţine şi înmulţi clone homozigote care să fie folosite pentru producerea hibrizilor F1; • prin utilizarea agenţilor mutageni în diferite faze şi tipuri de culturi in vitro se pot obţine şi selecţiona mutante valoroase. Procedeul este folosit mai ales la cultura de calus şi la regenerarea de lăstari adventivi din mezofil; • prin cultura explantelor in vitro în condiţii extreme, se poate realiza stres-selecţia genotipurilor noi (ex. rezistenţa la sărături); • manipulările genetice de tipul hibridărilor somatice nu se pot concepe fără folosirea culturilor de celule şi protoplaşti in vitro; • anumite plante necesită înmulţire vegetativă exclusivă: haploizii, mutantele sterile, liniile mascule sterile folosite la hibridări, aneuploizii sau heterozigoţii deosebiţi; • materialul genetic valoros poate fi conservat în bănci de gene sub formă de explante in vitro. Folosirea microînmulţirii in vitro este limitată uneori de anumite dezavantaje: - în anumite situaţii, stabilitatea genetică a materialului înmulţit in vitro este redusă; - plantele înmulţite in vitro prezintă uneori defecte caracteristice şi după ce sunt trecute in vivo: juvenilitate accentuată manifestată prin frunze necaracteristice, prezenţa spinilor etc., lăstărire adventivă, fructificare întârziată, vigoare exagerată, pierderea caracterului dominant; - uneori înrădăcinarea explantelor înmulţite in vitro este greoaie sau imposibilă. De regulă, rădăcinile formate in vitro au o funcţionalitate redusă, ele fiind înlocuite de alte rădăcini în faza de aclimatizare; - aclimatizarea plantelor obţinute in vitro este foarte dificilă datorită unor modificări morfo-anatomice şi fiziologice care apar pe durata cultivării in vitro. Pentru realizarea aclimatizării trebuie construite structuri speciale, sere, solarii dotate cu dispozitive de control al factorilor de mediu; - clonarea exagerată favorizează creşterea riscurilor de distrugere în masă a unor clone de către rase virulente de boli şi dăunători apărute ulterior. Pentru evitarea acestor situaţii se va opta pentru varianta înmulţirii şi plantării multiclonale; - capacitatea regenerativă a explantelor poate să se reducă sau să se piardă prin culturi repetate, după un număr mare de subculturi; 96
- în anumite situaţii, sterilizarea totală a materialului iniţial este dificilă sau imposibilă; - microînmulţirea in vitro presupune existenţa unor structuri specializate şi a unei forţe de muncă calificate. 5.2. Fazele microînmulţirii in vitro 5.2.1. Pregătirea materialului vegetal Prima fază a microînmulţirii in vitro este o fază importantă mai ales pentru speciile lemnoase care trebuie să treacă printr-o fază de juvenilizare. Juvenilizarea materialului biologic ce urmează să fie înmulţit in vitro, se poate realiza prin: - tăieri repetate, puternice, fiind stimulate astfel creşterile noi; - prin butăşire; - prin altoiri repetate sau microaltoire. Materialul biologic juvenil se poate obţine şi prin germinarea sâmburilor şi seminţelor atunci când este posibil. În acelaşi timp, faza de pregătire presupune cultivarea plantelor destinate prelevării de explante, în spaţii închise pentru prevenirea sau reducerea contaminărilor sau pentru efectuarea unor tratamente fitosanitare eficiente. Se recomandă cultivarea plantelor în sistem hidroponic sau alte sisteme „hors sol”. Pentru iniţierea culturii, în perioada de repaus, ramurile sunt forţate în camera de creştere în vederea umflării mugurilor şi pornirii în creştere a lăstarilor (foto 5.1.)
Foto 5.1. Ramuri anuale de fag puse la forţare
97
5.2.2. Iniţierea şi stabilizarea Faza de iniţiere şi stabilizare a culturilor in vitro presupune, sterilizarea materialului vegetal, izolarea explantelor (meristeme, apexuri, fragmente uninodale, seminţe, frunze etc.) şi inocularea acestora pe un mediu de iniţiere (foto 5.2., 5.3.).
Foto 5.2. Apexuri de lăstari de fag în faza de iniţiere şi stabilizare Mediile de iniţiere sunt în general variante ale mediilor obişnuite, recomandate pentru specia respectivă, având însă concentraţia de săruri redusă la jumătate. Frecvent în această fază, se folosesc reţete de medii lipsite de hormoni.
Foto 5.3. Plantulă de cicoare (Cichorium intybus) obţinută prin germinare in vitro (Diaconescu O., 2002)
98
De asemenea, este importantă realizarea culturii aseptice şi începerea creşterii explantelor. Pentru depistarea infecţiilor latente sunt necesare teste suplimentare pe medii bogate în zaharuri, peptone, etc. 5.2.3. Multiplicarea Faza de înmulţire (multiplicare) se întinde pe mai multe subculturi cu o durată de 34 săptămâni. În această fază, scopul principal este creşterea ratei de multiplicare în condiţiile menţinerii stabilităţii genetice a materialului. Creşterea ratei de multiplicare se poate obţine prin stimularea lăstării axilare (foto 5.4.), prin stimularea alungirii lăstarilor, sau prin ambele metode simultan (foto 5.5., 5.6.).
a b Foto 5.4. Multiplicarea prin lăstărire axilară la cicoare (a) şi hosta (b)
Foto 5.5. Începerea multiplicării la Hakonechloa aureola-graminee ornamentală
Foto 5.6. Multiplicarea la măr – soiul Fuji
99
Acest deziderat se realizează, în general, prin creşterea cantităţii de citochinine din mediu sau, prin realizarea unui balanţe hormonale înclinate în favoarea citochininelor. Numărul de subculturi trebuie să fie limitat (variază cu specia) şi orice prelungire a fazei respective necesită verificări suplimentare a stabilităţii genetice a materialului. 5.2.4. Înrădăcinarea Faza de înrădăcinare sau de pregătire a materialului pentru trecerea in vivo este o fază importantă care constă în reducerea lăstăririi axilare, stimularea alungirii lăstarilor, inducerea formării rădăcinilor sau chiar formarea rădăcinilor (foto 5.7.).
Foto 5.7. Rozete de Gasteria înrădăcinate in vitro Frecvent în această fază, se folosesc medii de cultură adiţionate cu cărbune vegetal, lipsite de hormoni sau cu concentraţii mai ridicate în auxine (Stănică şi colab. 2003). O altă variantă constă din cultivarea pe un mediu cu concentraţie ridicată de auxine o anumită perioadă urmată de cultivarea pe un mediu fără hormoni. Din raţiuni economice, însă, tot mai multe laboratoare industriale optează pentru realizarea înrădăcinării simultan cu aclima-tizarea (foto 5.8.).
100
Foto 5.8. Înrădăcinarea in vivo a lăstarilor de smochin, simultan cu aclimatizarea 5.2.5. Aclimatizarea Faza de aclimatizare este cea mai dificilă etapă în producerea materialului microînmulţit. Lăstarii înrădăcinaţi sau cu primordii de rădăcini sunt trecuţi în amestecuri de pământ (foto 5.9.) şi apoi menţinuţi într-un spaţiu caracterizat prin umiditate relativă ridicată şi temperatură controlată (foto 5.10.).
Foto 5.9. Transferul plantelor obţinute in vitro pentru înrădăcinare şi aclimatizare in vivo la firma Vitroplant, Italia
101
Foto 5.10. Solar pentru aclimatizarea plantelor obţinute in vitro la firma Vitroplant, Italia
Înainte de a fi folosit pentru producţie materialul săditor de pomi şi viţă de vie trebuie să fie plantat în câmp sau solar, pentru creştere şi fortificare (foto 5.11., 5.12., 5.13.).
Foto 5.11. Plantă de smochin aclimatizată înaintea fortificării
Foto 5.12. Şcoală pentru fortificarea materialului săditor microînmulţit de actinidia la firma Vitroplant Cesena, Italia
102
Foto 5.13. Plante de măslin înmulţite in vitro la încheierea procesului de fortificare în solar (Vitroplant, Cesena, Italia) 5.3. Cultura de meristeme şi apexuri Plantele superioare deţin ţesuturi cu o mare capacitate de proliferare care au ca rol creşterea în lungime a unor organe, îngroşarea altora şi chiar generarea de noi organe atât la nivelul tulpinii cât şi al rădăcinii. Aceste ţesuturi denumite meristeme de creştere, sau simplu, meristeme, sunt alcătuite din celule bogate în citoplasmă, cu numeroase mitocondrii, cu nucleu mare şi cu vacuole reduse ca dimensiuni. Pereţii celulari sunt subţiri, celulozici iar forma celulelor variază de la poligonală la tabulară. 5.3.1. Clasificarea meristemelor Meristemele se pot clasifica după mai multe criterii, astfel: 1.
După tipul structurilor pe care le formează meristemele sunt clasificate în
meristeme organogene şi meristeme histogene. Din acest punct de vedere se cunosc meristemele primare, meristemele secundare şi cele speciale. Meristemele primare sunt de mai multe feluri: - meristeme terminale (apicale) sunt situate în vârful ramificaţiilor tulpinii şi rădăcinii asigurând creşterea acestora în lungime. Aceste meristeme se formează în momentul în care ia naştere embrionul şi rămân active o perioadă îndelungată. În decursul
103
anului există perioade de diviziune intensă a celulelor meristematice (perioada vegetativă) şi perioada de repaus relativ (în timpul sezonului rece). În perioadele de inactivitate relativă meristemele sunt protejate în structuri de tipul mugurilor. Se cunoaşte procesul de inhibiţie corelativă pe care meristemele apicale îl manifestă în raport cu cele axilare, fapt explicat prin conţinutul ridicat în auxine al celor dintâi. - meristeme axilare (laterale) - se formează la subsuoara frunzelor pe lăstarii în creştere. Formarea lor este legată de evoluţia meristemului apical. Prin diviziunea rapidă a celulelor meristematice existente la nivelul meristemului terminal se formează spre exteriorul conului de creştere primordiile foliare iar la subsuoara acestora, primordiile mugurilor laterali (axilari). Primordiile mugurilor axilari sunt alcătuite la rândul lor, din celule de tip meristematic cu rol în dezvoltarea viitorilor muguri. În acelaşi timp, spre baza conului de creştere în zona centrală, se formează vasele conducătoare şi ţesut parenchimatic. La plantele perene, formarea meristemelor laterale are loc deci, cu un an înaintea pornirii lor în activitate. - meristeme adventive - sunt în general meristeme profunde situate atât pe tulpină cât şi pe rădăcină, în zona periciclului. Activarea acestor meristeme se face frecvent la speciile care emit drajoni sau în situaţia în care planta pierde din diferite cauze, organe sau părţi importante. În acest caz, meristemul adventiv va genera organe sau structuri similare pentru compensarea pierderilor. - meristemele intercalare se găsesc la monocotiledonate, fiind situate la baza internodiilor. - meristemele foliare sunt meristeme de tip adventiv care prezintă importanţă în generarea unor organe noi, lăstari sau rădăcini, la speciile cu înmulţire vegetativă, prin frunze sau fragmente de frunze. Aceste meristeme au un rol esenţial în regenerarea unor structuri noi în cazul organogenezei directe şi a embriogenezei somatice. Meristemele secundare se întâlnesc la speciile lemnoase, care prezintă creştere în grosime la nivelul tulpinii sau rădăcinii. Dintre meristemele caulinare cambiul, generează elemente conducătoare liberiene spre exterior şi vase lemnoase spre interior. În culturile in vitro cambiul este folosit frecvent ca ţesut regenerativ. Felogenul, denumit şi strat regenerator subero-felodermic, produce suber spre exterior şi feloderm spre interiorul organului.
104
Meristemele speciale (Hoza D., 1996) sunt caracteristice organelor şi ţesuturilor cultivate in vitro. Ele au proprietăţi similare meristemelor primare şi dau naştere la structuri noi de tipul lăstarilor, rădăcinilor sau embrionilor somatici. Promeristemul apare la nivelul calusului sau a ţesuturilor care au suferit procese de dediferenţiere. Fiind un ţesut meristematic în fază incipientă, evoluţia sa ulterioară este influenţată de condiţiile de cultură. Meristemoidul este folosit ca termen tot pentru a defini o structură asemănătoare promeristemului şi care poate evolua diferit. Unii autori (Margara 1982, citat de Cachiţă Cozma, 1984) consideră că meristemoidul este diferenţiat deja funcţional fiind de tip proliferativ, când dă naştere la calus, rizogen şi caulogen, când formează rădăcini respectiv lăstari. Cu toate că se afirmă că meristemul radicular la angiosperme este diferit de cel caulinar, cele două nefiind interconvertibile, cercetările proprii au dovedit contrariul (Stănică, 1998). Astfel, cultivate pe un mediu bogat în citochinine rădăcinile de kiwi au generat lăstari, în timp ce limbul foliar cultivat pe un mediu cu conţinut ridicat de auxine (Stănică, 1994) a dat naştere la rădăcini (foto 5.14.). Embrioidul este o structură evoluată care este capabil să genereze elemente bipolare de tipul embrionilor somatici.
Foto 5.14. Formarea rădăcinilor direct din limbul foliar la kiwi
105
Formarea embrioizilor are loc prin procese de diferenţiere în masa celulară a calusului sau direct prin embriogeneză adventivă la nivelul altor organe (limb foliar, cotiledoane, etc.). Meristemului apical la angiosperme este alcătuit din două părţi principale: tunica şi corpusul. Tunica este formată din 1-3 straturi de celule care se divid anticlinal pe un plan perpendicular pe suprafaţă. Ea asigură alungirea conului de creştere. Corpus - corpul meristemului este format din celule care se divid în toate sensurile. Aceste celule dau naştere primordiilor foliare şi primordiilor de muguri spre exterior iar spre bază din zona axială iau naştere vasele conducătoare şi ţesuturile paranchimatice. 2.
După zona în care se găsesc meristemele, acestea pot fi meristeme
radiculare sau meristeme caulinare. Meristemele radiculare au o structură mai simplă şi funcţii limitate. În cadrul meristemelor radiculare întâlnim: - meristeme apicale - situate în vârful rădăcinilor sub piloriză (scufie), care au rolul de a asigura creşterea în lungime a acestora; - meristeme laterale - situate pe rădăcinile principale cu rol în formarea de noi ramificaţii; - meristeme adventive - situate în periciclu având rolul de a naştere la lăstari (drajoni) sau alte rădăcini. Meristemele caulinare sunt mult mai complexe din punct de vedere structural şi funcţional. La nivelul tulpinii se întâlnesc toate tipurile de meristeme a căror evoluţie este diferită în funcţie de o serie de factori: nutriţionali, hormonali, de mediu, tehnologic, etc. 5.3.2. Cultura de meristeme Meristemele caulinare sunt folosite în mod normal pentru a fi cultivate pe medii aseptice in vitro. Datorită totipotenţei de care dau dovadă meristemele caulinare, ele vor fi capabile să genereze organe diferite, deci, în final, plante întregi. În general, se folosesc pentru iniţierea de culturi meristematice terminale şi cele axilare (laterale). Acestea sunt capabile să genereze in vitro plăntuţe, care sunt folosite apoi pentru înmulţirea rapidă.
106
Primele încercări de cultivare a meristemelor caulinare şi radiculare in vitro au fost făcute în 1922 de câtre Kotte la mazăre şi de către Robbins la porumb. Abia în 1946, Ball a reuşit să obţină plante din apexuri meristematice de Lupinus albus şi Tropaellum majus. Ulterior, Wetmore şi Morel, citaţi de Cachiţă-Cozma (1984) au studiat comportarea meristemelor provenite de la diferite specii, în diferite condiţii de cultură. Epoca optimă pentru prelevarea meristemelor variază de la caz la caz. De regulă se evită perioadele de latenţă a organelor când activitatea meristematică este redusă. La garoafe, cel mai mare procent de supravieţuire 1-au avut meristemele recoltate primăvara sau toamna devreme, în timp ce cele recoltate iarna au înrădăcinat mai uşor, iar cele recoltate vara au prezentat cel mai ridicat grad de devirozare. La cartof, meristemele recoltate primăvara şi vara formează plante care înrădăcinează mai bine decât cele recoltate în a doua parte a anului. Prelevarea meristemelor se face după sterilizarea prealabilă a materialului vegetal. În cazul garoafelor, având în vedere că meristemele sunt bine protejate de primordiile frunzelor se poate renunţa la sterilizare. La speciile lemnoase care prezintă meristeme protejate de catafilele mugurilor, sterilizarea poate să se facă la concentraţii mai ridicate ale agenţilor sterilizanţi. Ulterior prelevarea meristemelor se face la hotă sub o lupă binocular. Se înlătură treptat catafilele şi primordiile frunzelor cu ajutorul bisturiului şi a unor ace spatulate până se ajunge la domul meristematic. Excizarea acestuia se face prin una sau două tăieturi urmărind detaşarea unei cantităţi cât mai reduse din ţesutul aflat dedesubt. Pentru uşurarea lucrului, la muguri vegetativi proveniţi de la speciile lemnoase înainte de "dezvelirea" domului meristematic sub lupă, se poate recurge la eliminarea prin patru tăieturi paralele cu marginile mugurilor a aproximativ 50% din volumul acestora. Tăierea se va face antrenând şi scoarţa adiacentă de pe ramură şi înlăturând astfel şi eventualele riscuri de infecţie. Se ajunge astfel în vecinătatea meristemului şi se continuă operaţia sub lupa binocular. După detaşare, meristemul este aşezat uşor de pe lama bisturiului pe mediul de cultură. Eventual cu ajutorul vârfului bisturiului se face o mică incizie în masa mediului în care se va aşeza meristemul. O altă variantă este aceea prin care se cultivă pe mediu meristemul însoţit de mai multe primordii foliare. În acest caz, după dezinfecţia mugurilor se înlătură numai
107
catafilele exterioare ale acestora. Mugurele „dezbrăcat” în acest fel este inoculat pe mediu şi va porni în creştere în aproximativ două săptămâni. Metoda poate fi folosită pentru iniţierea culturilor in vitro la speciile lemnoase (foto 5.15. a şi b)
a b Foto 5.15. Iniţierea culturii cu meristeme şi primordii foliare a – Acer platanoides Drumondi, b – Carpinus betulus Fastigiata Mediul de cultură folosit este de regulă mediul solid, putându-se însă folosi şi medii lichide (foto 5.16), meristemele sau apexurile, aşezându-se în acest caz, pe punţi de hârtie. Frecvent se recomandă reducerea conţinutului de macroelemente la 1/2 (Standardi, 1982). pH-ul mediului variază între 5,5-5,8.
Foto 5.16. Explante de kiwi (Actinidia deliciosa) provenite din apexuri şi cultivate pe mediu lichid
108
Concentraţiile de hormoni sunt reduse 0,1-,5 µm/1, auxinele şi citochininele fiind indicate pentru stimularea diviziunii celulare, iar giberelinele (GA3) pentru stimularea alungirii lăstarilor. Intensitatea luminoasă variază de la caz la caz, în general recomandându-se 24002600 lucşi, cu o perioadă de 16 ore lumină şi 8 ore întuneric. La unele specii, ţinerea meristemelor la întuneric timp de 3-7 zile, are ca efect reducerea brunificărilor (Stănică şi colab., 1992). Există situaţii când intensitatea luminoasă trebuie să atingă valori de 3000-4000 lucşi sau chiar de 10000 lucşi la conifere. Uneori se recomandă suplimentarea luminii fluorescente, cu lumină roşie. Temperatura optimă este de 22-25°C. Sunt situaţii în care cultivarea meristemelor la temperaturi mai ridicate are un efect mai drastic în eradicarea virusurilor (viţa de vie). După începerea formării lăstarilor din meristeme se trece la înmulţirea acestora folosind un procedeu adecvat. Astfel, se poate realiza minibutăşirea lăstarului prin secţionarea lui în fragmente uninodale sau stimularea lăstăririi axilare şi izolarea lăstarilor formaţi. Avantajele folosirii meristemelor (după Cachiţă-Cozma, 1984) sunt multiple: posibilitatea înmulţirii clonale a materialului biologic valoros; eliminarea bolilor şi dăunătorilor periculoşi; obţinerea unui material juvenilizat cu capacitate mare de multiplicare; conservarea prin frig a inoculilor valoroşi până în momentul folosirii; realizarea băncilor de gene. 5.3.3. Cultura de apexuri Pe lângă folosirea meristemelor, iniţierea culturilor in vitro se poate face şi prin folosirea unor apexuri de lăstari. Vârful de creştere al lăstarului, însoţit de 1-2 frunze în formare, este detaşat după o prealabilă sterilizare şi inoculat pe mediul de cultură. Cel mai bun moment pentru inoculare este perioada de creştere intensă a lăstarilor. Lăstarii pot proveni de la plante cultivate în câmp sau în seră. În acest caz însă, gradul de infectare a materialului este ridicat. O soluţie mult mai practică este obţinerea lăstarilor în laborator prin punerea la forţare a unor ramuri anuale. În acest scop, ramurile se fasonează în butaşi de 10-15 cm, se parafinează la vârf şi eventual se dezinfectează prin îmbăiere într-o soluţie de fungicide. Se pun apoi în vase cu apă la temperatură ridicată (în camera de culturi) urmând ca în 10-14
109
zile mugurii să se deschidă şi să se formeze lăstarii care vor fi folosiţi pentru prelevarea apexurilor (foto 5.17., 5.18.).
Foto 5.17. Ramuri de kiwi (Actinidia arguta) puse la forţat
Foto 5.18. Coarde de viţă de vie puse la forţat în vederea prelevării apexurilor
110
În tabelele următoare, sunt prezentate câteva din realizările obţinute prin cultura de meristeme şi apexuri la plantele horticole: legume (5.3.1.), flori (5.3.2.), pomi şi arbuşti fructiferi (5.3.3.), arbori şi arbuşti ornamentali (5.3.4.) şi viţă de vie (5.3.5.). Sunt indicate mediile de cultură folosite, rezultatul cercetărilor şi bineînţeles, autorii.
111
Tabelul 5.3.1. Câteva realizări privind cultura de meristeme si apexuri la plantele legumicole Denumirea speciei 1 Allium cepa Apium graveolens Asparagus officinalis
4 5,6 -
Zaharoză (g/l) 5 30 30,8
Agar (g/l) 6 8 agar
Regulatori de creştere (mg/l) 7 (0,1)BAP+/- ANA (1)2,4-D+(1)BAP
5,6 5,8 5,8
20 30 20
6 agar 6
(1) ANA (1) ANA + (1) Kin (0,5) ANA
5,6
20
6
5,7
30
7
5,7
30
7
(1) ANA+(0,1) Kin+(0,1) GA3 (0,1-0,3) ANA + (0,050,1) Kin (0,1)ANA + (0,1) Kin
5,7
30
7
(0,1)ANA + (0,1) Kin
5,7
30
7
-
30
agar
(0,05 - 0,1)ANA + (0,05) Kin (12,9) Kin
30
agar
(0,1)GA3 + (0,05) BAP (0,1)ANA+(0,1) Kin
5,8
30
lichid
(8)AIA+ (2,56)Kin
5,8
30
10
(1)BAP
Rezultat
Mediul de cultură
pH
2 Plantulă înrăd. Plantule via calus Lăstari Calus Lăstar unic
3 Havel & Novak (1985) Murashige&Skoog (1962) Doré (1975) CMI Reuther (1984) Murashige & Skoog (1962) Tenedille & Lecerf (1974) KNO3 Murashige & Skoog (1962) Murashige & Skoog (1962) Murashige & Skoog (1962) Yang (1977)
Lăstari înrădăcinaţi Lăstari axilari si înrădăcinare Plantule libere de virusuri Lăstari multipli
Creşterea lăstarilor Regenerarea Murashige & Skoog Brassica oleracea lăstarilor (1962) capitata Cichorium intybus Regenerare lăstari Quoirin&Lepoivre (1977) Lăstar unic, Handley&Chambliss Cucumis sativus înrădăcinat (1979) Dezvoltare pana Tran Than Van (1973) Cucurbita pepo la 5 mm Proliferare Tran Than Van (1973) lăstari
5,8
112
Autori 8 Havel&Novak 1985 Rappaport et al. (1980) Doré (1975) Reuther (1984) Revière & Müller (1974) Tenedille & Lecerf (1974) Yang & Clore (1973) Yang & Clore (1976) Yang (1976) Yang (1977) Walkey et al (1980) Pieron et al (1992) Handley&Chambliss (1979) Pink & Walkey (1984) Pink & Walkey (1984)
1 Ipomoea batatas
2 lăstari calus Lăstari multipli Caulogeneză Lăstar unic
Lactuca sativa
Lycopersicon esculentum Phaseolus vulgaris Pisum sativum
Solanum tuberosum
Lăstar unic devirozat Dezvoltare lăstari Lăstari cu rădăcini Lăstari cu rădăcini Lăstari multipli Proliferare lăstari Regenerare plantă Dezvoltare lăstari Lăstar unic Alungire lăstari Plante devirozate
Tabelul 5.3.1. continuare 7 8 (1)AIA Elliot(1969) (0,1)2,4-D Jarret et al. (1984)
3 Elliot(1969)M-S Murashige & Skoog (1962) Kartha et al.(1974a)
4 5,8 5,6-5,8
5 30 30
6 lichid 7
5,7
30
6
Murashige & Skoog (1962) Murashige & Skoog (1962) Nielsen(1960)
5,8
30
8
5,8
30
agar
(0,2-1)ANA sau AIA + [(0,2-1)BAP/Z/Kin] (1)BAP sau [(1)AIA+(1)Kin] BAP
30
10
-
Kartha et al.(1974a)
5,8
30
8
(1)ANA+(0,5)BAP
Miller (1961a,1963)
5,8
30
10
(5)AIA+(0,5)Kin
Gresshoff&Doy (1972a,b)DBM2 Kartha et al (1974 a)
5,8 -6,4
20
8
(8)ANA+(0,1 ) Kin
5,7
30
6
(1,9) ANA + (1,1) BAP
Kartha et al (1974 a)
5,6
30
8
(0,02) ANA + (4,5) BAP (0,11) BAP
Gamborg et al (1968) B 5 Gamborg et al (1968) B 5 Murashige & Skoog (1962) Goodwin (1966) Morel & Martin (1955)
8 5,7
113
20
6
20
lichid
30 20
lichid agar
(0,19) ANA + (0,1) BAP (2) AIA + (2) Kin (0,01) AIA + (1) Kin
Kartha (1982b) Litz&Conover(197 8b) Moyer&Collins(19 82) Nielsen(1960) Bloksberg&Saltveit (1985) Koevary et al (1978) Gresshoff&Doy (1972b) Kartha (1982 b) Griga et al (1986) Haskins & Kartha (1980) Kartha et al (1974b; 1979) Dodds & Roberts (1982) Goodwin (1966) Morel & Martin (1955)
Tabelul 5.3.2. Denumirea speciei 1 Anthurium andraeanum Begonia rex Cattleya sp,
Chrysanthemum sp,
Coleus blumei
Colocasia esculenta Cordyline terminalis
Câteva realizări privind cultura de meristeme si apexuri la plantele floricole Zaharoză Agar Regulatori de creştere Rezultat Mediu pH (g/l) (g/l) (mg/l) 2 3 4 5 6 7 Dezvoltare Kunisaki (1975) 5,8 20 0 15% CM lăstari Dezvoltare Murashige & Skoog 5,8 30 6 lăstari + (1962) înrădăcinare Calus Lindemann et al (1970) 5,5 50 0 (0,1) ANA + (0,1) Kin 1 + 15% CM Protocorm Knudson (1946) C 5,2 20 Agar (1) AIA sau (1) ANA 5 6 (1,75) ANA + (1,75 ) Protocorm Reinert & Mohr (1967) 2 IBA + (1) Kin Lăstari adventivi Linsmaier & Skoog 30 5 (0,02) ANA + (2) Kin şi axilari (1965) Cultura de Hollings (1965) 40 0 (1) ANA meristeme Calus friabil Nitsch & Nitsch (1965) 5,5 20 6 (2) ANA + (2-5) Kin S Lăstar Linsmaier & Skoog 5,8 30 10 (1) ANA + (0,001) Kin înrădăcinat (1965) Planta întreagă Linsmaier & Skoog 5,8 30 10 (1) AIA + (0,003) Kin (1965) Proliferare Linsmaier & Skoog 5,8 30 0 (0,15 – 1,5) AIA + (1) lăstari (1965) Kin Proliferare Evaldsson & Welander 5,8 30 6 (0,1) ANA + (2) BAP lăstari (1985)
114
Autori 8 Kunisaki (1980) Cassells & Morrish (1985) Lindemann et al (1970) Morel (1965 b) Reinert & Mohr (1967) Bush et al (1975) Hollings (1965) Sangwan & Harada (1977) Smith & Murashige (1970) Smith & Murashige (1970) Jackson et al (1977) Evaldsson & Welander (1985)
1 Cymbidium sp,
Dendrobium sp
Dianthus caryophyllus Freesia superfreesia Gladiolus sp, Iris spp, Lilium sp, Mammillaria carmenae Mammillaria prolifera Oncidium lanceanum Oncidium spp, Pelargonium sp,
2 Propagare Protocorm Calus
3 Morell (1965 a) Knudsom (1946) C Reinert & Mohr (1967) 1
Protocorm
Reinert & Mohr (1967) 2
Organogeneză
Vacin & Went (1949)
6
20
8-9
Protocorm
Morell (1965a)
5,2
20
Agar
Diferenţiere
Vacin & Went (1949)
6
20
8-9
10 % CM
Lăstari
Murashige & Skoog (1962) Hempel (1979) Petru et al (1976) meristem Murashige & Skoog(1962) Hollings (1965)
30
Agar
(1) ANA
5,8
20 30
0 Agar
(1,35) BAP (2,5) Kin
5,9
30
7
40 glucoză
0
(0,1)ANA + (2-5)Kin +15% CM (1)ANA
Hollings (1965)
40 glucoză
0
(1)ANA
Hollings (1965)
5,5
30
agar
(1)ANA + (2)BAP
5,5
30
agar
0
0
(0,5-1)ANA + (0,5-1)BAP 15% CM
Vyskot &Jara (1984) Vyskot &Jara (1984) Lim-Ho (1982)
20 20
8-9 0
(2)AIA + (2)Kin
Thompson (1975) Dodds&Roberts(1982)
Muguri axilari Rizogeneză Plantulă Cultură meristeme Cultură meristeme Lăstărire
Iniţiere Diferenţiere Lăstar unic
Vacin & Went (1949) Murashige&Skoog(1962)
5 20 20
6 Agar Agar 0 6
Hollings (1965) Vyskot & Bezdek (1984)1 sau 2 Vyskot & Bezdek (1984)1 sau 2 Lim-Ho (1982) VW
Lăstărire
4 5,2 5,2
Tabelul 5.3.2. continuare 7 8 Morell (1965 a) Morell (1965 b) (1,75) ANA + (1,75) Reinert & Mohr IBA (1967) (1,75) ANA + (1,75) Reinert & Mohr IBA +(1) Kin (1967) 10 % CM Sagawa & Kunisaki (1982) Morell (1965 a)
115
Sagawa & Kunisaki (1982) Hackett & Anderson (1967) Hemplel (1979) Petru et al (1976) Sutton (1978)
1 Pelargonium spp, Petunia hybrida Tulipa gesneriana
2 Cultură meristeme Lăstari adventivi via calus Bulbili
3 Beauchesne et al (1977) I sau II Sharma & Mitra (1976) C Riviere & Muller (1979)
4
5,5
5 30 glucoză
6 6-7
20
7
50 glucoză
6
Tabelul 5.3.2. continuare 7 8 (0,25)AIA + (0,1)2iP + Beauchesne et al (1)GA3 +/- (2)Ad (1977) (0,5)BAP Sharma & Mitra (1976) (0,1)ANA + (0,1)BAP Riviere & Muller (1979) Tabelul 5.3.3.
Denumirea speciei 1 Ananas comosus
Castanea sativa
Citrus sp, Cocos nucifera Fragaria
Câteva realizări privind cultura de meristeme si apexuri la plantele pomicole Zaharoză Agar Regulatori de creştere Rezultat Mediul de cultură pH (g/l) (g/l) (mg/l) 2 3 4 5 6 7 Lăstari axilari Murashige & Skoog 30 0 (1,8)ANA+ (2)IBA (1962) (agar) +(2)Kin Lăstar unic Murashige & Skoog 30 0 25% CM (1962) Lăstar unic Rodriguez (1982b) 5,5 30 6 (1)IBA K(h) Lăstari Rodriguez (1982b) K(h) 5,5 30 6 (0,01)IBA+(1)BAP Proliferare Vieitez & 5,5 30 7 (0,1)BAP lăstari Vieitez(1980b) Lăstari axilari si Bouzid (1975) A 5,8 30 8 (1)ANA + (1)Kin adventivi Rizogeneza D’Souza (1982) BM 68,4 agar (1-2)ANA+12%CM Lăstari Mullin et al, (1974)B 5,7-5,8 30 glucoză 0 (2,5)AIA + (0,1)Kin devirozati White (1954)-saruri 20 7 10%CM Adams (1972)
5,2
116
30
0
(1)IBA+(0,1)BAP
Autori 8 Matheus & Rangan (1979) Zepeda & Sagawa (1981) Rodriguez (1982c) Rodriguez (1982c) Vieitez & Vieitez(1980b) Bouzid (1975) D’Souza (1982) Mullin et al, (1974) Miller&Belkengren (1963) Adams (1972)
1 Fragaria
Malus x domestica
Musa cavendishii
2 Proliferare lăstari Lăstari Proliferare lăstari Proliferare lăstari calus
Rubus idaeus
Lăstari axilari si adventivi Proliferare lăstari axilari Creştere lăstari
Rubus sp,
Lăstari axilari
Vaccinium sp,
Proliferare lăstari Lăstari axilari
Musa textilis Prunus cerasifera
3 Boxus (1974a)
4 5,6
5 22 glucoză
6 7
Tabelul 5.3.3. continuare 7 8 (1)BAP Boxus et al, (1974)
Mullin et al (191974)A
4,5
30 glucoză
0
(1)AIA
Murashige & Skoog (1962) Jones et al (1977)
5,3
20
7
(1,1)BAP
5,2
30
7
30
agar
5,7
30
5-8
(1)IBA+(1)BAP+ (0,1)GA3 (0,3)AIA+(1)Kin sau [(2)BAP+20%CM] (10)BAP+(80-160)AdS
5,8
30
7
(0,5)BAP
5,7
30
0
5,8
30
10
(0,1)ANA+(2)BAP
5,7
30
4
(10)2iP+(80)AdS
5,7
30
0
(5)2iP
Murashige & Skoog (1962) Mante & Tepper (1983) I Linsmaier & Skoog (1965) Donnelly et al, (1980)2 Skirvin & Chu 1978a,b)0 Goldy & Lyrene (1984) Smagula & Lyrene (1984) WPM
117
Mullin & Schlegel (1976) Lane (1979) Snir & Erez (1980) Ma et al (1978) Mante & Tepper (1983) Norton & Norton(1986a) Donnelly et al, (1980) Skirvin et al (1981a) Goldy & Lyrene (1984) Smagula & Lyrene (1984)
Tabelul 5.3.4. Denumirea speciei 1 Hedera helix
Lavandula augustifolia & sp, Pinus sylvestris Syringa vulgaris Weigela florida
Câteva realizări privind cultura de meristeme şi apexuri la arborii şi arbuştii ornamentali Zaharoză Agar Regulatori de creştere Rezultat Mediul de cultură pH (g/l) (g/l) (mg/l) 2 3 4 5 6 7 Înrădăcinare Hackett (1970) 5,8 20 (5-10)ANA sau (sub lumină (10)AIA+(5,5) catechol puternică) Înrădăcinare Hackett (1970) 5,8 20 (10)AIA+(5,5) catechol (sub lumină slabă) Lăstari Polito & Alliata 5,6 20 8 (0,5)ANA + (2)BAP (1981) Calus Kartha et al, (1974a) 5,5 20 7 (1)ANA + (4)BAP + 10%CM Înmugurire Bornman & Janson 5,6-5,8 50,5 6-7 (1,1-2,2) BAP + (1-2) (1980) 2iP Dezvoltare Wetmore (1954) 2 20 10 15% CM lăstari 4 lăstari/expl, Murashige & Skoog 30 agar (2,25) BAP (1962)
118
Autori 8 Hackett (1970) Hackett (1970) Polito & Alliata (1981) Quazi (1980) Bornman & Janson (1980) Wetmore (1954) Calvert & Stephens (1986)
Tabelul 5.3.5. Denumirea speciei
Explant
1 Vitis rupestris
2 Apex lăstar
Vitis rupestris
Apex lăstar
Vitis vinifera
Apexuri lăstari
Vitis vinifera
Apexuri lăstari
Vitis vinifera
Apexuri lăstari
Vitis vinifera
Apexuri lăstari
Vitis vinifera
Meristeme
Vitis vinifera
Apexuri lăstari
Vitis vinifera
Meristeme
Vitis vinifera
Apexuri lăstari
Câteva realizări privind cultura de meristeme si apexuri la viţa de vie Regulatori de Zaharoză Agar creştere Rezultat Mediu pH (g/l) (g/l) (mg/l) 3 4 5 6 7 8 Dezvoltare Gazly (1964) 6,5 15 8 lăstar unic Lăstar Gazly (1964) 6,5 15 8 (0,02)ANA înrădăcinat Alungire lăstari Webb & Street 30 agar (1,48)BAP (1977)CI Înrădăcinare Webb & Street 30 agar (0,023)BAP lăstari (1977)CI Lăstari Murashige & 5,8 30 0 (2,2)BAP Skoog (1962) Lăstari White (1943a)A 5,8 30 0 (2,2)BAP înrădăcinaţi Proliferare Jona & Webb 5,7-5,8 20 3-5,5 (2,25)BAP lăstari axilari (1979)BG Înrădăcinare Jona & Webb 5,7-5,8 20 3-5,5 (0,23)BAP (1979)C Lăstar unic, Jona & Webb 5,7-5,8 20 3-5,5 (0,023-0,23)BAP înrădăcinat (1979)C Înrădăcinare Stevenson & 5 30 0 (0,1)AIA Monette (1983)R
119
Autori 9 Gazly (1972) Gazly (1972) Aldwinckle & Buturac (1981) Aldwinckle & Buturac (1981) Barlass et al (1982) Barlass et al (1982) Jona & Webb (1979) Jona & Webb (1979) Jona & Webb (1979) Stevenson & Monette (1983)
5.4. Cultura de fragmente uninodale Metoda constă în secţionarea lăstarilor crescuţi in vitro în porţiuni uninodale urmată de cultivarea acestora pe un nou mediu de cultură. Din mugurii axilari vor lua naştere noi lăstari care după o anumită perioadă de timp vor fi secţionaţi din nou. Primele experienţe privind cultura de fragmente uninodale, obţinerea de lăstari şi înrădăcinarea acestora au fost efectuate de Galston 1947, 1948 şi Gorter 1965, la asparagus. Pentru realizarea acestei tehnici se pot folosi ca explante iniţiale meristeme, vârfuri de lăstari (apexuri), muguri aflaţi la subsuoara bracteelor la unele tipuri de inflorescenţe, precum şi alte organe capabile să genereze lăstari in vitro. Lăstari se pot obţine prin folosirea unor primordii de muguri florali care se transformă apoi în structuri vegetative (conopidă - Crisp şi Walkey, 1974). De regulă în mediul de cultură nu se adaugă citochinine care să anuleze efectul dominanţei apicale. Se urmăreşte, în fapt alungirea lăstarilor pentru a obţine un număr cât mai mare de noduri. Iniţierea culturii este foarte importantă. În vederea stabilizării trebuie realizată juvenilizarea materialului iniţial. La speciile lemnoase un alt aspect important îl reprezintă necesitatea ruperii dormansului mugurilor după inoculare. Acest lucru este posibil prin tratamente cu temperaturi scăzute (0-5°C), mărirea duratei zilei (16 h) asociată cu temperaturi scăzute, urmate apoi de creşterea temperaturii. Uneori se recomandă creşterea concentraţiei de citochinine şi gibereline. La speciile erbacee dormansul se poate întrerupe prin etiolarea materialului. Rata multiplicării este direct proporţională cu viteza de creştere a lăstarilor, respectiv cu numărul de frunze care se formează. De regulă lăstarii formaţi din apexuri cresc şi se alungesc mai rapid decât cei formaţi din muguri axilari. De aceea ei sunt trecuţi în vase de cultură separate. Folosirea mediului de cultură în dublu strat, solid + lichid, a avut ca efect creşterea vitezei de creştere a lăstarilor de gutui BA-29 (Stănică F. şi colab., 1996). De asemenea, folosirea apei structurate şi a unor glico-steroizi naturali (Ecostim) a determinat creşterea lăstarilor de măr (Săvulescu Anca şi Stănică F., 1996). Folosirea apei π la prepararea mediului pentru faza de multiplicare la măr (foto 5.19.) şi la smochin a avut ca efect o stimulare a creşterii explantelor şi sporirea proporţională a ratei de multiplicare (Stănică F. şi colab. 2002, Gâlă R. şi colab. 2003). 120
Foto 5.19. Efectul apei π asupra multiplicării in vitro la trei soiuri de măr La liliac (Syringa vulgaris) stimularea creşterii lăstarilor este posibilă prin folosirea zeatinei sau a 2ip (Pierik şi colab. 1986). La Araucaria cunninghammii (Mott, 1981) la realizarea regenerării pot fi folosiţi numai lăstari ortotropi. La cafea, în schimb (Pierik, 1987) are loc o transformare a lăstarilor plagiotropi în ortotropi. Metoda de faţă se foloseşte cu succes la foarte multe specii (cartof, manioc, pomi fructiferi (foto 5.20.a), viţă de vie (foto 5.20.b), trandafir, iederă, clematită (foto 5.21), salcie pletoasă etc.) (tabelele 5.4.1., 5.4.2., 5.4.3., 5.4.4., 5.4.5.) . La tomate, castraveţi şi vinete (Pierik, 1987) a regenerat lăstari din seminţe, ca apoi să-i folosească pentru cultura de fragmente uninodale. După mai multe cicluri de multiplicare este necesară inducerea înrădăcinării lăstarilor obţinuţi (foto 5.22.). Acest lucru este realizabil prin folosirea unor tratamente cu auxine combinate sau nu cu tratamente cu întuneric. În faza de alungire a rădăcinilor, concentraţia de auxine trebuie redusă.
121
a b Foto 5.20. Cultura de fragmente uninodale la măslin (a) şi la portaltoiul de viţă de vie Richter 110 (b) – Vitroplant
Foto 5.21. Multiplicarea la Clematis sp. prin stimularea alungirii lăstarilor
Foto 5.22. Formarea rădăcinilor la încheierea ciclului de multiplicare la Sequoia sempervirens
122
Tabelul 5.4.1. Denumirea speciei 1 Asparagus officinalis Brassica oleracea botrytis Capsicum annuum Cichorium intybus
Cucumis sativus Solanum tuberosum
Cercetări privind cultura de fragmente uninodale la plantele legumicole Zaharoză Agar Regulatori de creştere Rezultat Mediul de cultură pH (g/l) (g/l) (mg/l) 2 3 4 5 6 7 Lăstari în 4 Murashige & Skoog 5,7 30 7 (0,09) ANA + săptămâni (1962) (0,11)Kin Lăstari axilari Pelletier et al, (1972) 20 5 Tosaruri Lăstari via calus De Fossard et al (1974 5,5 41,1 8 6 auxine + 2 citochinine a) HMHH Muguri Phillips & Hubstenb’ 5,8 30 8 (0,05) AIA + (50 ) BAP adventivi (1984, 1985) glucoză Plăntuţe Murashige şi Skoog 5,8 GA, BA, ANA înrădăcinate (1962) Calus, muguri, Linsmaier şi 5,8 flori Skoog(1965) Lăstar unic Murashige&Skoog 5,8 30 agar (0,023)BAP (1962) Lăstar unic Hussey & Stacey 5,9 30 7 (1981) Lăstar unic cu Hussey & Stacey 5,9 30 lichid rădăcini (1981) Lăstari Murashige & Skoog 5,8 30 12 (19620 Lăstari via calus Murashige & Skoog 5,7 20 7 (1) BAP + (1) GA3 (1962) Lăstari în 3-5 Murashige & Skoog 5,8 30 6 (0,5) BAP săptămâni (1962)
123
Autori 8 Chin (1982) Doré (1974) Trimboli et al (1977) Phillips&Hubstenb (1984, 1985) Grazia şi co (1985) Harada (1966) Aziz&McCown(19 85) Hussey & Stacey (1981) Hussey & Stacey (1981) Levy (1985) Marani & Pisi (1977) Thomas (1981)
Tabelul 5.4.2. Denumirea speciei 1 Anthurium andraeanum Camellia japonica Dendrobium sp, Dianthus caryophyllus Dracaena deremensis Phalenopsis sp,
Cercetări privind cultura de fragmente uninodale la plantele floricole Zaharoză Agar Regulatori de creştere Rezultat Mediul de cultură pH (g/l) (g/l) (mg/l) 2 3 4 5 6 7 Lăstari multipli Kunisaki (1975) 5,8 20 8 (0,2 – 1) BAP Iniţiere caulogeneză Muguri axilari
Carlisi & Torres (1985; 1986) Ball & Arditti (1976) S
5
30
8
(0,5-1) BAP
20
13
(2) BAP
Lăstari axilari si adventivi Lăstari
Murashige & Skoog (1962) Debergh (1975)
5,8
30
8
(0,1) AIA + (1) BAP
5,8
20
6
Protocormi 55% Lăstari
Koch (1974) A Reisinger et al (1976)
5-5,5
20 20
5 13
124
(0,5-3)ANA + (2)BAP (2)BAP
Autori 8 Kunisaki (1980) Carlisi & Torres (1985; 1986) Ball & Arditti (1976) Roest & Bokelmann (1981) Debergh (1975); 1976) Koch (1974) Reisinger et al (1976)
Tabelul 5.4.3. Denumirea speciei 1 Actinidia delicosa Armeniaca vulgaris Castanea mollissima Castanea sativa
Citrus sp, Corylus avellana Juglans hindisii x J. regia Juglans regia Olea europaea Pyrus communis Rubus idaeus Theobroma cacao
Câteva realizări privind cultura de fragmente uninodale la plantele pomicole Zaharoză Agar Regulatori de creştere Autori Rezultat Mediul de cultură pH (g/l) (g/l) (mg/l) 2 3 4 5 6 7 8 Lăstari Harada (1975) 5,5 20 7 (0,1)ANA+ (40) Ad Harada (1975) înrădăcinaţi 70% lăstari Lloyd&McCOWN 5,2 20 6 (2)2iP Snir (1984) (1981) WPM Proliferare Yang et al,(1986) 5,5 20 6,5 (0,1)BAP Yang et al,(1986) lăstari axilari Proliferare San Jose et al, (1984) L 30 6 (0,1)BAP San Jose et al, lăstari axilari sau Ha (1984) Proliferare lăstari Heinz & Mee (1969) 5,5 30 6 (1)BAP Vieitez&Vieitez(1980 b) Proliferare lăstari Linsmaier&Skoog (1965) 5,7 30 10 (1)BAP+(100)AdS Navarro et al (1975) Embriogeneză 0,5xCheng (1975)Basal 5,5 30 8 (0,1-1)IBA Pérez et al (1986) directă Multiplicare Driver & Kuniykuhi 5,5 30 2 (0,001)IBA+(1)BAP Driver & lăstari (1984)DKW gelrite Kuniykuhi (1984) Lăstari Chalupa (1981a)A 30 6 (0,15)ANA+(0,1)BAP Chalupa (1981a) +(20)AdS Proliferare Rugini&Fontanazza 5,8 30 6 (0,5)IBA+(0,5)GA3+ Rugini&Fontanazza lăstari (1981)Shoot (10)Zr (1981) Lăstar unic Murashige&Skoog(1962) 5,8 30 8 (0,45)BAP Shen&Mullins(1984) Lăstar unic Snir (1981)B 5 20 agar (0,22)2,4-D Snir (1981) +(1)BAP+(0,1)GA3 Proliferare Passey & Jones (1983) 5,2 30 7 (0,2)BAP Passey & Jones lăstari axilari (1983)
125
Tabelul 5.4.3. continuare 1 Vaccinium corymbosum
2 Lăstari axilari 1-2 lăstari/expl,
Vaccinium sp
Lăstari axilari
3 Cohen & Elliot(1979) Lloyd & McCown (1981) WPM Smagula & Lyrene (1984)WPM
4 5,7 5,2
5 30 30
6 6 6
7 (5)2iP (5)2iP
5,7
30
4
(5)2iP
8 Cohen&Elliot(1979) Wolfe et al (1983;1986) Smagula & Lyrene (1984) Tabelul 5.4.4.
Denumirea speciei 1 Acer negundo Betula verrucosa Paulownia tomentosa Ouercus robur Salix babylonica
Salix madsudana Tilia cordata Vinca minor
Cercetări privind cultura de fragmente uninodale la arborii şi arbuştii ornamentali Zaharoză Agar Regulatori de creştere Rezultat Mediul de cultură pH Autori (g/l) (g/l) (mg/l) 2 3 4 5 6 7 8 Calus Murashige&Skoog(1962) 20 6 (3)ANA + 15%CM Radojevic et al(1980) Calus Chalupa (1981b) 1 30 6 (0,05)IBA+ (0,6)BAP + Chalupa (1981b) (20)AdS Muguri axilari Ben-Jaacov & Dax 5,6 30 agar (0,1)ANA + (1)BAP Burger et al (1985) (1981) Lăstari Chalupa (1984 a,b) 20 6 (0,2-1) BAP Chalupa (1984a) BTM sau WPM Lăstari Morel & Martin (1955) 15 glucoză 8 Daguin&Letouze(198 6) Lăstari Daguin&Letouze(1986)B 15 glucoză 8 Daguin&Letouze(198 6) Lăstari adventivi Whitehed & Giles 5,8 20 agar (0,01) ANA + (0,05) Bhojwani (1980) şi axilari (1976) BAP + (20) AdSs Lăstari axilari Chalupa (1984 20 6 (0,2-1) BAP + [(0-0,1) Chalupa (1984 a,b) a,b)WPM ANA sau IBA] Proliferare lăstari Stapfer & Heuser (1985) 5,6-5,8 30 7 (0,018-0,18) ANA + Stapfer & Heuser (14,4) BAP (1985)
126
Tabelul 5.4.5. Denumirea speciei 1 Vitis berlandieri x V. cardinalis Vitis berlandieri x V. cardinalis Vitis hybrid Baco Vitis rupestris Vitis spp. Vitis spp. Vitis vinifera Vitis vinifera Vitis vinifera Vitis vinifera
Cercetări privind cultura de fragmente uninodale la viţa de vie Zaharoză Agar Regulatori de creştere Rezultat Mediul de cultură pH (g/l) (g/l) (mg/l) 2 3 4 5 6 7 Proliferare Murashige & Skoog 5,8 30 8 (2,25)BAP lăstari axilari (1962) Plantule 0,5 x Murashige & 5,8 20 7 (0,02)IBA sau ANA înrădăcinate Skoog (1962) Proliferare Miller & Murashige 5 30 0 (2-4)BAP+(80)AdS lăstari (1976)II Lăstar unic Gazly (1964) 6,5 15 8 Lăstari multipli Chee & Pool (1982a) 5,8 30 8 (0,09)ANA + (1,1)BAP Lăstari înrădăcinaţi Proliferare lăstari axilari Calus Proliferare lăstari axilari Proliferare lăstari
Chee & Pool (1982a) Webb & Street (1977)CI Jona & Webb (1979)C Murashige & Skoog (1962) Murashige (1974)
5,8
30
8
(0,02)ANA
30
agar
(2,25)BAP
5,75,8 5,8
20
3-5,5
(1)ANA+(0,2)Kin
30
8
(2,25)BAP
5
30
0
(0,03) IBA+(2)BAP+ (80)AdS
127
Autori 8 Novak&Jujova (1983) Novak&Jujova (1983) Harris & Mason (1983) Gazly (1964) Chee&Pool (1982a,b) Chee&Pool (1982a,b) Aldwinckle & Buturac (1981) Jona & Webb (1979 Novak&Jujova (1983) Stevenson & Monette (1983)&
5.5. Cultura de lăstari axilari Această metodă presupune, spre deosebire de cultura de fragmente uninodale, stimularea creşterii lăstarilor axilari prin creşterea concentraţiei de citochinine, fără stimularea alungirii lăstarului mamă. Creşterea concentraţiei de citochinine are ca efect eliminarea dominanţei apicale a mugurelui. Acest lucru este posibil şi prin eliminarea apexului lăstarului iniţial. Principiile acestei metode sunt cunoscute încă din 1925. Ea a fost aplicată pentru prima dată de către Hackett şi Anderson (1967) la garoafe, de către Adams (1972) şi Boxus (1973; 1974) la căpşun şi de Pierik (1973; 1974; 1975a) şi Murashige (1974) la gerbera. După descoperirea kinetinei, eliminarea dominanţei apicale a fost posibilă prin folosirea acesteia şi apoi a altor citochinine. Frecvent această metodă de microînmulţire este folosită în tandem cu cultura de fragmente uninodale. Astfel, în prima etapă dintr-un explant uninodal se obţine un lăstar, apoi acest lăstar este trecut pe un mediu cu un conţinut ridicat în citochinine şi este stimulată formarea lăstarilor axilari. Cultura de lăstari axilari are o serie de avantaje: - este simplă; - rata de multiplicare este relativ ridicată; - stabilitatea genetică este asigurată; - este unica metodă de multiplicare eficientă la plantele care cresc în rozetă: căpşun, gerbera, bromelia etc.). Necesarul de citochinine este variabil cu specia. Astfel, plantele de Bromelia obţinute din seminţe au generat lăstari axilari fără citochinine. La multe specii s-a observat scăderea necesarului de citochinine odată cu creşterea numărului de subculturi datorită acumulării acestora dar, mai ales datorită juvenilizării lăstarilor. Concentraţia citochininelor trebuie corelată şi cu stadiul de dezvoltare al materialului biologic. Astfel, materialul juvenil necesită o cantitate mai redusă de citochinine decât cel provenit de la plante adulte (Sequoia sempervirens, David, 1982). Frecvent se recomandă să se folosească medii cu concentraţii scăzute de auxine şi concentraţii ridicate de citochinine. Raportul citochinine: auxine cel mai recomandat este de 10:1.
128
Felul citochininelor folosite este şi el important. Cele mai multe specii reacţionează bine la folosirea BAP şi mai puţin bine la kinetină sau 2-iP. Pentru Rhododendron însă, se recomandă folosirea 2-iP. Tidiazuronul şi compuşii de substituţie ai piridilfenilureei stimulează uneori mai mult lăstărirea axilară decât citochininele (Read şi colab. 1986). În multe situaţii se recomandă distrugerea mugurelui apical şi asocierea acestei măsuri cu aplicarea citochininelor. Pentru creşterea eficienţei metodei, citochininele trebuie aplicate după ce lăstarul s-a alungit. Creşterea concentraţiei de citochinine aduce uneori după sine formarea calusului. Acest lucru trebuie evitat pentru reducerea riscului apariţiei unor mutaţii. Uneori formarea lăstarilor axilari este stimulată de folosirea mediului de cultură lichid (Bromeliaceae). De regulă, capacitatea de proliferare scade odată cu creşterea numărului de subculturi, acest fenomen fiind frecvent însoţit şi de formarea calusului. La căpşun, de exemplu, depăşirea unui număr de 12 subculturi a avut ca efect apariţia unor modificări fiziologice majore. Metoda lăstăririi axilare poate fi folosită atât pentru plantele care cresc în rozete (foto 5.23. a şi b şi 5.24. a şi b), cât şi pentru plantele care formează lăstari obişnuiţi.
Foto 5.23. Rozetă de Drossera sp. înainte de multiplicare (a) şi după (b)
129
a b Foto 5.24. Cultură de lăstari axilari al Cichorium intybus (a) şi Drosera sp. (b) Uneori stimularea lăstăririi axilare prin mărirea concentraţiei de citochinine are ca efect apariţia fenomenului de "tufă". Astfel şi după trecerea explantelor pe medii lipsite de citochinine, pentru alungire sau înrădăcinare acestea continuă să formeze lăstari axilari numeroşi (foto 5.25.).
Foto 5.25. Lăstărire axilară puternică la explantele de Sequoia sempervirens În câmp fenomenul se manifestă prin formarea unui număr mare de flori/fructe de dimensiuni reduse (căpşun).
130
Alte efecte negative ale concentraţiei ridicate de citochinine ar fi apariţia unor frunze de formă anormală, apariţia calusului (foto 5.26.) sau formarea lăstarilor adventivi susceptibili la mutaţii.
Foto 5.26. Formarea calusului în exces la concentraţii ridicate de citochinine la dafin (Laurus nobilis) în faza de multiplicare În prezent metoda este mult folosită la microînmulţirea materialului săditor pomicol în multe ţări fiind generalizată: Italia, Franţa, Anglia, etc.
Foto 5.27. Cultură de lăstari axilari la smochin (Ficus carica) În tabelele 5.5.1., 5.5.2., 5.5.3, sunt prezentate câteva cercetări privind cultura de lăstari axilari la plantele horticole.
131
Tabelul 5.5.1. Denumirea speciei 1 Allium cepa
Rezultat
Cercetări privind cultura de lăstari axilari la plantele legumicole Zaharoză Agar Regulatori de creştere Mediul de cultură pH (g/l) (g/l) (mg/l) 3 4 5 6 7 Hussey (1978a) 5,9 30 7 (0,5)IBA+(0,12)BAP
2 Lăstari înrădăcinaţi Proliferare lăstari adv, şi axil, Proliferare si creştere lăstari Creştere lăstari şi Asparagus înrădăcinare officinalis Creştere lăstari şi înrădăcinare Brassica oleracea Lăstari axilari si adventivi botrytis Cichorium intybus Regenerare lăstari Regenerare lăstari Lăstari axilari şi Cucumis melo adventivi Proliferare lăstari Lycopersicon esculentum Proliferare lăstari Creştere lăstari Plantule înrădăcinate Lăstari Phaseolus vulgaris înrădăcinaţi Lăstari Pisum sativum înrădăcinaţi Lăstari înrădăcinaţi
Autori
Hussey (1978a)
5,9
30
7
(0,5-4)BAP
8 Hussey&Falavigna (1980) Hussey (1978a)&
Hussey (1978a)
5,9
30
7
(0,12)ANA+ (2)BAP
Hussey (1978a)&
Gorter (1965)
-
40
20
Reuther (1984)
5,8
30
agar
(0,5) AIA
Linsmaier & Skoog (1965) Qoirin&Lepoivre (1977) Murashige&Skoog(1962) Moreno et al,(1984)MEL Linsmaier&Skoog(1965) Murashige&Skoog(1962) Shahin (1985) TM –1 Shahin (1985) TM –5
5,8
30
lichid
(8) AIA + (2,6) Kin
5,8
20
5
5,8
40
8
5,8 5,8 5,8
30 30 30 30
agar 7 6 6
Kartha et al (1974a)
5,7
30
6
(0,19) ANA
Kartha (1982 b)
Kartha et al (1974 a)
5,6
30
8
(0,93) ANA
Griga et al (1986)
0,5 x Gamborg et al (1968) B 5
5,7
10
6
(0,19) ANA
Kartha et al (1974 b; 1979)
132
Gorter (1965) Reuther (1984)
Walkey & Woolfitt (1970) (0,1)GA3 + (0,05) BAP Pieron et al (1992) (0,1) AIA + (2) BAP Park & Lim (1999) (2,5)ANA+(1)BAP Moreno et al, (1984) (4)AIA+(4)kin Herman&Haas(1978) (5) BAP Schnap&Preece-1986 Shahin (1985) (0,1) IBA Shahin (1985)
Tabelul 5.5.1. continuare 1 Solanum melongena
Solanum tuberosum
2 Plantule înrădăcinate Lăstari înrădăcinaţi Dezvoltare lăstari Lăstari înrădăcinaţi Multiplicare lăstari 20% lăstari în 1 luna
3 Murashige&Skoog (1962) Pelletier et al (1972) Tosaruri White (1954) 0,5 x Murashige & Skoog (1962) Murashige & Skoog (1962) Murashige & Skoog (1962)
4
5 30
6 agar
7
5,8
20
7,5
20
agar
(2) GA3
5,8
15
7
(0,1) AIA + (0,01) Kin
5,8
30
lichid
(0,1) GA3 + (0,5) Kin
5,8
10
4
(0,5)Z
8 Gleddie et al (1982) Isouard et al (1979) Yamada et al (1967) Austin & Cassells (1983) Goodwin et al (1980a) Thomas (1981)
Tabelul 5.5.2. Denumirea speciei 1 Actinidia delicosa Ananas comosus
Ananas comosus
Câteva realizări privind cultura de lăstari axilari la plantele pomicole Zaharoză Agar Regulatori de creştere Rezultat Mediul de cultură pH (g/l) (g/l) (mg/l) 2 3 4 5 6 7 Lăstari Harada (1975) 5,5 20 7 (0,1)ANA+ (40) Ad înrădăcinaţi Plantule Lakshmi Sita et al 5,8-6 20 9 (1)ANA (1974) Plantule Murashige&Skoog 30 agar (1962) Lăstari multipli Murashige & Skoog 30 0 (1,8)ANA+ (2)IBA (1962) (agar) +(2)Kin Creştere lăstari 0,5 xMurashige&Skoog 30 0 25% CM (1962)
133
Autori 8 Harada (1975) Lakshmi Sita et al (1974) Mapes (1973) Matheus & Rangan (1979) Zepeda & Sagawa (1981)
Tabelul 5.5.2. continuare 1 Castanea sativa Ficus carica
Glossularia redinata Malus x domestica Musa spp. Rubus idaeus
2 Proliferare lăstari Lăstar unic Proliferare lăstari Creştere lăstari si rădăcini Dezvoltare lăstari 8 lăstari/ explant Lăstari unic Proliferare lăstari
3 Vieitez & Vieitez(1980a) 2 Murashige & Skoog (1962) Linsmaier & Skoog (1965) Jones & Vine (1968)B
4 5,5
5 30
6 6
7 (1-2)BAP
5,8
30
8
5,2
30
7
(0,18)ANA+(0,1)BAP +(0,03) GA3 (0,5)BAP+(0,1)IBA+(0 ,1)GA3+(89)PG
5,6-5,8
40 glucoza
0
Jones & Vine (1968)B
5,6-5,8
40 glucoza
0
Linsmaier & Skoog (1965) Heinz & Mee (1979)
5,2
29,9
7
5,8
40
7
(1)IBA+(0,2)BAP +(1)GA3 (0,1)IBA+(0,99)BAP +(0,48)GA3 (5)BAP
Anderson (1978;1980)
5,7
30
6
(0,1)IBA+(4)BAP
134
8 Vieitez & Vieitez(1980a) Muriithi et al, (1982) Pontikis & Melas (1986) Jones & Vine (1968) Jones & Vine (1968) Van Nieuwkirk et al (1986) Cronauer & Krikorian (1984) Anderson (1979)
Tabelul 5.5.3. Denumirea speciei 1 Clematis sp. Cotoneaster dammeri Crataegus rachyacantha Fraxinus americana Hydrangea macrophylla Lavandula augustifolia & sp. Picea glauca
Cercetări privind cultura de lăstari axilari la arborii şi arbuştii ornamentali Zaharoză Agar Regulatori de creştere Rezultat Mediul de cultură pH (g/l) (g/l) (mg/l) 2 3 4 5 6 7 Lăstari multipli Linsmaier & Skoog 30 6 (10)BAP (1965) Lăstari multipli Linsmaier & Skoog 5,8 30 7 (1)BAP (1965) Lăstari multipli Linsmaier & Skoog 5,8 30 7 (1)BAP (1965) Lăstari multipli Lloyd & McCown 5,2 20 lichid (5-10)BAP (1981) WPM 6 lăstari/ explant Gamborg et al, 5,5 20 2 (1,8)BAP (1968)B5 gelrite Proliferare Miller & Murashige 5,7-5,8 20 7 (1)BAP lăstari (1976) II Plantule Kartha et al, (1974a) 5,5 20 7 (2) 2,4-D+ (4)BAP + 10%CM Proliferare Rumary & Thorpe 5,9 30 8 lăstari (1984)
135
Autori 8 Kratz & Langhans(1978) Norton & Boe (1982) Norton & Boe (1982) Heiman & Preece (1983) Bailey et al, (1986) Stoltz (1984) Quazi (1980) Rumary & Thorpe (1984)
Capitolul 6 Devirozarea plantelor horticole prin culturi in vitro 6.1. Devirozarea prin culturi de meristeme Un alt scop al înmulţirii prin meristeme este acela de a obţine plante sănătoase, libere de virusuri, micoplasme şi chiar alţi agenţi patogeni. Înmulţirea vegetativă aduce după sine şi transmiterea agenţilor patogeni menţionaţi în descendenţa clonală. Înmulţirea generativă, prin seminţe înlătură în parte transmiterea virusurilor. Ea nu poate fi folosită însă la toate speciile deoarece: - nu toate speciile formează seminţe, sau numărul seminţelor este insuficient; - descendenţa obţinută prin seminţe la plantele alogame este neuniformă; - înflorirea sau fructificarea descendenţilor obţinuţi din sămânţă sunt întârziate datorită perioadei juvenile lungi; - o serie de viroze se transmit prin polen sau prin sămânţă (prin polen la pomii fructiferi şi prin sămânţă la leguminoase: mazăre, fasole, soia etc.). Având în vedere că o serie de genotipuri se înmulţesc numai vegetativ apare riscul degenerării acestora sub influenţa atacului de virusuri. În perioada anilor (1949-1950) Limasset şi Cornuet (citaţi de Martin, 1977) au constatat că intensitatea virozării organelor vegetative creşte proporţional cu distanţa zonei analizate faţă de apex. Astfel, cei doi au aşezat ţesut meristemal apical (calota + câteva primordii foliare) pe rana existentă pe o frunză de tutun. După un timp s-a constatat virozarea frunzelor de tutun în proporţie de 60%. Atunci când s-au folosit ca inoculi zone mai depărtate de meristem, infectarea s-a produs în proporţie de 100%. Plecând de la aceste observaţii, Morel (1952) reuşeşte să obţină plante sănătoase, devirozate, prin cultivarea unor apexuri meristematice de dimensiuni reduse (75-100 µm lăţime şi 150-200 µm înălţime) cu 1-2 primordii foliare, provenite de la plante bolnave. Morel şi Martin au obţinut primele rezultate prin devirozarea daliilor şi în continuare au extins metoda la cartof şi orhidee. Quak (1957) a aplicat devirozarea prin culturi de meristeme la garoafe. Din acest moment s-au pus bazele tehnologiilor industriale de devirozare a materialului biologic vegetal. Plantele devirozate obţinute sunt în continuare înmulţite in vitro pentru a obţine o descendenţă suficient de numeroasă. 136
Ulterior ele se păstrează în izolatoare speciale (depozitare) şi constituie capetele de clonă furnizând materialul iniţial pentru înmulţirea în condiţii de câmp. Folosirea culturilor de meristeme pentru devirozarea materialului biologic a făcut posibilă eradicarea şi a altor boli produse de ciuperci sau bacterii. Astfel, la garoafe s-a înlăturat infecţia de Fusarium roseum şi F. oxysporum f. dianthi, în timp ce la Dieffenbachia s-au eliminat bacteriozele sistemice (Pseudomonas caryophylli şi Pectobacterium parthemi). În ceea ce priveşte motivaţia faptului că celulele meristematice sunt libere de virusuri există o serie de ipoteze: - s-ar părea că datorită diviziunii intense a celulelor în meristem, există o competiţie între acestea şi particula virală, pentru folosirea acizilor nucleici sintetizaţi. Acizii nucleici se pare că sunt puşi la dispoziţia diviziunii celulare în detrimentul multiplicării virale (Quak, 1966); - o altă ipoteză se referă la faptul că absenţa plasmodesmei şi a structurilor vasculare în meristem împiedică răspândirea virusului; - alte explicaţii precizează că datorită concentraţiilor ridicate de auxine şi citochinine din apexurile meristematice penetrarea particulelor virale este oprită sau chiar, are loc inactivarea acestora (Quak, 1977); - alţi autori afirmă că dezvoltarea virusurilor este împiedicată în apexurile meristematice datorită lipsei unor enzime specifice de care acestea au nevoie pentru multiplicare sau, datorită prezenţei unor substanţe inhibitoare; - o explicaţie plauzibilă este şi aceea că ritmul diviziunilor celulare în meristeme este mult mai mare decât ritmul replicării virusului. Acest lucru este evident în special atunci când plantele bolnave sunt crescute în condiţii foarte favorabile fapt ce duce la alungirea rapidă a lăstarilor. - o altă explicaţie ar fi faptul că meristemul excizat suferă un traumatism puternic (cu atât mai mare cu cât el este de dimensiuni mai mici) prin secţionare, fapt care duce la eliminarea virusurilor. Acest lucru a fost remarcat de Hollings şi Stone (1964) la garoafa şi de Walkey şi colab. La cireş (1969). Din păcate nu toate virozele pot fi înlăturate prin cultura de meristeme. La cartof virusul X a putut fi înlăturat doar în proporţie de 1%. În acest caz se recomandă combinarea microînmulţirii prin culturi de meristeme cu termoterapia.
137
Această metodă constă din cultivarea plantelor supuse devirozării timp de 5-10 săptămâni la temperatura de 35-39°C, fapt care determină o inactivare a virusului. Acest efect se obţine prin păstrarea organelor furnizoare de meristeme la temperaturi ridicate (ex. tuberculii de cartof la 37-38°C). Urmează apoi excizarea meristemelor şi inocularea lor pe mediu (foto 6.1.).
Foto 6.1. Excizarea apexului meristematic la viţa de vie după încheierea tratamentului de termoterapie (Vitroplant, Cesena) În acest sens se face sterilizarea vârfurilor de lăstari în alcool 70% urmată de imersia în hipoclorit de sodiu sau calciu. Se înlătură apoi frunzele inclusiv cele tinere din vârf şi se repetă sterilizarea cu alcool (70%) fără să se mai facă clătirea cu apă, deoarece picăturile de apă îngreunează detaşarea meristemelor. Meristemul izolat este apoi detaşat şi inoculat pe mediul de cultură. Dimensiunile explantului trebuie să fie reduse (0,1 mm diametru şi 0,2-0,4 mm înălţime). Creşterea numărului de primordii foliare cu care se detaşează meristemul determină scăderea ratei de devirozare. În sens contrar, în multe situaţii detaşarea meristemului fără cele 2 primordii foliare duce la moartea acestuia. Pentru cultivarea meristemelor se foloseşte apoi, tehnica descrisă în subcapitolul 5.3., având ca scop final, multiplicarea rapidă a materialului devirozat.
138
Înainte de începerea multiplicării propriu-zise este esenţial să se facă testarea gradului de devirozare a materialului biologic apelând la tehnici serologice de tipul testului ELISA. În anumite situaţii lăstarii obţinuţi nu înrădăcinează. În acest caz se recomandă altoirea in vitro a lăstarului devirozat pe un portaltoi obţinut din seminţe in vitro (Morel, 1964 - la dalia). Tehnica poartă denumirea de microaltoire şi va fi prezentată în continuare. 6.2. Microaltoirea Obţinerea plantelor libere de virusuri se poate realiza prin diferite metode microaltoire. Microaltoirea plantelor horticole poate fi definită ca un ansamblu de tehnici moderne, prin care se realizează îmbinarea între un explant de dimensiuni mici (crescut şi multiplicat in vitro) şi un portaltoi adecvat, micropropagat sau obţinut prin metode tradiţionale. Gândită pentru prima dată de Morel şi Martin (1952) ca metodă pentru devirozarea daliei, microaltoirea a fost folosită cu succes de către Murashige şi colab. (1972) şi apoi de către Navarro şi colab. (1975). Datorită faptului că în urma termoterapiei meristemul izolat are o capacitate redusă de creştere, sau că, uneori lăstarii regeneraţi din meristeme nu formează rădăcini, se recurge la altoirea acestora pe portaltoi stabilizaţi, proveniţi de la plante sănătoase. De la caz la caz, microaltoirea se realizează în condiţii aseptice, concreşterea partenerilor urmând a fi făcută în prima fază in vitro, sau în condiţii septice, "la masă", când prinderea are loc în seră. Microaltoirea oferă cercetătorului şi pepinieristului un câmp larg de posibilităţi pentru rezolvarea unor probleme existenţiale la culturile in vitro şi pentru înlăturarea unor neajunsuri ale înmulţirii clasice prin altoire. Principalele câştiguri pe care le aduce microaltoirea sunt: - se rezolvă problema producerii unei mari cantităţi de plante altoite într-un timp relativ scurt; - se foloseşte pentru devirozarea materialului genetic virozat în următoarele cazuri: când acesta nu suportă tratamentele de termoterapie; când există pericolul apariţiei unor mutaţii în urma termoterapiei; la specii care se înmulţesc greu in vitro;
139
- se poate folosi pentru specii care, deşi se multiplică foarte bine in vitro, nu înrădăcinează; - este un instrument util pentru studiul afinităţii la altoire a noilor soiuri şi portaltoi obţinuţi în lucrările de ameliorare. Se pot studia mecanismele de declanşare a lipsei de afinitate; - are avantajul că altoiul nu vine în contact cu mediul de cultură şi astfel nu este supus riscului mutaţiilor sau influenţei directe a hormonilor; - există posibilitatea juvenilizării materialului îmbătrânit prin microaltoire repetată pe portaltoi juvenili; - condiţiile de cultură şi de mediu sunt mai bine controlate. 6.2.1. Microaltoirea in vitro Constă în altoirea în condiţii aseptice in vitro a unui apex meristematic pe un portaltoi obţinut din seminţe sau din minibutaşi. Portaltoii folosiţi trebuie să îndeplinească următoarele condiţii: - să aibă seminţe cu bună germinabilitate şi creştere pe mediile artificiale de cultură; - minibutaşul să aibă ţesuturi elastice şi turgescente; - minipuietul să aibă cambiu activ uşor depistabil; - să aibă ţesuturi rezistente la oxidare şi care se înverzesc după trecerea la lumină; - să aibă un aparat radicular bine format, capabil să crească şi să trăiască în mediu lichid de cultură. În cazul folosirii înmulţirii vegetative a portaltoiului (minibutăşire), în plus, aceasta trebuie să aibă o rată de multiplicare ridicată, să înrădăcineze uşor şi să nu aibă probleme de aclimatizare. 1. Obţinerea portaltoiului se poate face din seminţe. În acest sens, pentru început, seminţele sunt scoase din starea de dormans prin una din metodele cunoscute: stratificare; tratamente cu citochinine şi gibereline (benzil-aminopurinâ 20 mg/1, respectiv acid giberelic GA3 100 mg/1); tratamente cu frig (4°C), etc. Se înlătură apoi endocarpul păstrând tegumentele seminale.
140
În continuare, se face verificarea viabilităţii seminţelor prin scufundarea timp de 20 de ore a unor probe într-o soluţie 1% de clorură de 2,3,5 trifeniltetrazoliu. Seminţele cu ţesuturi colorate roşu-intens sunt viabile. Materialul este supus apoi, la 1-2 sterilizări cu etanol 70%, 1 min., hipoclorit de sodiu (0,7% clor activ) + Tween 20 0,3% timp de 20 minute, după care se fac spălări repetate cu apă distilată sterilă. După caz, se face o a doua sterilizare. Seminţele sterilizate se pun la germinat pe mediu Murashige&Skoog + 10 g/1 agar, în termostat la 20°C, la întuneric. După 10-20 de zile seminţele germinează şi puieţii se alungesc. Portaltoii se pot obţine şi din minibutaşi. Minibutaşii (fragmente uninodale) se prelevează de la plante libere de viruşi. Se sterilizează apoi cu hipoclorit de calciu (0,7% clor activ) + Tween 20 (0,3%) şi se trec pe mediu adecvat. Pentru obţinerea portaltoilor se pot folosi şi meristeme apicale sau laterale. După mai multe multiplicări, lăstarii se trec pe un mediu de înrădăcinare, de exemplu, la sâmburoase cu 1 mg/1 IBA. 2. Pregătirea altoiului. Altoiul constă dintr-un apex meristematic provenit fie de la lăstari crescuţi in vitro, fie de la lăstari sau ramuri in vivo. În al doilea caz înainte de prelevare se execută un protocol pentru sterilizarea explantelor. 3. Altoirea propriu-zisă se face prin înlăturarea cotiledoanelor de la portaltoii obţinuţi din seminţe care apoi sunt secţionaţi transversal. Se secţionează de asemenea transversal portaltoii vegetativi. Apexul meristematic de dimensiuni foarte reduse (0,3 mm) se detaşează şi se aşează pe zona cambială a portaltoiului secţionat. Planta altoită se trece apoi într-o eprubetă sterilă pe mediu de cultură lichid pentru a se asigura o atmosferă saturată în umiditate, necesară prinderii. 4. Aclimatizarea se realizează când mini-altoiul atinge 1,5-2 cm lungime prin transplantarea plantei altoite într-un vas in vivo. Se trece apoi gradat la realizarea aclimatizării în condiţii "blânde" cu umiditatea relativă a aerului, ridicată. Dezavantajele acestei metode ar consta în folosirea unui personal calificat şi în tehnica de lucru pretenţioasă.
141
6.2.2. Microaltoirea in vivo Microaltoirea in vivo se execută în condiţii normale folosind ca altoi un meristem apical crescut in vitro iar ca portaltoi, un puiet sau un butaş înrădăcinat de dimensiuni reduse. 1. Pregătirea altoiului se face prin prelevarea apexului meristematic (0,5 mm) după sterilizarea materialului şi creşterea pe mediu pentru a-şi mări dimensiunile. Se recomandă ca acesta să nu fie în contact direct cu mediul ci să fie aşezat pe o bucată de hârtie de filtru (punte). Când apexul atinge 0,5-1 cm lungime se fasonează în formă de pană dublă punându-se pe secţiuni câte o picătură de DIECA (antioxidant). 2. Pentru altoirea propriu-zisă se folosesc portaltoi obţinuţi prin metode tradiţionale, aflaţi în ghivece. Aceştia trebuie să aibă dimensiuni reduse (pentru puieţi 40-160 zile de viaţă). În momentul altoirii, portaltoiul se retează şi apoi se execută o incizie diametrală. Pentru prevenirea brunificărilor pe suprafeţele secţionate se aplică un antioxidant: dietil diticarbonat de sodiu 2 g/1 (DIECA). Pot fi folosiţi alţi oxidanţi cum ar fi: acidul ascorbic, polivinil pirolidona (PVP), tiourea, cisteina. Pentru stimularea creşterii altoiului se adaugă o citochinină. Altoiul se introduce în incizia de pe portaltoi şi apoi se leagă strâns (foto 6.2.)
Foto 6.2. Microaltoirea la piersic folosind altoi şi portaltoi obţinuţi in vitro 142
3. Aclimatizarea se execută în sere în condiţii de umiditate relativă ridicată pentru a se realiza sudura punctului de altoire. 6.2.3. Microaltoirea ex vitro Este o tehnică care permite folosirea ca altoi a lăstarilor produşi in vitro, aceştia altoindu-se pe portaltoi obţinuţi prin metode tradiţionale, sau in vitro. Altoirea se face la masă în condiţii normale. Se îmbină astfel avantajele multiplicării in vitro cu simplitatea metodei tradiţionale de altoire. 1. Obţinerea portaltoilor se face fie plecând de la seminţe şi sâmburi, fie prin butăşire în uscat sau verde. Materialul înrădăcinat este trecut apoi la ghivece. Portaltoii pot fi obţinuţi şi in vitro, aclimatizaţi şi fortificaţi (foto 6.3.).
Foto 6.3. Portaltoi de viţă de vie fortificaţi, pregătiţi pentru altoirea ex vitro (Vitroplant) 2. Obţinerea altoilor este relativ simplă, pornindu-se fie de la meristeme, fie de la fragmente uninodale sau chiar de la alte organe (frunze etc.). După mai multe multiplicări, lăstarii având o lungime de 3-5 cm se folosesc 1a altoire.
143
3. Altoirea propriu-zisă constă în retezarea portaltoiului transversal şi despicarea longitudinal pe 1-2 cm lungime. Lăstarul altoit, preluat din cultura in vitro se fasonează sub formă de pană dublă şi se introduce în incizia de pe portaltoi. Punctul de altoire se leagă apoi strâns cu folie de aluminiu, o bandă de cauciuc (foto 6.4.), sau se protejează cu un dispozitiv cu arc (tip cârlig de rufe).
Foto 6.4. Plantă de viţă de vie microaltoită ex vitro (Vitroplant) 4. Aclimatizarea se face în spaţii protejate, cu umiditatea relativă ridicată în prima fază, urmată apoi de o călire treptată (foto 6.5.). Plantele sunt trecute apoi în câmp, în pepinieră, unde, după un sezon de vegetaţie, ating dimensiunile optime pentru plantare. Altoirea ex vitro este o metodă economică, cu aplicabilitate largă, fiind uşor de efectuat şi pe cale industrială în complexele de microînmulţire.
144
Foto 6.5. Viţă de vie microaltoită, pregătită pentru livrare şi plantare (Vitroplant) 6.3. Producerea plantelor devirozate prin alte tehnici in vitro Pe lângă cultura de meristeme, însoţită sau nu de termoterapie, s-au studiat şi alte posibilităţi pentru eliminarea virusurilor sau micoplasmelor din plantele de cultură. Una din tehnicile folosite este obţinerea de bulbili adventivi sănătoşi pe solzi de Lilium longiflorum cultivaţi in vitro (Brierley, 1962). Rezultate similare au fost obţinute de Hildebrandt (1971) la gladiole. Button şi Bornman (1971), au regenerat plante libere de virusuri la Citrus folosind embrionii somatici obţinuţi din ţesut nucelar. La conopidă, devirozarea se poate realiza prin cultivarea meristemelor provenite de la mugurii floriferi din inflorescenţă (Walkey şi colab., 1974). Mai multe cercetări experimentale au demonstrat posibilitatea devirozării materialului biologic prin regenerarea in vitro a unor lăstari adventivi pe frunze, solzi (tunici) de bulbi sau alte organe infectate. Astfel, Mori şi colab. (1982) au obţinut lăstari adventivi sănătoşi prin organogeneză directă din frunze de tutun infectate cu VMT. Acelaşi lucru a fost reuşit şi la viţa de vie. La crin şi zambilă s-a reuşit regenerarea de lăstari devirozaţi din tunici de bulbi infectaţi (Allen, 1974; Asjes şi colab., 1974). După diferenţierea meristemelor pe fragmentele de tunici cultivate in vitro, acestea au fost detaşate şi inoculate pe un alt mediu pentru alungire şi formarea lăstarilor. 145
Combinând cultura de meristeme cu obţinerea de lăstari adventivi Hakkaart şi colab. (1983) au reuşit să devirozeze soiul de Kalanchoe “Yucatan”. Bazându-se pe faptul că la o serie de specii (petunia, tutun, varză) frunzele prezintă zone cu o densitate redusă a virusurilor sau lipsite de virusuri, în timp ce celelalte părţi ale plantei sunt puternic infectate, regenerarea lăstarilor adventivi prin organogeneză directă din limb a fost principala metodă de devirozare. La plantele cu frunze variegate (himere) această metodă duce la pierderea caracterului variegat, datorită faptului că fiecare lăstar regenerat se formează dintr-o singură celulă (Cassells şi colab., 1980; Pelargonium). Cultura de calus poate să fie folosită de asemenea pentru realizarea devirozării. S-a observat că prin subcultivarea repetată a calusului de tutun infectat cu VMT acesta devine liber de virusuri. Eliminarea virusului s-ar datora prezenţei celulelor meristematice tinere dotate cu o mare capacitate de multiplicare. Aceste celule sunt mult mai rezistente la pătrunderea şi multiplicarea virusului (Cooper, 1962, citat de Hildebrandt, 1977). Ţinându-se cont de aceste observaţii, s-a reuşit regenerarea de plante sănătoase din calus de cartof infectat cu virusul X. Supunând calusul de Nicotiana rustica unui tratament termic, Walkey (1978) a reuşit devirozarea completă a acestuia. Mori şi colab. (1982) au obţinut plante libere de virusuri din protoplaşti izolaţi din frunze infectate cu virusul mozaicului tutunului.
146
Capitolul 7 Organogeneza in vitro Organele şi ţesuturile cultivate in vitro în anumite condiţii au capacitatea de a diferenţia centri meristematici (foto 7.1.) care ulterior dau naştere la lăstari sau rădăcini, iar uneori la structuri de tip embrioid.
Foto 7.1. Centri meristematici formaţi pe limbul foliar de kiwi (Actinidia deliciosa) Formarea adventivă a lăstarilor şi rădăcinilor poartă denumirea de organogeneză. Aceasta poate fi de două feluri: directă sau indirectă, după cum organele respective se formează, direct sau se trece printr-o fază intermediară de calus.
7.1. Organogeneza directă 7.1.1. Organogeneza adventivă de lăstari Organogeneza adventivă de lăstari constă în regenerarea directă a unor lăstari adventivi pornind de la diferite tipuri de organe şi ţesuturi. Metoda este folosită pe scară largă la specii care regenerează uşor: Saintpaulia, Begonia, Achimenes Streptocarpus, Lilium, Hyacinthus, Nerine etc.
147
Factorii care influenţează pozitiv organogeneza şi formarea lăstarilor adventivi sunt numeroşi: - plantele juvenile au o capacitate organogenetică ridicată; la gimnosperme regenerarea de lăstari adventivi este posibilă doar folosind embrioni, puieţi tineri sau părţi ale acestora (David, 1982). - zaharurile stimulează organogeneza directă cu formarea de lăstari; - giberelinele şi acidul abscisic inhibă organogeneza; - lumina stimulează în general procesul de organogeneză. Există însă o serie de plante care necesită o perioadă de întuneric: muguri floriferi de Freesia
(Pierik şi Steegmans, 1975b) pedunculi de Nerine bowdenii (Pierik şi
Steegmans, 1986a). Rezultatele obţinute de Standardi A, Ferradini Nicoleta, Stănică F, au dovedit importanţa întunericului în faza de inducţie pentru stimularea organogenezei adventive din limb foliar la portaltoiul de măr M-27 (1996). - culoarea roşie are efect stimulativ la regenerarea lăstarilor adventivi de Petunia hybrida (Economou şi Read, 1986). - temperatura ridicată stimulează formarea de lăstari adventivi la marea majoritate a speciilor horticole. Face excepţie Begonia (Heide, 1965) Streptocarpus (Appelgren şi Heide, 1972). - poziţia explantului, importantă. În cazul limbului foliar la majoritatea speciilor, acesta trebuie aşezat cu pagina inferioară pe mediu. Uneori se recomandă crestarea nervurilor frunzei înainte de inoculare. Cercetările lui Pierik, 1987 au demonstrat creşterea numărului de lăstari inoculaţi la Kalanchoe forinacea prin aşezarea explantelor în poziţie verticală. - hormonii de creştere influenţează organozeneza în mod diferit; există specii care nu necesită aport suplimentar de auxine sau citochinine pentru declanşarea organogenezei chiar dacă aceste substanţe stimulează apoi procesul respectiv: honesty (Pierik, 1967), cicoarea (Pierik, 1966), Streptocarpus (Appelgren şi Heide, 1972). - marea majoritate a speciilor formează lăstari adventivi în prezenţa citochininelor în timp ce auxinele inhibă procesul. Uneori acest lucru este posibil şi atunci când este vorba de explante de tipul peţiolului, rădăcinilor sau internodurilor (Stănică, F., 1995). - puţine specii au nevoie de auxine: crinul (van Aartrijk, 1984), zambila (Pierik şi Steegmans, 1975d)
148
- raportul citochinine:auxine trebuie să încline în favoarea primelor, fapt demonstrat la Begonia (Heide, 1965), hrean (Wurm, 1960), conopidă (Margara, 1969), cicoare (Diaconescu, 2002). Cicoarea witloof (Cichorium intybus L.) are capacitatea de a forma in vitro noduli meristematici pe explantele foliare aşezate cu partea superioară în contact cu mediul de cultură (foto 7.2.). Cea mai mare rată de regenerare s-a observat la o balanţă hormonală alcătuită din 0,1 mg/l AIB şi 1,0 mg/l BAP.
Foto 7.2. Regenerare de noduli meristematici din limb foliar la Cichorium intybus L. - cea mai folosită citochinină este BAP iar pentru gimnosperme este singura recomandată. Celelalte citochinine sunt mai puţin folosite. - concentraţii ridicate de citochinine (BAP) pot determina dereglarea procesului de organogeneză. Se recomandă în această situaţie alternarea culturii pe două medii cu concentraţii diferite de BAP. - zeatina a avut un rol important în procesele de organogeneză la kiwi folosind diferite tipuri de explante (Stănică, F. şi colab. 1995, 1998) (foto 7.3. a, b şi c). - tidiazuronul (TDZ) şi 2 izopentiladenina (2iP) au determinat efecte spectaculoase de stimulare a lăstăririi adventive. Din acest motiv cele trei substanţe sunt mult folosite în lucrările de cercetare în ultimii ani în ciuda preţurilor de cost ridicate. - adenina sulfat poate stimula organogeneza adventivă la Begonia (Ringe şi Hitsch, 1968), tutun (Skoog şi Tsui, 1948), ulm (Jacquiot, 1951). În combinaţie cu citochininele, adenina sulfat a stimulat formarea lăstarilor adventivi (Skoog şi Miller, 1957; Nitsch şi colab. 1969a).
149
a
b
c Foto 7.3. Organogeneză directă de lăstari din rădăcini (a), peţiol (b) şi limb foliar (c) la kiwi (Actinidia sp.) - acidul abscisic inhibă formarea lăstarilor adventivi la marea majoritate a speciilor, excepţie făcând batatul (Yamanguchi şi Nakajima, 1974) - etilena are şi ea un rol important în formarea bulbilor adeventivi la arin (van Aartrijk, 1984). - substanţele antiauxinice, cele care inhibă transportul auxinelor (TIBA) au ca efect stimularea organogenezei adventive. - vitaminele stimulează formarea lăstarilor adventivi la ciclamen (Mayer 1956), ulm (Jacquiot, 1951), hrean (Wurm, 1960). - infectarea materialului iniţial cu A. tumefaciens rasa C58, stimulează organogeneza adventivă la cartof, plop, tutun (Ooms şi colab., 1983, Steffen şi colab. 1986). Efectul s-ar datora şi juvenilizării materialului iniţial datorită acţiunii bacteriei. Datorită multiplelor aplicabilităţi ale acestei tehnici, dintre care amintim în primul rând folosirea în transformarea genetică, numărul lucrărilor de cercetare privind organogeneza directă de lăstari la speciile horticole este mare. În tabelele 7.1.1, 7.1.2., 7.1.3., 7.1.4. sunt prezentate câteva din rezultatele cercetării în acest domeniu.
150
Tabelul 7.1.1. Denumirea speciei 1 Allium cepa Asparagus officinalis
Cercetări privind organogeneza de lăstari la plantele legumicole Zaharoză Agar Regulatori de creştere Explant iniţial Mediul de cultură pH (g/l) (g/l) (mg/l) 2 3 4 5 6 7 Lăstari Hussey (1978a) 5,9 30 7 (0-2)ANA+(4) BAP Calus
Nitsch et al, (1969a)
Calus Calus Calus
Pelletier et al, (1972) To Pelletier et al, (1972) To Murashige & Skoog (1962) Linsmaier & Skoog (1965) Yang (1977)
Calus
Brassica oleracea botrytis Brassica oleracea capitata Brassica oleracea gemmifera
Cichorium intybus
30
6
-
20 20 30
5 5 -
5,8
30
8
5,7
30
7
(0,1)ANA + (0,1) Kin
8 Hussey&Falavigna 1980 Bui Dang Ha et al, (1975) Doré (1974) Pelletier et al (1972) Steward & Mapes (1971 b) Wilmar & Hellendoorn (1968) Yang (1977)
(0,090,43)AIA+(0,9)BAP (0,2)BAP (µg/l)
Lăstar cu un mugure Calus
Gamborg et al, (1968) B5
5,5
20
8
(0,5)BAP
Bagga et al (1982)
Calus
Shahin (1985) TM-4
5,8
10
7
(0,99) BAP +(0,1) GA3
Calus
Murashige & Skoog (1962) Gamborg et al (1968) B5
5,7
30
7
-
20
8
(2)AIA + (0,043) Kin + 15% CM (0,3) 2iP
Lillo & Shahin (1986) Dietert et al (1982)
Murashige & Skoog (1962)
5,8
30
6,8
Lăstari Capsicum annuum
Autori
Cotiledon + hipocotil Fragmente de, frunze etiolate (16 mm Ø)
Knop
151
(1)AIA + (1) BAP sau (1) PBA
Ockendon (1984, 1985) Gunay & Rao (1978)
Kin, AIA
Vasseur (1978a)
Tabelul 7.1.1. continuare 1 Cucumis melo
Cucumis sativus Daucus carota Ipomoea batatas Lactuca sativa
Lycopersicon esculentum
Petroselinum hortense
2 3 Fragmente de frunze, Reynolds et al, (1980) cotiledon sau frunze cotiledonare calus Heinz&Mee(1969) Calus si lăstari Heinz&Mee(1969) Calus din Murashige&Skoog (1962) cotiledon Lăstari Thorpe&Murashige(1968; 1970)Sf Fragmente de Murashige&Skoog (1962) rădăcini Cotiledon Doerschung & Miller (1967) Calus Engler & Grogan (1983)DM Calus Murashige&Skoog (1962)
4 5,7
5 40 glucoză
6 8
7 (0,1)NOA+(20) 2iP+(0,1)CCC
5,7 5,7 5,8
30 30 30
8 8 agar
(0,1)BAP (0,1)AIA (1)ANA+(1)BAP
5,8
30
10
5,8
30
8
30
10
5,8
17,1
15
5,7-5,9
20
6
Cotiledon Calus
Yang&Chang(1979) Murashige&Skoog (1962)
5,7
30 30
2 gelrite 8
Hipocotil Ţesut medular Hipocotil Fragmente de frunze Calus Calus
Nitsch et al,(1967)S Murashige&Skoog (1962) Murashige&Skoog (1962) Pence & Caruso (1984)
5,5 5,8 5,8 -
30 3 30 30
8 6 agar 8
30 30
6 10
Shahin (1985) TM –4 5,8 Murashige&Skoog (1962) 5,7-5,9
152
8 Blackmon& Reynolds (1982)
Moreno et al,(1984) Moreno et al,(1984) Wehner&Locy (1981) (2)AIA+(2)Kin+(160)A Smith&Murashige dS (1970) (1)ANA+( 0,1)BAP Carswell&Locy(198 4) (5)AIA+(0,5)Kin Doerschung & Miller (1967) (0,01) 2,4-D+(0,2)Z Engler & Grogan (1983) (10)AIA+(0,04)Kin Vasil & Hildebrandt (1966c) (0,5)AIA+(2)BAP Ammati et al,(1984) [(7)ANA+(2)Z] sau Behki & Lesley [(1)ANA+(2)BAP] (1980) (0-3,5)AIA + (0,2-2)2iP Bigot et al,(1977) (2)Z+(0,01)TIBA Cassells (1979) (0,5)AIA+(2)BAP Gunay&Rao (1980) (1,75) AIA + (2) BAP Pence & Caruso (1984) (0,2) GA3 + (1) Zr Shahin (1985) (10) AIA + (0,04) Kin Vasil & Hildebrandt (1966 b,c)
1 Solanum melongena
Solanum tuberosum
2 Fragmente frunze Calus Fragmente hipocotil Calus 3 cm rădăcină Calus Calus Fragmente tuberculi Calus Fragmente tuberculi Fragmente tuberculi Fragmente lăstari Fragmente lăstari Lăstari Calus
3 Murashige&Skoog (1962) Pelletier et al (1972) To Matsuoka& Hinata (1979) White (1954) Murashige&Skoog (1962) Shepard & Totten (1977) D Murashige & Skoog (1962) Ratnamba & Chopra (1974) Ratnamba & Chopra (1974) Jarret et al (1980 a, b)
4
5 30
6 agar
5,8 5,5
20 20
7,5 8
5,7
20 30 3
agar 0 (agar) 10
5,8
10
7
5,8
30
agar
5,8
30
agar
5,7
30
9
20
9
5,7
20
7
5,7
30
agar
5,7
30
agar
5,8
30
agar
Lam (1975) Murashige & Skoog (1962) Murashige & Skoog (1962) Murashige & Skoog (1962) Murashige & Skoog (1962)
153
Tabelul 7.1.1. continuare 7 8 (0,5 – 10) Kin Gleddie et al (1982) (0,2) BAP (0,0225) BAP + (10) AdS (2-4) AIA + (4-) Kin (0,1 ) AIA + (0,5) Z (1)AIA + (1) BAP + (10) GA3 (0,4) AIA + (0,8) Kin + (0,4) BAP (0,4) AIA + (0,8) Kin + (0,4) BAP (0,03) ANA + (0,3-1) BAP (0,4) AIA + (0,8) Kin + (0,4) GA3 + (0,4) BAP (1) BAP (0,01) ANA + (1) BAP + (0,1) GA3 (0,01) ANA + (1) Kin + (0,1) GA3 (3,63) Zr
Isouard et al (1979) Matsuoka& Hinata (1979) Yamada et al (1967) Zelcer et al (1983) Austin & Cassells (1983) Austin & Cassells (1983) Bragdo – Aas (1977) Bragdo – Aas (1977) Jarret et al (1980 a, b) Lam (1975) Marani & Pisi (1977) Resende & Paiva (1985) Resende & Paiva (1985) Sopory & Tan (1979)
Tabelul 7.1.2. Denumirea speciei 1 Agave sp,
Explant iniţial 2 Calus Calus
Cercetări privind organogeneza de lăstari la plantele floricole Zaharoză Agar Regulatori de creştere Mediul de cultură pH (g/l) (g/l) (mg/l) 3 4 5 6 7 Linsmaier & Skoog 5,8 30 8 (0,2) 2,4-D+(1)Kin (1965) Groenewald et al, 5,8 30 8 (0,2) 2,4-D+(1)Kin (1975) Bapat & 5,8 20 8 (0,5) 2,4-D + (1) Kin + Narayanaswamy (1976) 10% CM
Amaryllis sp,
Calus
Anemone coronaria Anthurium scherzerianum Antirrhinum majus
Fragmente Lăstari Calus
0,5 x Linsmayer & Skoog (1965) Pierik et al (1974)
Lăstari
Begonia rex
Petiol
Begonia semperflorens
Fragmente frunze Frunze sau petiol Frunze
Begonia spp,
Frunze si petioli
Sangwan & Harada (1975) Murashige & Skoog (1962) Schott & Scraudolf (1967) Ranga Swamy (1961) I Bourgin & Nitsch (1967) H Ringe & Nitsch (1968)
Begonia tuberhybrida
Fragmente frunze
Peck & Cumming (1984 a) 1
(0,2) AIA + (2) BAP 40
agar
(0,23) BAP
5,5
20
6
(0,25) NOA +10 % CM
5,8
30
6
(00,1) ANA + (0,1) BAP
20
agar
5,8 5,8
20 20
8 7
5
20
8
5,8
30
6,5
154
(10-20) Ad (0,23) BAP sau (0,31 – 3,1) PBA (1)AIA + (2,3)BAP (1) ANA + (5) BAP + (125) Ad
Autori 8 Groenewald et al, (1977) Groenewald et al, (1977) Bapat & Narayanaswamy (1976) Sutter & Langhans (1978 a,b) Fersing & Lutz (1977) Pfister & Widholm (1984) Cassells & Morrish (1985) Schott & Scraudolf (1967) Sehgal (1975) Thakur (1973) Ringe & Nitsch (1968) Peck & Cumming (1984 a)
1 Camellia japonica
2 Lăstari
3 Samartin et al ( 1984) 1
Chrysanthemum sp.
Calus Fragmente lăstar
Hill (1967) B2 Kaul & Staba (1968)
Lăstari
Murashige & Skoog (1962) Murashige & Skoog (1962) Linsmaier & Skoog (1965) Nitsch & Nitsch (1965) S Robbins & Hervey (1969) BRVS 2 Robbins & Hervey (1969) BRVS 2 Thorpe & Murashige (1968; 1970) Sf Abo El – Nil & Zettler (1976) A Z Linsmaier & Skoog (1965) Kunisaki (1975) Heinz & Mee (1969) Miller & Murashige (1976)
Fragmente lăstari Calus Calus Coleus blumei
Fragmente frunze Lăstari Ţesut medular
Colocasia esculenta
Calus Calus
Cordyline terminalis
Ţesut medular Calus Fragmente lăstari
Tabelul 7.1.2. continuare 7 8 (1) BAP + (0,1) ANA + Samartin et al (20) AdS (1984) (1) Kin Hill (1968) (9) AIA + (2,25) BAP Grewald & Sharma (1978) (20) BAP Staba et al (1984)
4 5,55,6 5,6 6
5 30
6 6
20 30
10 10
5,8
30
10
5,8
30
10
(0,203) BAP
30
5
5,5
20
6
(0,2) ANA + (2) Kin + (10) GA3 (1) 2,4 -D
4,5
20
0
4,5
20
0
5,8
30
10
5,8
20
6
5,8
30
0
5,8 5,6 5
30 20 30
9 9 8
155
Wambugu & Rangan (1981) Bush et al (1975)
Sangwan & Harada (1977) (0,01) ANA + (0,05) Hervey & Robbins BAP (1978) (0,005) ANA + (0,0025) Hervey & Robbins BAP (1978) (2) AIA + (2) Kin + Smith & Murashige (160) AdS (1970) (2) Kin + (0,09-0,93) Abo El – Nil & ANA Zettler (1976) (1) Kin Jackson et al (1977) a (0,5) BAP Kunisaki (1975) 10% CM Mee (1978) (1) AIA + (3) Kin + Miller & Murashige (80)AdS (1976)
1 Dianthus caryophyllus
Dracaena deremensis Dracaena gosetfiana Dracaena marginata Ficus benjamina
2 3 Fragmente Davis et al (1977)MSlăstari 3X Fragmente Davis et al (1977)MSlăstari 3X Fragmente Linsmaier & Skoog lăstari (1965) Fragmente lăstari Murashige&Skoog(1962) Calus Hackett & Anderson (1967) Ţesut medular Debergh (1975) Fragmente lăstari Calus
Ficus lyrata
Fragmente lăstari Frunze
Freesia sp,
Calus
Freesia hybrida
Calus
Fuchsia hybrida
Fragmente lăstari Fragmente lăstari Fragmente lăstari
Gardenia jasminoides
Miller & Murahige (1976) II Murahige & Skoog (1962) Miller & Murahige (1976) II Debelgh & De Waiel (1977) Shoots Bajaj & Pierik (1974) Linsmaier & Skoog (1965) Miller & Murashige (1976) II Gamborg et al, (1968) B5 Economou & Read (1984)
4 5
5 50
6 6
Tabelul 7.1.2. continuare 7 8 (0,19)ANA + (2,15)Kin Davis et al (1977)
5
50
6
(0,05)ANA + (0,54)Kin
Davis et al (1977)
5,7
30
6
(0,1)ANA+(0,5)Kin
30 30
0 agar
(1) Kin (1) ANA
5,8
20
6
(0,1) ANA + (5) Kin
5
30
0
30
8
(1) AIA + (3) Kin + (120) AdS (1) Kin + 15% CM
Earle & Langhans (1975) Gukasyan et al(1977) Hackett & Anderson (1967) Debergh (1975); 1976) Miller & Murashige (1976) Choa et al (1981)
5,8
30
agar
5,8
20
6
(0,3) AIA + (30) 2iP + (80) AdSh (2,5) IBA + (5) BAP
5,8
30
8
(5) Kin
5,6
30
6
(5) Kin
5
30
7
(2-4)BAP+(80)AdS
5
30
0
(3)BAP
5
20
6
(5-10)2iP
156
Makino et al (1977) Debelgh & De Waiel (1977) Bajaj & Pierik (1974) Stimart & Ascher (1978 b, 1982) Harris&Mason (1983) Stevenson&Harris (1980) Economou & Spanoudaki (1985)
1 Gerbera jamesonii
2 Fragmente frunze Fragmente Lăstari Calus
3 Hedtrich (1979)A
4
Hedtrich (1979)A
5 10
6 8
Tabelul 7.1.2. continuare 7 8 (0,1)AIA +(10)BAP Hedtrich (1979)
10
8
(1)BAP+(0,1)GA3
Hedtrich (1979) Meynet & Sibi (1984) Murashige et al (1974) Sitbon (1981)
Meynet & Sibi (1984) 1
5,8
20
8
(0,25)AIA + (1)BAP
Fragmente Lăstari Calus
Murashige et al (1974)
5,7
45
10
Sitbon (1981)1
5,7
45
8
Gladiolus grandiflorus Lilium sp,
Calus
5,8
30
agar
5,7
30
6
(1,1)2,4-D sau BAP
Mammillaria elongata Mammillaria voodsi Monstera deliciosa Narcissus sp,
Tuberculi
Murashige & Skoog (1962) Simmonds & Cumming (1976) Johnson & Emino (1979) Murashige & Skoog (1962) Linsmaier & Skoog (1965) Heinz & Mee (1969)
(0,5)AIA + (10)Kin + (80) AdS (0,5)AIA + (2)BAP + (2)Kin (0,1)ANA + (2)Kin
5,6
45
10
(1)IBA+(10)2iP
5,8
30
8
(2)AIA + (2)Kin
5,7
30
8
(2)AiA + (10)PBA
20
7
Heinz & Mee (1969)
20
7
Hussey (1977a)1 sau 2 sau (1982) Miller & Murashige (1976)III
20-30
7
30
8
(0,03-5)ANA + (28)BAP (0,03-5)ANA + (1-2)BAP (0,25-4)ANA + (216)BAP + (150)AdS (1,1-11)Kin +/(0,93)ANA
Nephrolepsis falcata
Calus
Ţesut medular Fragmente Lăstari Bulbili sau plantule Lăstari Fragmente frunze Fragmente Lăstari
157
Bajaj et al (1983) Simmonds & Cumming (1976) Johnson & Emino (1979) Kolar et al (1976) Fonnesbech & Fonnesbech (1980) Hussey (1976c;1977a) Hussey (1976c;1977a) Hussey (1982) Beck & Caponetti (1983)
1 Nephrolepsis spp
2 Stoloni Rizom
Pelargonium peltatum Pelargonium spp,
Fragmente Lăstari Lăstari
Petunia hybrida
Fragmente frunze Calus
Phalenopsis sp, Phalenopsis sp, Saintpaulia ionantha
Muguri adventivi Muguri dorminzi Peţiol Frunze tinere Fragmente frunze Peţiol Peţiol Peţiol Calus
Sansevieria trifasciata
Meristemoizi
3 0,5x Murashige & Skoog (1962) Miller & Murashige (1976)III Theiler (1977) Beauchesne et al (1977) III sau IV Linsmaier & Skoog (1965) Sangwan & Norreel (1975) Knudson (1946)C
5 30
6 8
7
5,8
30
8
5,65,8
30
0
(2)AIA+(0,04)Kin+ (1,13) BAP (1)IBA + (0,2)Z
Beck & Caponetti (1983) Theiler (1977)
10 glucoză
6-7
30
5
(0,25)AIA + (0,1)2iP + (1)GA3 +/- (2)Ad (0,2)BAP
Beauchesne et al (1977) Daykin et al (1976)
20
agar
(0,1)ANA + (1)BAP
30
agar
(2)ANA
Sangwan & Norreel (1975) Hackett et al (1972)
20
5
(0,3)ANA
5,8
25
8
5,8
30
6
(0,1)ANA + (0,010,5)BAP (1)ANA + (1)BAP
5,7 5,8
30 30
9 8
5,8 5,8
30 30 30
8 6 8
6,3
20
8
5,75,8 5,6
Koch (1974) A Murashige & Skoog (1962) Murashige & Skoog (1962) Cooke (1977) Grunewaldt (1976) Grunewaldt (1977) Harney & Knap (1979) Murashige & Skoog (1962) Murashige & Skoog (1962)
Tabelul 7.1.2. continuare 8 Henson (1979)
4 5,6
158
Pipper & Zimmer (1976) Bilkey et al (1978) Cassells & Plunkett (1984) Cooke (1977) Grunewaldt (1976)
(2)AIA + (0,08)BAP (0,2)AIA+(0,1)2,4-D +(0,4) BAP + 19 % CM (0,8)AIA+(0,5)Kin Grunewaldt (1977) (0,5)ANA + (0,5)Kin Harney&Knap (1979) (1)ANA+(0,5)BAP Weatherhead et al(1982) (0,3) Kin Blazich & Novitzky (1984)
1 Tagetes erecta
2 Muguri Fragmente Lăstari Calus
Tulipa gesneriana
Bulbili
3 Murashige & Skoog (1962) Murashige & Skoog (1962) Murashige & Skoog (1962) Riviere & Muller (1979)
4 5,8
5 30
6 8
5,8
30
8
5,8
30
8
5,5
50 glucoză
6
Tabelul 7.1.2. continuare 7 8 (1)AIA + (3)BAP Kothari & Chandra (1984a) (5)AIA + (3)BAP+ Kothari & Chandra (0,5)GA3 (1984b) (5)AIA + (7)BAP Kothari&Chandra (1984b) Riviere & Muller (1979) Tabelul 7.1.3.
Denumirea speciei 1 Actinidia deliciosa
Amygdalus communis
Ananas comosus
Cercetări privind organogeneza de lăstari la plantele pomicole Zaharoză Agar Regulatori de creştere Explant iniţial Mediul de cultură pH Autori (g/l) (g/l) (mg/l) 2 3 4 5 6 7 8 Fragmente Harada (1975) 5,5 20 7 (1) Z + (40) Ad Harada (1975) rădăcini Fragmente lăstari Murashige&Skoog(1962) 30 Agar (1) Z Kwei et al (1980) Fragmente Monette (1986 a) I 5,7 22,5 0,7 (0,023) IBA + (2) BAP Monette (1986 a) lăstari + (60) AdS Lăstari Hisajima (1982 a) 5,5 30 6 (0,0225) BAP Hisajima (1982 a) Lăstari Hisajima (1982 a) 5,5 30 6 (0,0225)BAP+(0,005) Hisajima (1982 a) IBA Lăstari Murashige & Skoog 5,8 30 9 (0,1) ANA + (0,7) BAP Ruginii & Verma (1962) (1982;1983) Calus Matheus&Rangan (1981) 30 agar 5%CM Matheus&Rangan(1981) Lăstari 0,5xMurashige & 30 0 (0,5-1)IBA Zepeda & Sagawa Skoog (1962) (1981)
159
1 Armeniaca vulgaris Castanea sativa
2 Fragmente lăstari Epicotil
Cerasus avium
Fragmente lăstari Fragmente lăstari Lăstari
3 Skirvin et al,(1980)
4 5,7
5 20
6 agar
30
6
Tabelul 7.1.3. continuare 7 8 Nu sunt mentionate Skirvin et al,(1980)
San Jose et al, (1984) L sau Ha Jones et al (1977)
5,2
30
7
Skirvin et al (1980)
5,7
20
agar
Skirvin & Chu(1978a,b) Hoagland&Snyder (1933) Kitto& Young (1981)S
5,7
30
agar
0
0
30-40
10
(5)BAP+(80)AdS
Radojevic et al,(1975)
20
8-10
(1)Kin+(2)Ad
Calus
Radojevic et al,(1975)
20
8-10
(1)Kin+(2)Ad+(1)GA3
Diospyros kaki
calus
7
(1)ANA + (0,1-1)Kin
Fragmente lăstari
5,65,8 5,6
30
Fragaria
Yokoyama&Takeuchi (1976) Murashige & Skoog (1962)
30
7
Glossularia redinata Juglans hindisii x J, regia
Fragmente lăstari Lăstari
Murashige & Skoog (1962) Extra vitrum
5,5
30
6
(0,2-1)IBA + (1,1)BAP + (1)GA3 sau (0,020,2)IBA+(1,1)BAP (0,1)IBA + (0,49)BAP
Cerasus vulgaris
Citrus sp,
Corylus avellana
Fragmente rădăcini Fragmente lăstari (5mm) Calus
5,65,8
[(0,1)NAN sau IBA] +(2)BAP (0,1)IBA+(1)BAP+ (0,1)GA3
San Jose et al, (1984) Seirlis et al, (1979) Skirvin et al (1980)
(0,1)ANA+(2)BAP
Skirvin et al,(1981b) Murashige et al (1972a) Kitto& Young (1981) Radojevic et al,(1975) Radojevic et al,(1975) Yokoyama&Takeu chi (1976) Anderson et al, (1982) Welander (1985a) Driver & Kuniykuhi (1984)
160
1 Juglans regia
Juglans regia Malus x domestica
3 Chalupa (1981a)A
4
5 30
6 6
Seminţe
0,5 x Rodriguez (1982b)K(h) Rodriguez (1982b)K(h) Jones et al (1977)
5,5
30
6
5,5 5,2
30 30
6 7
5,8 5,8
30 30 20
8 8 agar
20
agar
5,2
30
7
5,2
29,9
7
20
7
5,6
30
8
(0,01)IBA + (0,09 BAp) (1)BAP
5,6
30
8
(10)BAP
Lăstari Fragmente lăstari Cotiledon Calus Calus din cotiled., sau tesut med. Calus din embr. sau lăstari Lăstari
Kartha et al, (1974 a) Kartha et al, (1974 a) White (1943a)A White (1943a)A Jones et al (1977)
Lăstari
Morus alba
Musa acuminata
Tabelul 7.1.3. continuare 7 8 (0,1-0,3)ANA+(0,1Chalupa (1981a) 0,6)BAP +(20)AdS (9)BAP Rodriguez (1982b)
2 Lăstari
(0,4)IBA+(0,4)BAP (0,1)IBA+(1)BAP +(0,1)GA3+(162)PG (1)ANA+(0,3)BAP (1)BAP (4)ANA+(2)Kin +(1)GA3 + 15% CM (2)ANA+(2)BAP + 15% CM (1)IBA+(1)BAP+ (0,1)GA3 (0,1)IBA+(0,48)GA3
Linsmaier & Skoog (1965) Muguri dorminzi Zimmerman / lăstari (1984a)Lep Fragmente Lakshmi-Sita et al lăstari (1976) Fragmente Lakshmi-Sita et al lăstari (1976) Muguri Murashige&Skoog(1962) Lăstari Krikorian & Cronauer (1984) Lăstari Heinz & Mee (1969)
5,6 5,8
30 41
8 0
(10)BAP (4,95)BAP+10%CM
5,8
40
7
(5)BAP + 10% CM
Fragmente lăstari Murashige&Skoog(1962)
5,8
20
8
(10)BAP+15%CM
161
Rodriguez (1982b) Jones et al (1979) Liu et al (1983a) Liu et al (1983a) Mehra & Sachdeva (1979) Mehra & Sachdeva (1979) Snir & Erez (1980) Van Nieuwkirk et al (1986) Zimmerman (1984a) Oka & Ohyama (1981) Oka & Ohyama (1981) Oka&Ohyama(1981) Cronauer & Krikorian (1985a) Cronauer & Krikorian (1985b) Dore Swamy & al (1983)
1 Musa cavendishii
2 Calus
Musa spp,
Lăstari
Musa textilis
Lăstari
Persica vulgaris Phoenix dactylifera
Pistacia vera
Prunus cerasifera
Prunus domestica
3 Murashige & Skoog (1962) Heinz & Mee (1979)
Tabelul 7.1.3. continuare 7 8 (0,3)AIA+(1)Kin sau Ma et al (1978) [(2)BAP+20%CM] (5)BAP Cronauer & Krikorian (1984) (0,1)IBA+(3-5)BAP Mante & Tepper +(160)AdS (1983) (0,1)ANA+(2)BAP Miller et al (1982) (0,1)ANA+(2)BAP Skirvin &Chu (1978a,b) [(0-1)2,4-D sau Tisserat et al (1979) ANA]+(3)2iP +(40)AdS Tisserat (1982)
4
5 30
6 agar
5,8
40
7
30
5-8
20 30
8 agar
30
8
30
8
30 0
8 0
(10)2,4-D
0
7
(4)BAP
30
7
(4)BAP
30
7
(10)2iP+(162) PG
20
0
(0,01)IBA+(1)BAP
30
7
(0,5)BAP
30
7
(1,1)BAP
20
agar
Nu sunt menţionate
Mante & Tepper (1983) 5,7 I Lăstari Miller et al (1982)A Lăstari Skirvin &Chu 5,7 (1978a,b) Fragmente Linsmaier&Skoog 5,7 lăstari (1965) Calus Thompson & Gordon 5,6(1977) 5,8 Fragmente lăstari Tisserat (1984a) 5,6-5,8 Seminţe 0,5xMurashige & 5,8 Skoog (1962) Lăstari Murashige & Skoog 5,8 (1962) 5-8 mm lăstari Murashige & Skoog (1962) Fragmente Miller&Murashige 5,6 lăstari (1976)II Fragmente Kim et al, (1981) 5,8 lăstari Fragmente Linsmaier&Skoog 5,8 lăstari (1965) Fragmente Pietropaolo & Reisch 5,8 lăstari (5-15mm) (1984) Fragmente lăstari Skirvin et al (1980) 5,7 162
Tisserat (1984a) Barghchi&Alderso n (1983) Barghchi&Alderso n (1983) Barghchi&Alderso n (1985) Garland&Stoltz (1981) Hammerschlag (1982b) Norton & Boe (1982) Pietropaolo & Reisch (1984) Skirvin et al (1980)
1 Prunus insititia Pyrus communis
Ribes nigrum
Rubus idaeus
Rubus sp,
Vaccinium sp,
2 Fragmente lăstari Fragmente lăstari Fragmente lăstari Fragmente lăstari Fragmente lăstari Fragmente lăstari Lăstari
3 Jones et al, (1977)
4 5,2
5 30
6 7
Lane (1979b)
5,2
30
7
Murashige & Skoog (1962) Linsmaier & Skoog (1965) Murashige & Skoog (1962) Jones &Vine (1968)B
5,8
30
8
5,75,8 5,7
30
Tabelul 7.1.3. continuare 7 8 (0,1)IBA+(1)BAP+ Jones & Hopgood (0,1)GA3 +(162)PG (19790 (1,13)BAP Lane (1979b)
6
(1,36-2,25)BAP+(1,1)Z +(1,02)2iP (2)BAP
Shen&Mullins (1984) Singha (1982a,c)
20
6
(1,35)BAP
40 glucoză
0
Donnelly et al, (1980)2
5,65,8 5,7
30
agar
(0,1)IBA+(1)BAP
Lăstari
Snir (1981)a
5
20
agar
Lăstari cu noduri Fragmente lăstari Fragmente lăstari Fragmente lăstari
Welander (1985c) Linsmaier & Skoog (1965) Linsmaier & Skoog (1965) Zimmerman & B’ (1980)Z-2
5,2 5,65,8 5,65,8
30 30
6 7
30
0
(0,22)2,4-D +(1)BAP+(0,1)GA3 (1)BAP (1)IBA+(1)BAP +(0,1)GA3 (0,1)IBA+(1)BAP
Flegmann& Wainwright(1981) Jones &Vine (1968) Donnelly et al, (1980) Snir (1981)
30
5,5
163
(4)AIA+(15)2iP +(80)AdSh
Welander (1985c0 Broome & Zimmerman (1978) Donnely et al (1986) Zimmerman & Broome (1980)
Tabelul 7.1.4. Denumirea speciei 1 Acer rubrum x Acer saccharum Betula pendula
Betula verrucosa Biota orientalis (thuja) Chaenomeles japonica Crataegus rachyacantha Crataegus cv, TOBA Fraxinus americana Fraxinus pennsylvanica
Cercetări privind organogeneza de lăstari la arborii şi arbuştii ornamentali Zaharoză Agar Regulatori de creştere Explant Mediul de cultură pH (g/l) (g/l) (mg/l) 2 3 4 5 6 7 Fragmente Murashige&Skoog 5,7 30 10 (0,1-0,5)Thidiazuron lăstari (1962) Calus Simola (1985)N7 5,6 20 6 [(5/10)Z/Zr] + [(0,1/0,2)ANA/NOA] Calus Srivastava&Steinhauer 5,8 40 6 (2)AIA + (6)Kin + (1981a)2 (40)Ad Frunze Srivastava et al (1985) 5,8 30 6,5 (2)AIA + (5)Z + (2)GA3 Fragmente Srivastava et al (1985) 5,8 30 6,5 (0,5)ANA + (5)2iP + rădăcini (30)Ad Calus Chalupa (1981b) 1 30 6 (0,05)IBA+ (0,20,3)BAP + (20)AdS Hipocotil Thomas & Tranvan 5,4 30 8 (0,1) IBA + (1,1)BAP (1982) Fragmente Linsmaier & Skoog 5,8 30 7 (2,5)BAP lăstari (1965) Fragmente Linsmaier & Skoog 5,8 30 7 (0,1-10)BAP lăstari (1965) Fragmente Linsmaier & Skoog 5,8 30 7 (1)BAP lăstari (1965) Fragmente Lloyd & McCown 5,2 20 6 (0,5-1)BAP lăstari (1981) WPM Fragmente Lloyd & McCown 5,2 20 6 (0,5-1)BAP lăstari (1981) WPM
164
Autori 8 Kerns & Meyer (1985) Simola (1985) Srivastava&Steinha uer (1981a) Srivastava et al (1985) Srivastava et al (1985) Chalupa (1981b) Thomas & Tranvan (1982) Norton & Boe (1982) Norton & Norton (1986b) Norton & Boe (1982) Heiman & Preece (1983) Heiman & Preece (1983)
1 Hedera helix Hedera helix Hydrangea macrophylla Larix decidua Paulownia tomentosa Picea abies
Picea glauca
Picea pungens Picea mugo Pinus sylvestris
2 Cotiledon/ hipocotil Calus Ţesut medular Fragmente lăstari Fragmente frunze Hipocotil
3 Banks et al, (1979)
4 5,7
5 30
6 6
Tabelul 7.1.4. continuare 7 8 (0,5)ANA + (0,5)BAP Banks et al, (1979)
Banks et al, (1979) Banks(1979) 1, Gamborg et al, (1968)B5 Bonga (1984) LM
5,7 5,7 5,5
30 30 20
6 5 6
(0,5)ANA + (0,5)BAP (2)ANA + (0,5)BAP (1,8)BAP
Banks et al, (1979) Banks (1979) Bailey et al, (1985)
5,6
30
8
(2,25)BAP
Bonga (1984)
30
8
(3)AIA + (3)Kin
30
8
5,8
30
agar
(0,1)IBA + (1)BAP + (0,1)GA3 (1,3) BAP
5,5
30,8
7
(1,1) BAP
Marcortriginiano & Stimart (1983) Marcortriginiano & Stimart (1983) Bornman & Vogelmann (1984) Bornman (1983)
5,5
30,8
7
5,6 5,6
30 30 30
7 7 7
(0,01) AIA + (2) BAP
5,9
30
8
(1,13) BAP + (1,02) 2iP
5,8
34
8
(2,2) BAP
30 50,5
7 6-7
Murashige & Skoog (1962) Lăstari Murashige & Skoog (1962) Frunze Murashige & Skoog cotiledonare (1962) a:DIT Frunze Bornman (1981) cotiledonare MCMa:B Ace Bornman (1981) MCMa:B Hipocotil Chalupa (1974) WS Muguri Chalupa (1974) WS Hipocotil Campbell & Durzam (1975) Epicotil Rumary & Thorpe (1984) Muguri dorminzi Von Arnold & Eriksson (1977) LP Muguri Champbell&Durzan(1975) Ace Bornman & Janson (1980)
5,65,8 165
Bornman (1983)
(2,25) BAP
Chalupa (1977) Chalupa (1977) Campbell & Durzam (1975) Rumary & Thorpe (1984) Misson et al (1982)
(0,19)ANA + (2,25) BAP Stiff et al (1985) (4,5) BAP Bornman & Janson (1980)
1 Pseudotsuga menziesii
Pyracantha coccinea Quercus robur Rhododendron sp,
2 Muguri Cotiledon Lăstari
Thompson (1981)
Lăstari
Linsmaier & Skoog (1965) Vieitez et al (1985) H + SO4 Ma & Wang (1977) 2 Economou & Read (1984) Lloyd & McCown (1981) WPM Hasegawa (1979)
5,7 5
5,7
30
8
(0,3) AIA + (3) BAP
Skirvin & Chu (1979 a)
5,7
30
10
(0,1) ANA + (2) BAP
40
agar
5,8 4,5
20 30
agar 7
5,2
30
agar
5,2
30
agar
(0,004) ANA + (2) BAP + (0,1) GA3 (0,2) ANA + (0,1) BAP (0,25) AIA + (0,1) ANA (0,02) ANA + (0,2) BAP (0,02) ANA + (1,1) BAP
Fragmente lăstari Lăstari Lăstari
Rosa sp,
Fragmente tulpină Fragmente lăstari Fragmente lăstari Lăstari
Salix madsudana Syringa vulgaris
Lăstari Lăstari
Thuja plicata
Cotiledon
Rosa hybrida
Tabelul 7.1.4. continuare 8 Chalupa (1977)
3 Linsmaier & Skoog (1965) Cheng (1977; 1978)
Fragmente lăstari
Murashige & Skoog (1962) Whitehed & Giles (1976) Start & Cumming (1976)S Coleman & Thorpe (1977) S Coleman & Thorpe (1977) S
4 5,6
5 30
6 7
7
5,5
30
6
30
agar
30
7
(0,001) ANA + (1,125) BAP (22,5) BAP +/- (0,019) ANA (2,5) BAP
30
6
(0,1) BAP
20 20
7 6
(5) Kin (5-20) 2 iP
lichid
(1,6) 2 iP
5,8
5,8
166
Cheah & Cheng (1978) Thompson (1981) Norton & Boe (1982) Vieitez et al (1985) Ma & Wang (1977) Economou & Read (1984) McCown & Lloyd (1981) Bressan et al (1982) Skirvin & Chu (1979 a) Davies (1980) Bhojwani (1980) Hildebrandt & Harney (1983) Coleman & Thorpe (1977) Coleman & Thorpe (1977)
7.1.2. Organogeneza adventivă de rădăcini Formarea adventivă a rădăcinilor in vitro este determinată de un număr mare de factori care influenţează intensitatea şi desfăşurarea procesului: - vârsta şi stadiul de dezvoltare al explantului. În general, explantele tinere, baza lăstarilor, cotiledoanele au capacitate mărită de a diferenţia rădăcini la marea majoritate a speciilor. Fac excepţie de la această regulă Freesia, Lunaria, Nicotiana, Phoenix, Musa şi altele. - poziţia pe plantă a explantului regenerator, în principiu, nu influenţează hotărâtor formarea şi creşterea rădăcinilor adventive. Totuşi se ştie că explantele bazale şi solzii de bulbi au randamente mai mari în acest sens. La pomi şi arbuşti fructiferi şi în general la speciile lemnoase, este importantă atât poziţia pe plantă a explantului cât şi poziţia faţă de soare. - specia şi soiul au rol hotărâtor. Se ştie că plantele erbacee au o capacitate mai mare de a emite rădăcini, acest lucru fiind influenţat şi de prezenţa sau absenţa unor bariere anatomice. - sexul plantei de la care se recoltează materialul biologic este şi el important. S-a observat că la speciile dioice (actinidia, plop, etc.), plantele mascule au o vigoare de creştere superioară şi o capacitate rizogenetică pe măsură. - influenţa mărimii explantului este contradictorie. Cu toate că aparent, explantele de dimensiuni mari ar avea o capacitate mai mare de a forma rădăcini (foto 7.4.), s-a observat că cele de dimensiuni mai mici au format un număr comparabil de rădăcini, datorită, se pare, suprafeţei mai mari de contact cu mediul (foto 7.5.). - orientarea explantelor este esenţială. În mod paradoxal cele mai multe rădăcini sau obţinut la cultivarea lăstarilor (explantelor) cu vârful în jos. Fenomenul se explică prin mai buna oxigenare a ţesuturilor care se află în afara mediului. - numărul de subculturi influenţează diferit formarea rădăcinilor adventive. Efectul este diferit însă, în funcţie de specie şi citochinina folosită. Astfel la Rosaceae în general, numărul de rădăcini scade cu creşterea numărului de subculturi (ex. Chaenomeles). Face excepţie soiul Jonathan la care se petrece fenomenul invers, datorită probabil, creşterii gradului de juvenilizare în timp.
167
Foto 7.4. Volum mare de rădăcini la un explant mare de Hakonechloa aureola
Foto 7.5. Rădăcini lungi la un explant de dimensiuni reduse de curmal chinezesc Ziziphus jujuba În prezenţa 2iP procesul de reducere a capacităţii rizogenetice evoluează rapid, în timp ce BAP-ul atenuează acest fenomen. - prezenţa oxigenului determină formarea rapidă a explantelor după trecerea in vivo. De asemenea, pe mediile lichide trebuie luate obligatoriu măsuri de aerare prin barbotare sau alte mijloace. O variantă bună este şi folosirea mediului de cultură în dublu strat. - lumina influenţează în mod diferit formarea rădăcinilor adventive. Pentru reducerea acestui fenomen se recomandă folosirea cărbunelui activ în mediile de înrădăcinare. La majoritatea speciilor şi în special la Prunus cersifera, efectul negativ este
168
evident. Totuşi, la Helianthus tubeosus şi la crin lumina stimulează formarea rădăcinilor. Acelaşi efect se constată la Petunia când explantele sunt expuse la lumina roşie. - temperatura ridicată influenţează pozitiv procesele de rizogeneză. Fac excepţie Lunaria annuna şi speciile lemnoase care reacţionează mai bine la temperaturi scăzute. - agarul în concentraţie mai scăzută stimulează formarea rădăcinilor. - creşterea conţinutului mediului de cultură în zaharoză, stimulează formarea rădăcinilor la speciile lemnoase. Face excepţie Pseudotsuga menziesii, la care se petrece fenomenul invers. În tabelele 7.2.1, 7.2.2., 7.2.3., 7.2.4., 7.2.5. sunt prezentate câteva rezultate ale cercetărilor privind organogeneza de rădăcini la plantele horticole. 7.2. Organogeneza indirectă Regenerarea unor organe in vitro (lăstari, rădăcini, bulbili, etc.) trecând printr-o fază intermediară de calus, poartă denumirea de organogeneză indirectă.
Foto 7.6. Formarea lăstarilor prin organogeneză indirectă din calus de frunză de kiwi (Actinidia deliciosa) În mod normal calusul formează mai uşor rădăcini decât lăstari (Thomas şi Dovey, 1975). Acest lucru este mai evident pe medii cu conţinut ridicat de auxine şi mai coborât de citochinine. 169
Ca şi în cazul organogenezei directe auxinele sunt necesare în concentraţie mai ridicată în faza de inducţie. În acelaşi timp pe calus se pot forma independent rădăcini sau lăstari. La concentraţii ridicate de citochinine şi scăzute de auxine are loc formarea lăstarilor adventivi. Ctochinina cea mai folosită este benzilaminopurina (BAP). Uneori la baza lăstarilor formaţi se formează simultan şi rădăcini. Formarea lăstarilor din calus este condiţionată de un număr mare de factori: - concentraţia de săruri ridicată (care reduce creşterea) stimulează organogeneza indirectă de lăstari. În acest sens, creşterea concentraţiei de NH4NO3 în cultura de calus stimulează formarea lăstarilor adventivi. (Pierik şi colab., 1976) a demonstrat însă contrariul la Anthurium andreanum, la care, reducerea concentraţiei de NH4NO3 determină creşterea numărului de lăstari adventivi formaţi din calus. - curentul electric 1-2 µA stimulează organogeneza din calus la Nicotiana tabacum.
170
Tabelul 7.2.1. Denumirea speciei 1 Allium cepa
Cercetări privind organogeneza adventivă de rădăcini la plantele legumicole Zaharoză Agar Regulatori de creştere Explant iniţial Mediu pH (g/l) (g/l) (mg/l) 2 3 4 5 6 7 Lăstari Hussey (1978a) 5,9 30 7 (0,5)IBA+(0,12)BAP Calus
Asparagus officinalis
Fragmente rădăcini Lăstari Lăstari Lăstari Lăstari Lăstari
Brassica alba Brassica oleracea botrytis
8 Hussey&Falavigna 1980 Dunstan&Short 1977b White (1938a)
Dunstan&Short (1977a)BDS White (1937a)
5,5
30
8
-
20
lichid
Murashige & Skoog (1962) Gorter (1965) Murashige et al (1972 b)
5,7
30
7
(0,09) ANA + (0,11)Kin
5,7
40 25
20 6
-
20 30
5 agar
5,7
30
7
5,7 5,7 5,8 5,5
30 30 30 20
7 7 agar agar
5,5
41,1
8
5,8
30
lichid
Gorter (1965) (0,3) ANA + (0,1) Kin + Murashige et (40) AdS al.(1972b) Pelletier et al (1972) (0,1) AIA Steward&Mapes(19 71b) (0,05-0,1)ANA+(0Yang & Clore 0,05)Kin (1973) (0,01-0,1) ANA Yang&Clore(1974a,b) (0,1)ANA Yang (1977) AIA Leelavahti et al(1984) (2) ANA + (0,5)BAP Tejovathi & Anwar (1984) Concentraţie ridicată de Trimboli et al (1977) IBA (8) AIA + (0-0,25) Kin Walkey & Woolfitt (1970)
Pelletier et al. (1972) To Murashige & Skoog (1962) Lăstari Murashige & Skoog (1962) Lăstari Murashige&Skoog (1962) Lăstari Yang (1977) Lăstari Murashige&Skoog (1962) Calus sub lumină Gamborg et al (1968) B5 roşie Lăstari De Fossard et al (1974a) H-ZH Lăstari Linsmaier & Skoog (1965)
171
(0,05-2)ANA+(2-8)2iP
Autori
Chin (1982)
1 Brassica oleracea capitata Brassica oleracea gemmifera Capsicum annuum
2 Lăstari
3 Shahin (1985) TM-4
4 5,8
5 10
6 7
Lăstari
Gamborg et al (1968) B5
-
20
8
Muguri
Phillips & Hubstenb’ (1984, 1985)
5,8
30 glucoză
8
5,7
30 30 30
8 9 10
20/40
lichid
Cichorium intybus Fragmente rădăcini cilindrice (6/2mm) Lăstari Cucumis melo Hipocotil Cucurbita pepo Lăstari Daucus carota
Ipomoea batatas
Fragmente rădăcini Calus Lăstari Lăstari Lăstari
Heinz&Mee(1969) Jelaska et al. (1985) Tran Than Van (1973)
5,8
Bonner (1940b)C Halperin (1966)B Linsmaier&Skoog (1965) Elliot(1969)M-S Murashige & Skoog (1962) Murashige&Skoog (1962) Murashige & Skoog (1962) Kartha et al.(1974a)
5,6 5,8 5,8 5,8
20 30 30 30
lichid 10 agar 8
5,8 5,8
30 30
8 8
5,8
30
8
Lăstari adventivi Murashige&Skoog (1962) Lăstari Shepard (1982)T
5,8 5,6
30 58,2
8 5
(40)AdS
5,8
30
10
(1)IBA
Calus Lăstari Lactuca sativa
Heller
Tabelul 7.2.1. continuare 8 Lillo & Shahin (1986) Ockendon (1984, 1985) (0,05) AIA + (0,05) BAP Phillips & Hubstenb (1984, 1985) Vasseur şi co. ANA, kin, GA (1986) +/-(0,01-0,1)AIA sau ANA Moreno et al.(1984) (1-32) AIA Jelaska et al. (1985) (8)AIA Pink & Walkey (1984) Bonner (1940b) 7
Lăstari
Lăstari
Miller (1961a,1963)
172
(0,1)AIA (1)ANA (1)BAP sau [(1)AIA+(1)Kin] (1)ANA+(0,1)BAP (1)ANA+(0,1)BAP
Halperin (1966) Smith&Murashige(1970) Elliot(1969) Litz&Conover(1978 b) Carswell&Locy(1984) Carswell&Locy (1984) Bloksberg&Saltveit (1985) Brown et al (1986) Engler & Grogan (1983) Koevary et al (1978)
1 Lycopersicon esculentum
2 Lăstari Fragmente rădăcini Fragmente rădăcini Lăstari Fragmente rădăcini Hipocotil
Pisum sativum
Raphanus sativus
Lăstari Fragmente de frunze Fragmente de rădăcini Fragmente de rădăcini Fragmente de rădăcini Fragmente de rădăcini Fragm. rădăcini Fragmente de rădăcini Fragmente de rădăcini Fragmente de rădăcini
3 Yang&Chang(1979) Boll&Street(1951) Bonner&Devirian (1939) C 0.5xMurashige&Skoog (1962) Sheat et al. (1959)B
4 5,7
5,8
5 30 20
6 2 gelrite lichid
20
lichid
3
vermiculit
30
7,5
7
Tabelul 7.2.1. continuare 8 Ammati et al.(1984) Boll&Street(1951)
(0,01)ANA
Bonner&Devirian (1939) Cassells (1979) Chin et al. (1981)
Murashige&Skoog (1962) Murashige&Skoog (1962) Pence & Caruso (1984)
5,8
30
agar
(2)Kin
Gunay&Rao (1980)
5,8 -
30 30
agar 8
(0,5)AIA (17,5) AIA/ (25) IA, Ala/ (23,4) IA, Gly
White (1937 a)
-
20
lichid
Gunay&Rao (1980) Pence & Caruso (1984) White (1937)
Bonner & Addicott (1937) 1 sau 2 Bonner & Devirian (1939) A Robbins (1922 a)
-
40
lichid
-
40
lichid
-
20 glucoză
lichid
Torrey (1956) Bonner & Devirian (1939) A White (1937 a)
6-6,4 -
40 40
lichid lichid
(1,75) AIA + (42) Ad
-
20
lichid
-
Torrey (1956) Bonner & Devirian (1939) White (1938 a)
White (1943 a) B
-
20
lichid
-
White (1943 a)
173
Bonner & Addicott (1937) Bonner & Devirian (1939) Robbins (1922 a)
1 Solanum melongena Solanum tuberosum
2 Fragmente de hipocotil Lăstari Lăstari Lăstari
3 Matsuoka& Hinata (1979) Ratnamba & Chopra (1974) Murashige & Skoog (1962) Supl Murashige & Skoog (1962)
Tabelul 7.2.1. continuare 7 8 (0,016)ANA + (10)AdS Matsuoka& Hinata (1979) Bragdo – Aas (1977)
4 5,5
5 20
6 8
5,8
30
agar
5,8
10
lichid
(0,1) AIA
5,7
20
7
(1) IBA
Goodwin et al (1980 b) Marani & Pisi (1977) Tabelul 7.2.2.
Denumirea speciei 1 Amaryllis sp,
Cercetări privind organogeneza adventivă de rădăcini la plantele floricole Zaharoză Agar Regulatori de creştere Explant iniţial Mediu pH (g/l) (g/l) (mg/l) 2 3 4 5 6 7 Lăstari White (1943 a) A 10 agar Calus
Pierik et al (1974)
40
agar
(0,23) BAP
Lăstari
Pierik et al (1974)
10
agar
(0,002 – 0,02) 2,4-D
Lăstari
Pierik et al (1974)
30
7
(0,1) AIA
Antirrhinum majus
Lăstari
Bourgin & Nitsch (1967)
5,5
10
8
Begonia semperflorens
Frunze
Bourgin & Nitsch (1967) H
5,8
20
7
Anthurium andraeanum Anthurium scherzerianum
174
(0,18)AIA sau (0,2) IBA sau (0,19) ANA
Autori 8 Bapat & Narayanaswamy (1976) Fersing & Lutz (1977) Fersing & Lutz (1977) Pierik & Steegmas (1976 a) Pfister & Widholm (1984) Thakur (1973)
1 Caladium bicolor Camellia japonica Cattleya sp,
2 Calus Lăstari Protocorm
3 Murashige&Skoog (1962) Samartin et al ( 1984) 2 Knudson (1946) C
4 5,8 5,5
5 30 30 20
6 agar 6 agar
Chrysanthemum sp,
Lăstari
5,8
30
10
Coleus blumei
Lăstari Lăstari
Murashige & Skoog (1962) Linsmaier&Skoog (1965) Linsmaier & Skoog (1965) Abo El – Nil & Zettler (1976) A Z Murashige & Skoog (1962) Kunisaki (1975) Ball & Arditti (1976) S Morell (1974)B Linsmaier & Skoog (1965) Engvild (1972) Gukasyan et al (1977) Vieitez&Vieitez (1980 b) Petru & Landa (1974) A Petru & Landa (1974) A Murashige & Skoog (1962) Linsmaier&Skoo(1965) Miller & Murahige (1976) II
5,8
30 30
5 10
5,8
20
6
5,8
30
6
5,8 5,8 5,5 5,7
30 30 20 30
9 13 8 6 10 7 7
5,8
30 0,2 30 30 20 30
5
30 30
6 0
Colocasia esculenta Cordyline terminalis Dendrobium sp, Dianthus caryophyllus
Lăstari Lăstari Lăstari Lăstari Protocorm Lăstari Calus Lăstari Lăstari Lăstari Lăstari Lăstari
Dracaena fragrans Dracaena gosetfiana
Internod Lăstari
5,8
175
8
Tabelul 7.2.2. continuare 7 8 (1) ANA +(1) BAP Sahavacharin (1982) Samartin et al (1984) Lindemann et al (1970) (0,205) ANA Wambugu & Rangan (1981) (0,02) ANA Bush et al (1975) (0,1)AIA Smith & Murashige (1970) (1,9) ANA + (0,09) 2iP Abo El – Nil & Zettler (1976) Evaldsson & Welander (1985) Kunisaki (1975) (0,1) AIA Ball&Arditti (1976) (1) ANA Morell (1974) Earle & Langhans (1975) Engvild (1972) (1)ANA Gukasyan et al (1977) Leshem (1986) Petru&Landa (1974) A (0,4) AIA + (5) Ad Petru & Landa (1974) A (0,1) AIA Roest & Bokelmann (1981) (1) 2,4-D + (0,3) BAP Hunault (1976) (10) AIA Miller & Murashige (1976)
1 Dracaena marginata Ficus benjamina
2 Lăstari
Ficus lyrata
Lăstari
Lăstari
Lăstari Gardenia jasminoides
Lăstari Lăstari
Gerbera jamesonii
Hyacinthus orientalis Iris sp, Mammillaria carmenae Mammillaria elongata Mammillaria prolifera Monstera deliciosa
Lăstari Lăstari Lăstari Lăstari Bulbili Calus Lăstari Tuberculi Lăstari Lăstari
3 Murahige & Skoog (1962) Miller & Murahige (1976) II Debelgh & De Waiel (1977) Roots Gamborg et al, (1968) B5 Extra Vitrum 0,25xMurashige & Skoog (19620 Murashige et al (1974) Pierik & Woets (1971)A Pierik et al (1975) Sitbon (1981)1 Kim et al (1981) Meyer et al (1975) Vyskot & Bezdek (1984)1 sau 2 Johnson & Emino (1979) Vyskot & Bezdek (1984)1 sau 2 Linsmaier & Skoog (1965)
Tabelul 7.2.2. continuare 7 8 (1) ANA + 15% CM Choa et al (1981)
4 6
5 30
6 8
5,8
30
Agar
Makino et al (1977)
5,8
20
6
5
30
0
5,8
20
8
5,7 5,7 5,7
45 30 30 45 30
10 6 6 8 8
(10)AIA (1)AIA (10)AIA (1)IBA (0,1)ANA
Debelgh & De Waiel (1977) Stevenson&Harris (1980) Economou & Spanoudaki (1985) Beyl & Sharma (1983) Murashige&al (1974) Pierik et al (1973) Pierik et al (1975) Sitbon (1981) Kim et al (1981)
5,8 5,5
30 30
6 agar
(1)ANA
Meyer et al (1975) Vyskot &Jara (1984)
5,6
45
10
5,5
30
agar
5,7
30
8
176
(60)[ANA sai IBA] + (1- Johnson & Emino 2) (Kin sau 2iP) (1979) (1)AIA Vyskot &Jara (1984) (2)AiA
Fonnesbech & Fonnesbech (1980)
1 Narcissus sp,
2 Lăstari
Nephrolepsis cordifolia Nephrolepsis falcata
Calus Lăstari
Oncidium lanceanum Oncidium varicosum
Protocorm Lăstari
Petunia hybrida
Lăstari Lăstari
Saintpaulia ionantha
Sansevieria trifasciata Tagetes erecta
Lăstari Lăstari Lăstari Lăstari Lăstari Lăstari Lăstari
3 4 0,5xMurashige & Skoog 5,4-5,6 (1962) Steeves et al (1955)2
6 6
20
agar
30
8
20 20
10 8
30 20
5 agar
10 30
agar 6
5,8 6,3
30 30 15 30 20
9 8 6 8 8
5,8 5,8
30 30
8 8
(0,5)IBA +(0,5)GA3 (1)AIA + (1)Kin
5,8
30
0
(0,5)IBA + (0,5)GA3
Miller & Murashige (1976)III Lim-Ho (1982) VW Dalla Rosa & Laneri 5,5 (1977) KO7 Linsmaier& Skoog (1965) 5,7-5,8 Sangwan & Norreel (1975) 5,6 Sharma & Mitra (1976) R Murashige & Skoog (1962) Cooke (1977) Grunewaldt (1976) Harney & Knap (1979) Murashige&Skoog (1962) Murashige&Skoog (1962)
Lăstari Murashige&Skoog (1962) Fragmente frunze Murashige & Skoog (1962) Lăstari Murashige & Skoog (1962)
5,8 5,7 5,8
177
7
Tabelul 7.2.2. continuare 8 Seabrook et al (1976)
5 15
7,5% CM
(0,1)ANA (0,5-1)AIA
(2)AIA (1)IBA
Sulklyan & Mehra (1977) Beck & Caponetti (1983) Lim-Ho (1982) Kerbauy (1984b) Daykin et al (1976) Sangwan & Norreel (1975) Sharma Mitra (1976) Cassells & Plunkett (1984) Cooke (1977) Grunewaldt (1976) Harney&Knap (1979) Weatherhead et al (1982) Blazich & Novitzky (1984) Kothari & Chandra (1984a) Kothari & Chandra (1984a) Kothari & Chandra (1984b)
Tabelul 7.2.3. Cercetări privind organogeneza adventivă de rădăcini la plantele pomicole Zaharoză Agar Regulatori de creştere Denumirea Explant Mediul de cultură pH (g/l) (g/l) (mg/l) speciei 1 2 3 4 5 6 7 0,5 x Murashige & 10 agar Actinidia deliciosa Fragmente lăstari Skoog (1962) Lăstari Extra vitrum Lăstari 0,25 x Hisajima (1982 5,5 30 6 (1) IBA Amygdalus a) communis lăstari Ruginii & Verma 5,8 30 Verm (0,1) ANA + (0,7) BAP (1982) R Lăstari Murashige & Skoog 30 0 (0,18)ANA+ (0,4)IBA Ananas comosus (1962) (agar) Lăstari Ranga Swamy (1961)I 30 agar (0,05)ANA+(0,4)IBA+( 2)Kin Lăstari 0,5xMurashige & 30 agar Skoog (1962) Lăstari 0,13 x 5,7 3, 5-6 (0,1-2)ANA Armeniaca Murashige&Skoog(196 vulgaris 2) Lăstari Snir & Erez (1980)R 5,3 20 7 (0,5)ANA Lăstari Yang et al, (1986) 5,5 20 6,5 Castanea mollissima Lăstari 0,5 x Rodriguez 5,5 30 6 (1)IBA Castanea sativa (1982b) K(h) Lăstari Vieitez et al 30 6 (0,5-1)BAP (!983)MS(N/2)/2 Lăstari Vieitez & 5,5 30 6 (1)IBA Vieitez(1980a) 2
178
Autori 8 Kwei et al (1980) Monette (1986 a) Hisajima (1982 a) Ruginii & Verma (1982;1983) Matheus & Rangan (1979) Matheus & Rangan (1981) Zepeda & Sagawa (1981) Skirvin et al,(1980) Snir (1984) Yang et al,(1986) Rodriguez (1982c) San Jose et al (1984) Vieitez & Vieitez(1980a)
1 Cerasus avium
2 Calus
Cerasus vulgaris
Lăstari Lăstari Lăstari
Ficus carica
Lăstari
Glossularia redinata Juglans regia Malus x domestica
4 5,3
5 30
6 0
5,2 5,7
30 30
7 5-6
5,7
20
6
5,8
30
8
5,2
30
7
5,6
30
7
5,6 5,5
22 glucoză 30
7 6 6 8
Lăstari Lăstari
Murashige & Skoog (1962) Linsmaier & Skoog (1965) Murashige & Skoog (1962) Boxus (1974a) Welander (1985a)
Lăstari Cotiledon
0,5 x Chalupa (1981a)A 0,5xCheng (1975)Basal
5,5
5-10 30
Lăstari
Jones et al (1977)
5,2
30
7
Lăstari Lăstari
Murashige&Skoog (1962) Kartha et al, (1974 a)
5,3 5,8
20 30
7 8
20
agar
20 15
7 0
Lăstari Fragaria
3 Murashige & Skoog (1962) Jones et al (1977) 0,13xMurashige&Skoog (1962) Skirvin et al, (1981) MS-H2
Lăstari
Calus din sămânţă, White (1943a)A cotiledon sau frunză Lăstari Snir & Erez (1980) Lăstari Linsmaier&Skoog (1965)
5,8 5,2 179
Tabelul 7.2.3. continuare 7 8 (1)ANA+[(1)IBA sau Feucht & Dausend (1)ABA] (1976) (1)IBA+(0,1)GA3 Seirlis et al, (1979) (0,1-2ANA) Skirvin et al,(1980) (3)IBA+(1)ANA+ (0,04)Kin+(0,01)BAP+( 0,1)GA3 (0,15)ANA+(0,5)IBA (1)IBA+(0,1)GA3+ (89)PG (0,4-1)IBA
Skirvin et al, (1981b) Muriithi et al, (1982) Pontikis & Melas (1986) Anderson et al, (1982) Boxus et al, (1974) Welander (1985a)
(0,3)ANA+(0,3)IBA Chalupa (1981a) (7,4)ANA+[(0,45)BAP Rodriguez (1982a) sau (0,43)Kin] (03)IBA+(0,1)GA3+ Jones et al (1979) (162)PG apoi (0,1)GA3 (1,9)ANA Lane (1979) (0,03-0,3)AIA+ Liu et al (1983a) (0,01)ANA (4)ANA+(2)Kin Mehra & Sachdeva +(1)GA3 + 15% CM (1979) (1)IBA Snir & Erez (1980) (0,3)IBA Nieuwkirk&al(1986)
1 Mangifera indica
2 Cotiledon
Morus alba
Frunze, peţiol, lăstari Lăstari
Musa acuminata
Lăstari Lăstari Musa spp,
Lăstari Calus
Musa textilis
Lăstari Lăstari
Olea europaea
Lăstari
Persica vulgaris
Lăstari Lăstari Lăstari
Phoenix dactylifera
Plantule Lăstari
3 Murashige & Skoog (1962) Lakshmi-Sita et al (1976) Krikorian & Cronauer (1984) Heinz & Mee (1969) Murashige & Skoog (1962) Heinz & Mee (1979) Linsmaier & Skoog (1965) Wong (1986) Mante & Tepper (1983) I Colomas (1971) Miller et al (1982)A 0,13xMurashige & Skoog (1962) Skirvin et al (1981) MS-H Thompson & Gordon (1977) Tisserat (1984a)
Tabelul 7.2.3. continuare 7 8 (5)ANA+(2,5)Kin Rao et al, (1982) +15%CM (0,1)ANA Oka & Ohyama (1981) (1)ANA+10%CM Cronauer & Krikorian (1985a) (1)ANA + 10% CM Cronauer & Krikorian (1985b) (5)IBA Dore Swamy et al (1983) (1)ANA, AIA sau IBA Cronauer & Krikorian (1984) Jarret et al (1985b)
4
5 40
6 agar
5,6
30
8
5,8
41
0
5,8
40
7
5,8
20
8
5,8
40
7
5,6
30
3
5,7 5,7
20 30
7 5-8
5,8
30
6
(5)BAP (0,1-1)ANA sau (2-10)IBA (2-4)ANA
5,7
20 30
8 5-6
(0,1)ANA (0,1-2)ANA
5,7
20
6
Skirvin et al (1981)
5,6-5,8
30
8
(3)IBA+(1)ANA+ (0,1)GA3+(0,04)Kin 1+(0,01)BAP (0,1)ANA
5,6-5,8
30
8
(0,1)ANA
Tisserat (1984a)
180
Wong (1986) Mante & Tepper (1983) Rugini&Fontanazza (1981) Miller et al (1982) Skirvin et al (1980)
Tisserat (1982)
1 Pistacia vera
2 Lăstari Lăstari
Prunus cerasifera
Lăstari Lăstari Lăstari
Prunus domestica
Fragmente lăstari (7-12 mm) Lăstari
3 Murashige & Skoog (1962) Pierik et al (1974)
4 5,8
0,5 x Murashige & Skoog (1962) 0,5 x Kim et al, (1981)
5,75,8 5,8
Linsmaier&Skoog (1965) Pietropaolo & Reisch (1984)
Tabelul 7.2.3. continuare 8 Barghchi&Alderson (1983) (2,5)IBA Barghchi&Alderson (1985) (2)IBA Garland&Stoltz (1981) [(2,5)AIA+(0,1)GA3] Hammerschlag sau (5)AIA (1982b) (0,5-2,5)IBA Norton & Boe (1982) (0,5-2,5)IBA/5 săpt Pietropaolo & sau Reisch (1984) (2-6,1)IBA/3 săpt (0,1-2)ANA Skirvin et al (1980)
5 0
6 7
7
30
7
30
7
20
agar
5,8
30
7
5,8
30
7
5,7
30
5,6
5,2
30
7
30 40 glucoza
7 0
30 30 30
10 6 6
(3)IBA+(0,1)GA3 +(162)PG Auxina (1)IBA+(0,2)BAP +(1)GA3 (1)AIA+(1)Kin (0,1)IBA (1)IBA
Prunus insititia
Lăstari
0,13 x Murashige&Skoog (1962) Jones et al, (1977)
Pyrus communis Ribes nigrum
Lăstari Fragmente lăstari
Lane (1979b) Jones &Vine (1968)B
Rubus idaeus
Calus Lăstari Lăstari
Harvey (1967)Basal Anderson (1978;1980) Anderson (1978;1980)
5,2 5,65,8 6 5,7 5,7
Fragmente rădăcini Lăstari Lăstari
Anderson (1978;1980)
5,7
30
6
(0,5)IBA+(80)AdS
Donnelly et al, (1980)2 Hedtrich(1979)B
5,7 5,7
30 20
0 0
(0,5)BAP (0,5)AIA
181
Jones & Hopgood (1979) Lane (1979b) Jones &Vine (1968) Harvey&Grasham (1977) Anderson (1979) Borgman & Mudge (1986) Borgman & Mudge (1986) Donnelly et al, (1980) Gebhardt(1985)
1 Rubus sp,
Theobroma cacao
Vaccinium corymbosum Vaccinium sp,
2 Lăstari (7-15 mm) Lăstari Fragmente frunze Lăstari
3 Linsmaier & Skoog (1965) Linsmaier & Skoog (1965) Hall & Collin (1975)
4 5,65,8 5,65,8 5,7
Passey & Jones (1983)
5,2
Lăstari
Extra vitrum
Lăstari
Extra vitrum
Lăstari
Extra vitrum
Lăstari
Extra vitrum
182
5 30
6 7
30
0
30
10
30
7
Tabelul 7.2.3. continuare 8 Broome & Zimmerman (1978) (0,5)IBA Donnely et al (1986) (2)AIA+(0,1)Kin Pence&Janick +10%CM (1978) (0,5)IBA+(0,5)ANA Passey & Jones +(162)PG (1983) Cohen & Elliot(1979) Wolfe et al (1983;1986) Zimmerman&Broo me (1980) Smagula & Lyrene (1984) 7 (1)IBA
Denumirea speciei 1 Betula pendula
Betula verrucosa Biota orientalis (thuja) Chaenomeles japonica Cotoneaster dammeri Crataegus rachyacantha Crataegus cv, TOBA Fraxinus americana Fraxinus pennsylvanica Hedera helix Hydrangea macrophylla
Tabelul 7.2.4. Cercetări privind organogeneza adventivă de rădăcini la arborii şi arbuştii ornamentali Zaharoză Agar Regulatori de creştere Autori Rezultatul Mediul de cultură pH (g/l) (g/l) (mg/l) 2 3 4 5 6 7 8 Lăstari Simola (1985)N7 5,6 20 6 Simola (1985) Lăstari Srivastava&Steinhauer 5,8 40 6 (2)AIA + (6)Kin + Srivastava&Steinha (1981b)MMS (40)Ad uer (1981b) Calus+ lăstari Srivastava et al (1985) 5,8 30 6,5 (1)ANA Srivastava&al (1985) Lăstari Chalupa (1981b) 2 15 6 (0,1)IBA sau (0,1)ANA Chalupa (1981b) Calus Jacquiot (1955) 30 agar (1)ANA Jacquiot (1955) Lăstari Thomas & Tranvan 5,4 30 8 (0,1) IBA + (1,1)BAP Thomas & Tranvan (1982) (1982) Lăstari Linsmaier&Skoog (1965) 5,8 30 7 (10-20)IBA Norton & Boe (1982) Lăstari
Linsmaier&Skoog (1965)
5,8
30
7
(1-5)IBA
Norton & Boe (1982)
Lăstari
Linsmaier&Skoog (1965)
5,8
30
7
(0,5-5)IBA
Norton & Boe (1982)
Lăstari Lăstari
Linsmaier&Skoog (1965) Lloyd & McCown (1981) WPM Lloyd & McCown (1981) WPM Banks et al, (1979) Banks(1979) 1, 0,5 x Murashige&Skoog (1962)
5,8 5,2
30 20
7 6
(5-10)IBA nespecificat
5,2
20
6
nespecificat
5,7 5,7 5,75,8
30 30 20
6 5 7
(1)ANA (1)ANA
Norton & Boe (1982) Heiman & Preece (1983) Heiman & Preece (1983) Banks et al, (1979) Banks (1979) Stoltz (1984)
Lăstari Lăstari Lăstari Lăstari 2-3cm
183
1 Lavandula augustifolia & sp, Paulownia tomentosa
2 Lăstari
3 Kartha et al, (1974a)
Lăstari Lăstari
Ben-Jaacov & Dax (1981) Murashige & Skoog (1962) Lăstari 0,5 x Linsmaier & Picea abies Skoog (1965) Lăstari Bornman & Janson Pinus sylvestris (1980) Lăstari 0,5 x Linsmaier & Pseudiotsuga Skoog (1965) menziesii Lăstari Linsmaier & Skoog Pyracantha (1965) coccinea Lăstari Chalupa (1984 a,b) Quercus robur WPMR Fragmente lăstari Vieitez et al (1985) H + SO4 Lăstari Extra Vitrum Rhododendron spp Lăstari
Kyte & Briggs (1979) R
Rosa hybrida
Lăstari Lăstari Lăstari
Rosa sp,
Lăstari
Salix madsudana
Lăstari
Hasegawa (1979) Hyndman et al (1982a, b) 0,25 x Skirvin & Chu (1979 a) Murashige & Skoog (1962) Whitehed & Giles (1976)
Tabelul 7.2.4. continuare 7 8 (5)AIA + (0,5)BAP + Quazi (1980) (5)GA3 (0,5-1)IBA Burger et al (1985) (1)IBA Marcortriginiano & Stimart (1983) (0,02) ANA Chalupa (1977)
4 5,5
5 20
6 lichid
5,6
30 30
agar 8
5,6
5
7
5,65,8 5,6
50,5
6-7
(1,46) Cumarina
5
7
(0,02) ANA
5,8
30
7
(5-10) IBA
10
6
(0,1) ANA + (0,3) IBA
30
6
5,7 5,7 5,7
5,8
184
Bornman & Janson (1980) Chalupa (1977) Norton & Boe (1982) Chalupa (1984a) Vieitez et al (1985)
30
6
60 70 30
6 8 10
(1) AIA
40
6
+/- (0,05-0,1) ANA
Economou & Read (1984) Kyte & Briggs (1979) Bressan et al (1982) Hyndman et al (1982 a, b) Skirvin & Chu (1979 a) Davies (1980)
20
agar
(0,2) ANA
Bhojwani (1980)
1 Thuja plicata
2 Lăstari
Tilia cordata
Lăstari
Weigela florida
Lăstari
3 Coleman & Thorpe (1977) S Chalupa (1984 a,b) BTMRsau WPMR Murashige&Skoog(1962)
4 5,2
5 30
6 agar
10
6
30
agar
Tabelul 7.2.4. continuare 8 Coleman & Thorpe (1977) (0,1) ANA + (0,3) IBA Chalupa (1984 a, b) 7 (10) IBA
(0,88) AIA
Calvert&Stephens(1986)
] Tabelul 7.2.5. Cercetări privind organogeneza adventivă de rădăcini la viţa de vie Regulatori de Denumirea Zaharoză Agar Explant Rezultat Mediu pH creştere speciei (g/l) (g/l) (mg/l) 1 2 3 4 5 6 7 8 Fragmente Plantule 0.5 x Murashige & 5,8 20 7 (0.02)IBA sau ANA Vitis berlandieri lăstari înrădăcinate Skoog (1962) x V. cardinalis Rădăcini Favre (1977) P7 5,8 20 (20)AIA Internod, Vitis riparia x V. adventive +(0.1)BAP frunze, petiol rupestris Lăstar Lăstar înrădăcinat Gazly (1964) 6,5 15 8 (0.02)ANA Vitis rupestris Fragmente lăstari Lăstari înrădăcinaţi Chee & Pool (1982a) 5,8 30 8 (0.02)ANA Vitis spp Apexuri lăstari Înrădăcinare Webb & Street 30 agar (0.023)BAP Vitis vinifera lăstari (1977)CI Apexuri lăstari Lăstari înrădăcinaţi White (1943a)A 5,8 30 0 (2.2)BAP Vitis vinifera Apexuri lăstari Înrădăcinare Jona & Webb (1979)C 5,7-5,8 20 3-5,5 (0.23)BAP Vitis vinifera Meristeme Lăstar unic, Jona & Webb (1979)C 5,7-5,8 20 3-5,5 (0.023-0.23)BAP Vitis vinifera înrădăcinat Apexuri lăstari Înrădăcinare Stevenson & Monette 5 30 0 (0.1)AIA Vitis vinifera (1983)R
185
Autori 9 Novak&Jujova (1983) Favre (1977) Gazly (1972) Chee&Pool (1982a,b) Aldwinckle & Buturac (1981) Barlass et al (1982) Jona & Webb (1979) Jona & Webb (1979) Stevenson & Monette (1983)
Capitolul 8 Embriogeneza somatică 8.1. Formarea embrionilor somatici Embriogeneza somatică a fost realizată pentru prima dată în 1958 de Reinert şi Steward la morcov, din calus şi suspensie de celule. Tot ei au realizat o paralelă între formarea embrionilor zigotici şi a celor somatici fapt uşurat de folosirea laptelui de cocos în mediul de cultură. Şi alţi reprezentanţi din Fam. Umbeliferae produc uşor embrioni somatici (Thomas şi colab. 1979, ţelină). Formarea embrionilor somatici parcurge mai multe etape: - dediferenţierea celulelor diferenţiate şi începerea diviziunii; - formarea celulelor parenchimatice, începerea diviziunii şi creşterea conţinutului de citoplasmă sub influenţa auxinelor. În urma acestor procese, celulele parenchimatice se transformă în celule embriogenice. Acestea sunt mici, cu conţinut citoplasmatic dens, vacuolă mică, nuclei mari cu nucleoli mari, conţinut mare de grăunciori de amidon. Au activitate metabolică intensă şi o sinteză intensă de ARN; - formarea embrionilor din celule embriogenice în absenţa auxinelor din mediu. Formarea embrionilor somatici se poate face în interiorul calusului, (endogen) sau la exteriorul acestuia (exogen). Embrionii somatici se mai pot forma în ţesutul nucelar şi hipocotil, sau pe organe florale, antere, grăunciori de polen, enndosperm, embrioni zigotici. Embrionii somatică se formează dintr-o singură celulă care se divide şi formează o structură embrioidă. Embriogeneza somatică a fost realizată la 132 de specii din 81 de genuri din familiile: Ranunculaceae, Rutaceae, Solanaceae, Umbeliferae. Graminae etc. (Tisserat, colab., 1979, citaţi de Pierik, 1987).
186
8.2. Embriogeneza somatică directă Embriogeneza directă reprezintă formarea embrionilor somatici sau a ţesuturilor embrionare direct din explantul iniţial. Embrionii somatici se pot forma din celule somatice, din celule nucelare la Citrus, din celule epidermice, din hipocotil de morcov, Ranunculus, Brassica napus. Pentru inducerea şi studierea embriogenezei somatice, cel mai adesea se recurge la culturi de embrioni zigotici imaturi. Ţesutul acestora are un pronunţat caracter embriogenic. Momentul oprim pentru izolarea embrionilor şi inocularea lor in vitro este la aproximativ 14 zile după polenizare. Mediile de cultură folosite conţin cantităţi variabile de auxine, în special 2,4 C şi ANA. După sterilizarea de suprafaţă se face excizarea embrionului imatur şi inocularea lui pe mediu. După aproximativ o săptămână, la o parte dintre explante încep să se diferenţieze embrioni somatici în diferite stadii de dezvoltare. Fazele de evoluţie ale embrionilor somatici sunt: globulară, cordiformă, de torpilă şi cotiledonară (forma de ţăruş). De remarcat dezvoltarea asincronă a embrionilor, fapt care determină suprapunerea diferitelor faze de evoluţie. Acest lucru îngreunează mult orice tentativă de automatizare a culturilor şi sporeşte cheltuielile cu manopera. 8.3. Embriogeneza somatică indirectă Regenerarea unor embrioni somatici din calus poartă denumirea de embriogeneză indirectă. După obţinerea şi multiplicarea calusului (subcapitolul 11.1.) acesta este trecut pe un mediu pe care se realizează inducţia şi formarea embrionilor somatici. După realizarea inducţiei are loc formarea celulelor embriogenice care vor da naştere embrionilor somatici. Capacitatea de regenerare depinde de specie, felul explantului iniţial (floem secundar la morcov, fragmente de frunze la cafea, kiwi, Petunia, Asparagus, cotiledoane, embrioni zigotici la conifere, citrice), vârsta explantului iniţial (gradul de juvenilizare), numărul de subculturi, etc. Unele specii regenerează numai organe şi embrioni somatici. Inducţia embrionilor somatici este condiţionată de un număr însemnat de factori: - concentraţia ridicată de auxine şi în special 2,4 D, determină inducţia embrionilor somatici;
187
- acidul abscisic stimulează formarea embrionilor somatici în culturile de calus şi suspensii celulare; - giberelinele şi etilena inhibă procesele de inducţie; - şansa formării embrionilor somatici creşte la ţesuturile juvenile. La speciile aparţinând genului Citrus, aceştia se formează numai în nucelă; - azotul redus sub formă de ioni de amoniu, potasiul şi concentraţia ridicată de săruri stimulează formarea celulelor embriogenice în masa calusului; în acelaşi timp, ionii de calciu influenţează negativ acest proces; - lumina este un factor stimulator al embriogenezei somatice cu toate că, anumite specii reacţionează mai bine la întuneric; - temperatura ridicată stimulează formarea embrionilor somatici. Atunci când materialul iniţial este reprezentat de antere, acesta necesită la început un şoc cu temperaturi scăzute. - concentraţia de zaharoză de 2-3% şi prezenţa laptelui de cocos au un efect pozitiv asupra inducţiei procesului de embriogeneză somatică. Embriogeneza somatică indirectă rămâne o tehnică mai puţin folosită în practică datorită unor neajunsuri pe care le prezintă: - materialul genetic este relativ instabil în timpul proceselor de embriogeneză, iar riscul apariţiei mutaţiilor face ca metoda să nu fie recomandată la înmulţirea materialului clonal; - este o metodă dificilă pentru că multe specii nu formează embrioni somatici; - prin culturi repetate scade capacitatea de regenerare a calusului; - frecvent formarea embrionilor somatici este asociată cu apariţia fenomenului de dormans care face dificilă sau imposibilă pornirea acestora în “vegetaţie” şi regenerarea unor plante întregi; - formarea scalară a embrionilor face ca procesul să fie destul de greu de gestionat. În tabelele 8.1., 8.2., 8.3. şi 8.4. sunt prezentate principalele realizări în domeniul embriogenezei somatice la plantele horticole.
188
Tabelul 8.1. Denumirea speciei
Explant iniţial
1 Apium graveolens
2 Calus Calus Peţiol Calus
Asparagus officinalis
Calus Calus
Brassica alba Brassica oleracea botrytis
Celule din cultura în suspensie Calus Frunze tinere Calus
Cichorium intybus
Cercetări privind embriogeneza somatică la plantele legumicole Zaharoză Agar Regulatori de creştere Mediu pH (g/l) (g/l) (mg/l) 3 4 5 6 7 Murashige&Skoog 30 lichid (1962) Murashige&Skoog 5,6 30 10 (0,1)ANA+(3)Kin (1962) Murashige&Skoog 30 agar (0,5)2,4-D+(0,6)Kin (1962) Murashige&Skoog 30 lichid (0,5)2,4-D+(0,6)Kin (1962) Nitsch et al. (1969a) 30 6 Murashige & Skoog (1962) Linsmaier & Skoog (1965) Murashige & Skoog (1962) Murashige & Skoog (1962) Murashige & Skoog (1962)
-
30
lichid
(5) ANA
5,8
30
8
(0,01) 2,4-D + (0,1) Kin
5,8
30
agar
(0,1)ANA+(0,1) 2,4-D
5,8
30
agar
(1) AIA + (0,5)Kin
5,8
30
agar
(0,01-0,1)AIA +(0,5)Kin
Segmente de Murashige&Skoog (1962) nervură foliară (2 Gamborg & co. (1968) mm gros) Fragmente rădăcini Murashige şi Skoog 5x5x5 mm (1962)
189
Autori 8 Al-Abta&Collin (1978) Chen (1976) Williams&Collin (1976)& Williams&Collin (1976)& Bui Dang Ha et al. (1975) Steward & Mapes (1971 b) Wilmar & Hellendoorn (1968) Leelavahti et al (1984) Pareek & Chandra (1978 a) Pareek & Chandra (1978 a)
Kin, BA, AIA, ANA, 2,4-D, picloram
Mix (1985)
BA, 2,4-D, 2,4,5-T
Van Dick (1986)
1 Cucumis melo
2 Hipocotil
3 Reynolds et al (1980)
Cucumis sativus Cucurbita pepo
Calus Fragmente hipocotil Suspensie Calus
Lazarte&Sasser (1982)L Murashige & Skoog (1962) Eriksson(1965)1. Halperin&Wetherell (1965)B Halperin (1964) Gamborg et al.(1968)B5 Skirvin&Chu(1979a)
Daucus carota
Ipomoea batatus
Lycopersicon esculentum Petroselinum hortense Pisum sativum Solanum melongena Solanum tuberosum
Segmente peţiol calus Fragmente rădăcină Calus
Murashige & Skoog (1962) Calus Murashige & Skoog (1962) Calus Murashige&Skoog (1962) Calus Murashige&Skoog (1962) Fragmente frunze Murashige&Skoog (1962) Calus Murashige&Skoog (1962) Fragmente Matsuoka& Hinata hipocotil (1979) Fragmente Lam (1975) tuberculi
4 5,7
5 40 glucoza
6 8
0 30 glucoza
agar 9
5,8
40 20
lichid agar
6
20
5,8
30
agar lichid 10
5,65,8 5,8
30
7
20
8
-
30
10
5,8
30 30 30 20
lichid agar lichid 8
20
9
5,5
190
Tabelul 8.1. continuare 7 8 (0,5)2,4-D+(0,5)2,4,5Blackmon et T+(0,5)NOA+(0,5)IBA+ al.(1981b) (0,5)2,4,5-TP+ (0,5)CPA+(0,5)pic+ (0,5)MCPP+(0,1)CCC+ (30)Ad +/-(1)Kin Lazarte&Sasser(1982) (10)IBA apoi (1)IBA in Jaleska (1974) urmatoarele subculturi (0,9)ANA+(0,02 )Kin Fridborg et al.(1978) (0,0005)2,4-D Halperin&Wetherell +(0,001)Kin (1965) (0,1)2,4-D+(2)Ad Halperin (1964) Hari (1980) (0,1)ANA+(2)BAP Hwang et al.(1980) (0,1-3)2,4-D-depinzand de genotip (0,5) AIA + (0,25) Z (10) AIA + (0,04) Kin + (1520) AdS (0,06) pic + (0,1) BAP (10) ANA (10) ANA (8)ANA + (10) AdS (0,4) AIA + (0,8) Kin + (0,4) GA3
Jarret et al. (1984) Zamir et all (1980; 1981) Vasil & Hildebrandt (1966 b,c) Jacobsen & Kysely (1984) Gleddie et al (1982) Gleddie et al (1982) Matsuoka& Hinata (1979) Lam (1975)
Tabelul 8.2. Denumirea speciei 1 Actinidia deliciosa Mangifera indica Phoenix dactylifera
Denumirea speciei 1 Hedera helix Ilex aquifolium Larix decidua Picea abies
Quercus rubra
Cercetări privind embriogeneza somatică la plantele pomicole Zaharoză Agar Regulatori de creştere Explant Mediul de cultură pH (g/l) (g/l) (mg/l) 2 3 4 5 6 7 Fragmente de Harada (1975) 5,5 20 7 [(0,1-1)2,4-D sau rădăcini NOA] + (40) Ad Seminţe imature Litz et al (1984) 5,7 30 0 Fructe imature Litz (1984a) 5,7 60 8 (1)2,4-D Fragmente Linsmaier&Skoog 5,7 30 8 (10-100)2,4-D+(3)2iP lăstari (1965) +(40)AdS Muguri laterali Thompson & Gordon 5,630 8 (100)2,4-D+(3)2iP (1977) 5,8 Calus Tisserat (1984a) 5,630 8 5,8
Autori 8 Harada (1975) Litzet al, (1984b) Litz(1984b) Tisserat et al (1979) Tisserat (1982) Tisserat (1984a)
Tabelul 8.3. Cercetări privind cultura embriogeneza somatică la arborii şi arbuştii ornamentali Zaharoză Agar Regulatori de creştere Explant iniţial Mediul de cultură pH Autori (g/l) (g/l) (mg/l) 2 3 4 5 6 7 8 Calus Banks(1979) 2, 5,7 30 5 (1)ANA + (0,5)BAP Banks (1979) Embrioni Linsmaier&Skoog (1965) 5,6 40 10 Hu & Sussex (1972) Calus Nagmani&Bonga (1985) 5,8 20 8 (2)BAP Nagmani&Bonga(1985) Calus Von Arnold & Erikson 5,8 34,2 5 (2,2) 2,4-D + (1,1) BAP Hakman et al (1981) LPm (1985) Embrioni maturi Von Arnold & Erikson 10 3 (2,21) 2,4-D + (1,13) Von Arnold & (1981) LPm gelrite BAP Hakman (1986) Internod Murashige&Skoog(1962) 30 agar (5) ANA + (0,1) BAP Seckinger&al(1979)
191
Tabelul 8.4. Cercetări privind embriogeneza somatică la viţa de vie Denumirea speciei
Explant
Rezultatul
Mediu
pH
1 Vitis vinifera
2 Calus
6 20
7 0
Embrioizi
5.6
20
agar
(1)2iP+(0.35)GA3
Vitis vinifera
Embrioizi
4 Mullins&Srinivasan (1976)N Mullins&Srinivasan (1976)N White (1954)
5 5.6
Vitis vinifera
3 Calus embriogen Dezvoltare embrioni Plantulă
Regulatori de creştere (mg/l) 8 (1)NOA+(1.1)BAP
5.6
20
agar
Vitis vinifera x Vitis rupestris Vitis vinifera x Vitis rupestris
Calus
2500 embrioizi/flacon 83% plante haploide
Bourgin & Nitsch (18670 H Bourgin & Nitsch (18670 H
20
0
20
agar
Embrioizi
192
Zaharoză Agar (g/l) (g/l)
(1.11)2,4-D + (0.225)BAP
Autori 9 Mullins & Srinivasan (1976) Mullins & Srinivasan (1976) Mullins & Srinivasan (1976) Rajakeran & Mullins (1979) Rajakeran & Mullins (1979)
8.4. Poliembrionia nucelară O serie de specii din genul Citrus formează în mod natural, în aceeaşi sămânţă, pe lângă embrionul zigotic şi unul sau mai mulţi embrioni somatici. Aceşti embrioni iau naştere din celule somatice (diploide ale ţesutului nucelar). Ţesutul nucelar este un ţesut juvenil caracterizat printr-o mare capacitate de regenerare. Prin cultivarea ţesutului nucelar in vitro şi inducerea formării calusului s-au obţinut un mare număr de embrioni somatici la genul Citrus (Rangaswamy, 1981). Formarea embrionilor somatici prin embriogeneză directă sau indirectă a fost posibilă prin cultivarea in vitro a unor ovule fecundate sau nefecundate de Citrus (Litz şi colab. 1985). ANA, citochinina şi compuşii complecşi (lapte de cocos, extractul de drojdie de malţ) stimulează formarea embrionilor somatici. Embriogeneza somatică din ţesut nucelar este prezentă la mango (Mangifera indica) şi la alte specii pomicole tropicale. La fel ca în cazul genului Citrus, la speciile cu tendinţă de poliembrionie in vivo capacitatea o de regenerare a embrionilor somatici in vitro este mai ridicată decât la plantele monoembrionare. Utilizarea poliembrioniei nucelare prezintă o serie de avantaje: permite înmulţirea “în masă” rapidă a speciilor monoembrionare; procesele de embriogeneză somatică sunt însoţite şi de devirozarea materialului vegetal obţinut; în paralel, se pot induce mutaţii şi se pot selecţiona mutantele utile; se realizează juvenilizarea materialului obţinut. În toate cazurile, folosirea pentru înmulţire a embrionilor somatici care conservă caracteristicile genetice ale plantelor mamă, deschide mari perspective în domeniul seminţelor sintetice (Standardi, 1997). 8.5. Încapsularea materialului vegetal in vitro 8.5.1. Sămânţa sintetică Pentru utilizarea în producţie a embrionilor somatici s-a imaginat şi realizat sămânţa sintetică prin crearea unui endosperm artificial, care să protejeze şi eventual să hrănească embrionul. Folosirea embrionilor somatici presupune apelarea la două sisteme pentru menţinerea viabilităţii acestora: - încapsularea în substanţe speciale de tipul gelurilor care conţin substanţe nutritive, regulatori osmotici şi eventual pesticide;
193
- semănatul embrionilor în flux lichid (fluid drilling) folosind sistemele puse la punct pentru semănatul seminţelor preîncolţite de legume sau flori. Avantajele folosirii seminţelor artificiale sunt multiple: - permite obţinerea şi folosirea seminţelor la specii care în mod normal nu produc seminţe; - elimină procedurile greoaie şi costisitoare de obţinere a seminţelor hibride cu toate avantajele care decurg de aici: - se înlătură liniile parentale menţinute pentru hibridări; - se elimină cercetările pentru obţinerea liniilor androsterile; - se elimină polenizarea artificială an de an, hibrizii fiind menţinuţi prin înmulţire vegetativă in vitro. - permite obţinerea de sporuri substanţiale de recoltă prin folosirea unor supergenotipuri; - aduce mari avantaje lucrărilor de ameliorare. Folosirea pe scară largă a seminţelor artificiale este limitată datorită unor greutăţi care apar: - seminţele artificiale trebuie protejate împotriva deshidratării prin folosirea unor învelişuri care să reziste pe timpul păstrării, transportului şi semănatului; - păstrarea seminţelor artificiale presupune folosirea unor substanţe chimice sau agenţi fizici care să menţină embrionul în stare de repaus; - în momentul semănatului trebuie găsite soluţii pentru scoaterea embrionului din repaus şi începerea dezvoltării acestuia; - procentul de plante viabile obţinute este relativ redus datorită unor cauze multiple: - embrionii au grade de dezvoltare diferită; - păstrarea viabilităţii embrionilor este diferită; - crearea condiţiilor optime pentru dezvoltarea embrionilor după semănat este greu de realizat. - embrionul necesită şi o protecţie antipatogenă realizabilă prin înglobarea unor substanţe pesticide. Efectul acesta trebuie să fie de scurtă durată, pentru a nu împiedica ulterior procesele de micorizare. Cea mai răspândită metodă pentru încapsularea embrionilor prin schimb ionic este cea în care se foloseşte alginatul de sodiu.
194
Embrionii sunt scufundaţi în alginat de sodiu 2-4% apoi sunt trecuţi individual în soluţie de clorură de calciu 50 µM, la pH 7. După 20-30 de minute, capsulele de alginat se întăresc (0,5 - 2 kg/cm2) şi pot fi manipulate. Păstrarea se poate face în vase închise ermetic la frigider la (3-6°C) în condiţii aseptice. Alginatul de calciu are avantajul că este ieftin, se gelifică uşor şi nu este toxic. Are însă şi dezavantaje (Hoza, 1996). - permeabilitate mare pentru elementele solubile; - creşterea rădăcinilor lăstarilor este mai lentă; - capsulele sunt lipicioase şi se îngreunează manipularea şi semănatul. 8.5.2. Încapsularea unor organe şi ţesuturi in vitro Ca o extindere a folosirii capsulelor de alginat s-a recurs la încapsularea altor organe, în afara de embrionii somatici. Astfel, multiplele cercetări efectuate de Standardi, A., şi colab., (1994-1998), au dovedit că pot fi încapsulaţi bulbili, obţinuţi in vitro precum şi minibutaşi sau rozete de diferite dimensiuni provenite de la un mare număr de specii: crin, măr, zmeur, kiwi etc. După înglobarea explantelor respective în alginat, acestea au fost păstrate în frigidere la 3-4°C timp îndelungat 6-12 luni, după care s-au trecut din nou pe un mediu de creştere şi multiplicare. Metoda vine să simplifice tehnologia conservării materialului genetic in vitro şi aduce o serie de avantaje: - se reduc substanţial cheltuielile pentru păstrarea materialului vegetal in vitro; - se face economie de spaţiu şi de mediu de cultură; - se realizează economie de forţă de muncă, energie etc.
195
Capitolul 9 Embriocultura in vitro la plantele horticole Cultura embrionilor zigotici a apărut ca necesitate pentru rezolvarea unor probleme apărute în procesul ameliorării plantelor horticole. În pomicultură, apare posibilă cultivarea pe medii aseptice a unor embrioni imaturi care provin prin încrucişări de la soiuri extratimpurii şi timpurii de sâmburoase. În mod natural, aceşti embrioni nu ajung la maturitate datorită unor dereglări fiziologice care apar în procesul de creştere al seminţei şi fructului (foto 9.1.). În mod similar, în cazul unor hibridări interspecifice are loc avortarea embrionilor înaintea ajungerii lor la maturitate (Ion L. şi colab., 1997). La viţa de vie nu este posibilă obţinerea unor descendenţi hibrizi atunci când se foloseşte ca genitor matern un soi apiren, în acest caz, embrionul avortând timpuriu. Situaţii oarecum similare se întâlnesc şi la realizarea unor combinaţii hibride sau încrucişări între soiuri, specii sau genuri incompatibile la majoritatea speciilor horticole. Prin extragerea embrionului abia format cu o porţiune de ţesut nucelar, sau prin cultivarea ovulului fecundat, se reuşeşte depăşirea barierelor incompatibilităţii. Un alt caz particular este reprezentat de cultivarea embrionilor maturi. Metoda se foloseşte pentru scurtarea procesului de ameliorare prin eliminarea perioadelor de repaus relativ al seminţelor. Un avantaj important al embrioculturii este acela al înmulţirii clonale pornind de la seminţele hibride ale unor plante anuale, legume şi flori. Plecând de la ideea că indivizii regeneraţi ulterior vor păstra efectul heterozis al hibrizilor valoroşi, se poate realiza apoi înmulţirea clonală in vitro. La Cichorium intybus L. s-a reuşit iniţierea unei culturi in vitro cu un procent de 100% explante sănătoase prin germinarea seminţelor hibride (Diaconescu O., 2002) (foto 9.2.). De asemenea, în cazul unor combinaţii hibride valoroase, se face înmulţirea materialului genetic înainte de realizarea selecţiei, sau materialul hibrid este supus unor procese de stres selecţie in vitro înainte de a fi aclimatizat şi trecut în câmp.
196
a
b
c
d
e
Foto 9.1. Fazele embrioculturii la hibrizii extratimpurii de nectarin: a – extragerea embrionilor din sâmburi, b – cultivarea embrionilor imaturi in vitro, c – puieţii hibrizi obţinuţi prin germinare in vitro, d – plantarea hibrizilor pentru fortificare, e – hibrizi de nectarin fortificaţi
197
Foto 9.2. Plantă hibridă de cicoare (Cichorium intybus L.) obţinută prin germinare in vitro Momentul începerii culturii variază de la specie la specie, în funcţie de scopul urmărit. Astfel, la cireş, inocularea se face la 28-35 de zile de la înflorire, la vişin, la 29-41 zile şi piersic, la 81-97 zile. Un alt indiciu folosit este reprezentat de mărimea cotiledoanelor. La piersic momentul optim fiind atunci când acestea ating 4-5 mm în diametru. La cireş, se mai recomandă iniţierea culturii în momentul întăririi sâmburelui, după aceea viabilitatea embrionilor scade până la momentul intrării în pârgă. Stabilizarea culturilor de embrioni este relativ uşoară datorită faptului că sâmburii sau seminţele protejate de endocarp sau tegumente, pot fi sterilizate la concentraţii ridicate. Compoziţia mediului de cultură este cu atât mai complexă cu cât embrionii se află într-un stadiu de dezvoltare mai incipient. După inoculare, embrionii se lasă la întuneric timp de 30-60 de zile la temperatura camerei pentru germinare după care sunt trecuţi la lumină. În tabelele 9.1., 9.2. şi 9.3. sunt prezentate câteva din cercetările privind folosirea embrionilor zigotici imaturi la plantele horticole.
198
Tabelul 9.1. Denumirea speciei 1 Allium cepa Apium graveolens
Asparagus officinalis
Brassica alba Brassica oleracea botrytis Capsicum annuum
Cercetări privind cultura de embrioni imaturi la plantele legumicole Zaharoză Agar Regulatori de creştere Rezultat Mediul de cultură pH (g/l) (g/l) (mg/l) 2 3 4 5 6 7 Cultură embrioni Guha&Johri (1966) 5,8 50 7 (0,5)AIA-pentru formare bulbili Plantule Murashige&Skoog (1962) 5,6 30 10 Plantule Murashige&Skoog (1962) 30 agar Dezvoltare embrioni Plantule Plante diploide Creşterea embrionilor Creşterea plantelor Lăstari Plantule Plantule
Murashige&Skoog (1962)
5,8
30
lichid
(0,6)Kin
Murashige&Skoog (1962) Nitsch et al. (1969a)
5,8 -
30 30
agar 6
AIA + Z (nespecificat)
Linsmaier & Skoog (1965) Knudson (1946) C
5,8
30
8
(1) 2,4-D + (0,315) Kin
-
30
8
5,8 5,5 5,8
30 20 30
agar 8 agar
(0,5)BAP
5,9
30
8
(2) Kin
Murashige&Skoog (1962) Gamborg et al. (1968) B5 Murashige & Skoog (1962) Plantule haploide Dumas De Vaulx et al şi diploide (1981) R
199
Autori 8 Guha&Johri (1966) Chen (1976) Williams&Collin (1976)& Zee&Wu(1979) Zee&Wu (1980) Bui Dang HA et al (1975) Wilmar & Hellendoorn (1968) Wilmar & Hellendoorn (1968) Leelavahti et al (1984) Bagga et al (1982) Pareek & Chandra (1978 a) Dumas De Vaulx et al (1981)
1 Cucumis melo
2 Germinarea embrionilor şi plantule Lăstari şi rădăcini adventive Germinare Lăstari
3 Murashige&Skoog (1962) Murashige&Skoog (1962) Randolph&Cox(1943) Lazarte&Sasser (1982)L
Cucurbita pepo
Plantule cu rădăcini
Daucus carota
Dezvoltarea embrionilor
Cucumis sativus
Ipomoes batatus
Pisum sativum
4 5,8
Tabelul 9.1. continuare 8 Norton (1981)
5 30
6 8
7
40
agar
(5)ANA+(2,5)Kin+ 15%CM
20 0
lichid agar
-
Murashige&Skoog (1962) Hildebrandt et al (1946)Tob White (1942)
30 glucoză 20
9
(0,3)2,4-D
20
5
20
5
(6)2,4-D+(0,1)ANA+15%CM
20
5
(6)2,4-D+(0,1)ANA+15%CM (0,2)Ad+15%CM
5,65,8 5,7
10 glucoză 30
5
Germinarea embrionilor Lăstari
Zenkteler et al. (1961)D1. Zenkteler et al. (1961)D2. Zenkteler et al. (1961)D3. Murashige & Skoog (1962) Linsmaier&Skoog (1965)
7
16
agar
Dezvoltare embrioni
Bonner & Axtman (1937)
-
40
Agar
Creşterea lăstarilor 2 rădăcini Dezvoltare embrioni
Bonner & Bonner (1938) Murashige&Skoog (1962) Stafford & Davies (1979)
5,8 5,8
40 15 10
10 10 Lichid
200
5
(0,19-0,38)ANA
Vitamina C
Rao et al. (1982) Aalders (1958) Lazarte&Sasser (1982) Jelaska (1972) Zenkteler et al (1961) Zenkteler et al (1961) Zenkteler et al (1961) Zenkteler et al (1961) Zenkteler et al (1961) Jarret et al. (1984) Schultheis et al. (1986) Bonner & Axtman (1937) Bonner & Bonner (1938) Jacobsen&Kysely(1984) Stafford & Davies (1979)
1 Solanum melongena
2 Lăstari Dezvoltare plantule Calus Calus şi embriogeneză Plantule
3 Murashige & Skoog (1962) Murashige&Skoog (1962) White (1954) White (1954)
4 5,8
White (1954)
5 30
6 Agar
30
Agar
20 20
Agar Agar
20
Agar
Tabelul 9.1. continuare 7 8 (0,005) ANA + (1-2) Kin Anon (1981 b) Gleddie et al (1982) (1) ANA Auxina
Yamada et al (1967) Yamada et al (1967) Yamada et al (1967) Tabelul 9.2.
Denumirea speciei
Rezultat
1 Amygdalus communis Armeniaca vulgaris
2 Lăstari
Castanea sativa
Dezvoltare şi germinare Lăstari axilari Lăstari axilari
Cerasus vulgaris Citrus sp,
Cercetări privind cultura de embrioni imaturi la plantele pomicole Zaharoză Agar Regulatori de Mediul de cultură pH (g/l) (g/l) creştere (mg/l) 3 4 5 6 7 Hisajima (1982 a) 5,5 30 6 (0,56) BAP Tukey (1933)I
5,5
5 glucoză
6,5
30
6
(2-5) BAP (1-2) BAP
5,5
30
6
Tukey (1933)I
5,5
5 glucoză
6,5
10
7
(0,2) AdS+33%CM
20 30
7 8
(1) GA3
Van Overbeek et al (1941)
Plantule Plantule
Dubey&Rishi (1976) Murashige&Tucker (1969)
5,7 5,7
201
8 Hisajima (1982 b) Tukey (1938)
San Jose et al, (1984 L sau H) Vieitez & Vieitez(1980a) 1
Dezvoltare germinare Germinare
Autori
San Jose et al, (1984) Vieitez & Vieitez(1980a) Tukey (1938) Ozsan&Cameron (1963) Dubey&Rishi (1976) Gmitter&Moore (1986)
1 Cocos nucifera
2 Creştere embrioni Calus Creştere embrioni
3 Cutter&Wilson (1954) Eeuwens (1976) Y3 Murashige&Skoog(1962)
4 5 6
Corylus avellana
Proliferare embrioizi Calus şi embriogeneză Ţesut embriogen Regenerare plantule
0,5xCheng (1975)Basal Radojevic et al,(1975)
5,5
Wang D, et al, (1984) Wang D, et al, (1984)
Juglans regia
Lăstari
Malus x domestica Mangifera indica Persica vulgaris
Proliferare embrioizi Proliferare embrioni Germinare limitată Germinare
Cassio&Minotta (1983)1,2&3 Murashige & Skoog (1962) Litz et al (1984) Litz (1984a Brooks & Hough (1958)
Dezvoltare embrioni
Fragaria
Phoenix dactylifera Theobroma cacao
5 20 45 40 glucoză 30 20
8 8-10
5,8 5,8
50 50
8 8
5,7
30
10
5,6-5,8
30
8
5,7 5,7
30 60 20
Monet (1968)
5,8
Calus, embriogeneză
Linsmaier&Skoog (1965)
Maturare
Murashige & Skoog (1962) Murashige & Skoog (1962) Murashige & Skoog (1962) Ben-Jaacov & Dax (1981)
Embriogeneză Dezvoltare embrioni şi germinare Germinare precoce
6 agar 8 8
Tabelul 9.2. continuare 8 Cutter&Wilson(1954) (50)2,4-D+(2)Kin Kumar et al (1985) (10)AIA Nurita-Toruan (1978) 7
+/-(0,11)BAP (1)2,4D+(1)Kin+(2)Ad (5)2,4-D + (0,5)BAP (1)GA3 sau [(0,5)BAP+ (0,1)ANA (0,2)ANA
Pérez et al (1986) Radojevic et al,(1975)
8 0 6,8
(1-2)BAP
20
8
5,7
30
8
2-3 ml CM pe suprafata agarului (10-100)2,4-D+(3)2iP +(40)AdS
Litz et al, (1984b) Litz (1984b) Brooks & Hough (1958) Monet (1968)
5,8
30
8
30
10
(1,5)ANA+10%CM
30
0
(1,5)ANA+10%CM
30
0
Pasare la 10 zile
5,7 202
Wang D, et al, (1984) Wang D, et al, (1984) Cassio&Minotta (1983) Eichholtz et al (1979)
Tisserat et al (1979) Kononowikz & Janik (1984b) Pence et al (1979;1980) Pence et al (1979;1980) Wang & Janich (1984)
Tabelul 9.3. Denumirea speciei 1 Fraxinus americana Gingko biloba Hedera helix Ilex aquifolium Magnolia grandiflora Magnolia soulangeana Picea abies
Pinus strobus
Pseudiotsuga menziesii Ouercus robur
Cercetări privind cultura de embrioni imaturi la arborii şi arbuştii ornamentali Zaharoză Agar Regulatori de creştere Rezultat Mediul de cultură pH (g/l) (g/l) (mg/l) 2 3 4 5 6 7 Dezvoltare Bulard & Monin (1960) 5 30 glucoză 8 +/- (1)GA3 embrioni Calus Linsmaier&Skoog(1965) 20 8 Lăstar Tukey (1933) I 20 10 Lăstar Ball (1959)A sau B 40 glucoză 10 30% CM Calus Banks et al, (1979) 5,7 30 6 (2)ANA + (0,5)BAP Germinare şi Linsmaier & Skoog 5,6 40 10 creştere (1965) Germinare Heller (1953;1955) 20 8 Germinare
Heller (1953;1955)
Calus şi embriogeneză Lăstari adventivi
Von Arnold & Eriksson (1981) LPm 0,5 x Schenk & Hildebrandt (1972) Von Arnold (1982) Murashige & Skoog (1962)
Lăstari adventivi Calus
Lăstari Murashige&Skoog(1962) Calus şi muguri Linsmaier & Skoog (1965) Lăstari Vieitez & Vieitez (1983) QL
20
8
34,2
5
(2,2) 2,4-D + (1,1) BAP
15
5
(1) Kin + (1,1) BAP
5,8
17,1 30
8
5,8 5,6
30 30
8 7
(2,1) Kin [(0,01-2) ANA, 2,4-D sau IBA] + (0,1-5) Z, BAP sau 2iP (1-5) IBA + (0,1-1)Z (1-2) ANA + (1) BAP
30
6
(1) BAP
5,8
203
Autori 8 Bulard & Monin (1963) Arias et al (1982) Ball (1956a,b) Ball (1959) Banks et al, (1979) Hu & Sussex (1972) Le Page-Degivry (1970) Le Page-Degivry (1970) Hakman et al (1985) Von Arnold & Eriksson (1984) Von Arnold (1982) Minocha (1980) Minocha (1980) Chalupa (1977) Vieitez et al (1985)
Capitolul 10 Producerea haploizilor 10.1. Generalităţi În urma diviziunilor celulare care se încheie cu formarea gameţilor se obţin celule haploide cu număr simplu de cromozomi (n). Plecând de la aceste celule se pot regenera prin diferite metode plante haploide sau prin diploidizare, plante homozigote care prezintă o importanţă practică deosebită pentru activitatea de ameliorare. In vivo, plantele haploide se pot obţine relativ uşor cunoscându-se peste 100 de specii la care s-au obţinut haploizi pe cale spontană. Cea mai comună metodă în acest sens este obţinerea de plante din seminţe cu doi embrioni (duble). Acestea pot avea 2 embrioni n-n sau 2 embrioni 2n-n. Avantajele folosirii haploizilor: - prin dublarea cromozomilor se obţin rapid plante homozigote - procesul are mare importanţă la speciile la care acestea nu pot fi obţinute in vivo (ex. plante dioice şi autoincompatibile). Se reduce durata procesului de obţinere a liniilor homozigote care presupune autopolenizări timp de 5-7 generaţii; - obţinerea plantelor homozigote la speciile cu perioada juvenilă lungă este dificilă şi îndelungată; - producerea de hibrizi F1 este uşurată; - la speciile poliploide prin obţinerea de haploizi se poate lucra mai uşor cu niveluri de ploidie inferioare; - mutantele recesive sunt rapid puse în evidenţă la plantele haploide; - folosirea plantelor haploide permite obţinerea de plante mascule normale prin dublarea garniturii cromozomale. Acestea sunt deosebit de utile pentru Asparagus officinalis la care producţia este mai ridicată şi mai timpurie decât la cele femele; XX
x
Y Y (super mascul)
↓ XY
204
- in vitro haploizii îşi dublează spontan garnitura cromozomală sau necesită cantităţi mici de colchicină. Aceasta determină apariţia de probleme secundare atunci când este folosită în mod normal in vivo; - fuziunea protoplaştilor haploizi este mai indicată pentru că se realizează mai uşor şi hibridul somatic va fi diploid, decât în cazul protoplaştilor diplozi care formează hibrizi somatici tetraploizi. Producerea haplozilor in vitro presupune două procese: - cultivarea unor gameţi femeli (ovule) sau sinergide-ginogeneza; - cultivarea unor gameţi masculi (grăuncior de polen) – androgeneza. 10.2. Androgeneza in vitro Cel mai mult s-au studiat produsele de androgeneză in vitro cu rezultate pozitive la speciile din fam. Solanaceae, Cruciferae, Gramineae şi Ranunculaceae. Peste 247 de specii şi hibrizi de 88 de genuri şi 34 de familii au produs haploizi in vitro (Maheshwari şi coalb. 1983). Rezultate mai puţin promiţătoare s-au obţinut la arbori şi arbuşti. Primele cercetări în urma cărora s-au obţinut haploizi din antere de Datura innoxia au fost realizate de Guba şi Maheshwari (1964 şi 1966). În 1967 Borgin şi Nitsch au obţinut acelaşi lucru din antere de Nicotiana. Materialul iniţial pentru obţinerea haploizilor: - anterele sunt cele mai folosite fiind cultivate pe mediu lichid sau solid. Izolarea se face folosind antere provenite din mugurii închişi sau flori deschise. - grăunciori de polen se folosesc mai puţin; - inflorescenţe care cresc uşor pe mediu lichid (la specii de ierburi care au flori de dimensiuni reduse). - embriocultură - cultivarea unor embrioni rezultaţi din încrucişări interspecifice sau intergenerice la care unul din genitori este eliminat. Ex. Hordeum vulgare x H. bulbosum, acesta din urmă este eliminat, idem T. aestivum x H. bulbosum. - pseudofecundare - Hess şi Wagner (1974) au polenizat Mimulus luteus cu polen de Torenia fournieri in vitro. Gameţii femeli de Mimulus au generat plante haploide. - ovule nefecundate - avantaj majoritatea plantelor regenerate sunt verzi, la cereale la orz celulele sacului embrionar haploide, la grâu, orez şi porumb ovule. La
205
gerbera prin cultură de capitul, s-au obţinut plante haploide clorofilo-deficitare, galbene (Preil şi colab, 1977); ovule + placentă la Petunia axillaris (Keller 1986). Producerea haploizilor din antere se poate realiza pe două căi: - direct - embrionul haploid se formează direct din grăunciorul de polen; - indirect - pentru început din grăunciorul de polen se obţine calus dar apoi se formează un embrion sau un lăstar adventiv. Prezintă dezavantaje datorită existenţei în masa calusului a unor celule diploide şi haploide. Momentul izolării anterelor este esenţial: mulţi autori (Debergh 1978; Reinert şi Bajaj, 1977a etc.) optează pentru momentul de dinaintea primei diviziuni a grăunciorilor de polen. Dunwell (1985) precizează că momentul optim este între diviziunea microsporilor din tetradă şi prima mitoză. La tutun se folosesc mugurii florali la care petalele sunt abia vizibile. Prin cultura de antere se formează frecvent un număr mare de haploizi, himere şi plante cu diferite niveluri de ploidie. Factori care influenţează producerea haploizilor din antere: - pretratamente la plantele mamă: temperatura scăzută, centrifugarea anterelor, incizia vârfului inflorescenţelor, tăierea peretelui anterei; - tipul de material iniţial: - plante sănătoase, viguroase; - vârsta plantei, vârsta florii; - poziţia explantului - la cereale se izolează flori din vârful spicului; - compoziţia mediului, MS ori Nitsch, se modifică în fiecare de fază; - pH-ul mediului recomandat este 5,8, conţinutul în zaharoză de 2-4%; - prezenţa agarului nu este obligatorie. Se poate folosi un mediu lichid în care anterele plutesc, sau un mediu cu dublu strat; - cărbunele activ absoarbe metaboliţii din mediul de cultură şi are efect pozitiv. Androgeneza in vitro se confruntă cu o serie de probleme: - uneori creştere dificilă - avortarea embrionilor; - se formează simultan diploizi sau tetraploizi; diviziunea celulară trebuie să se realizeze în haploid şi nu în celule diploide adiacente; - se formează frecvent plante albinotice care nu trăiesc; - costuri ridicate, uneori se recurge la obţinerea de haploizi in vivo, care este mai ieftină (Solanum tuberosum x S. phureja);
206
- formarea calusului este nedorită; - este greu să se izoleze haploizi dintr-un amestec în care există şi celule cu diferite grade de ploidie, deoarece acestea cresc mai puternic. - selecţia plantelor diploide este dificilă şi de lungă durată prin metoda citogenetică şi presupune folosirea metodelor cu marcatori genetici. - nu întotdeauna dublarea garniturii cromozonale are ca efect producţia de plante homozigote, întrucât în descendenţă poate apărea segregarea. 10.3. Fecundarea in vitro În anumite situaţii, realizarea hibridării sexuate este imposibilă datorită mai multor factori cu influenţă negativă : - polenul nu germinează pe stigmat; - creşterea tubului polinic este parţială; - fecundarea nu se produce; - zigotul nu se dezvoltă; - ovarul îmbătrâneşte prematur, etc. După 1962 s-a pus problema rezolvării cazurilor de incompatibilitate prin realizarea polenizării şi fecundării in vitro. Tipuri de polenizare şi fecundare: a) polenizarea stigmatului - se realizează castrarea (emascularea) florii provenite de la genitorul matern, sterilizarea acesteia şi inocularea pe un mediu in vitro. Polenul provenit de la antere mature este sterilizat şi el şi amplasat pe stigmat. Metoda a fost folosită cu succes la Nicotiana rustica, N. tabacum, Petunia violacea, Antirhinum majus, Pisum sativum, Lathyrus odoratus, Zea mays (Pierik,. 1979; Zenkteler, 1980) şi Glycine sp. (Silvoy şi alţii, 1984). b) polenizarea placentei - după sterilizarea florii femele se extrage sub lupă binocular placenta cu ovulele proprii şi se inoculează pe un mediu nutritiv. În acelaşi timp, anterele ajunse aproape de maturitate, se sterilizează şi se deschid sub hotă, depunând apoi grăunciorii de polen pe ovule. Grăunciorii de polen germinează, străpung sacul embrionar şi se realizează fecundarea. Rezultate bune s-au obţinut la specii din familia Caryophyllaceae, Gossypium precum şi la Zea mays.
207
c) polenizarea ovulelor izolate - după izolarea ovulelor fără placentă se face polenizarea ca în metodele precedente, şi are loc fecundarea. Metoda este mai puţin folosită deoarece embrionul se dezvoltă greu în acest caz. Totuşi polenizarea in vitro se poate folosi: - în cazuri de incompatibilitate in vivo ex. Petunia axilaris (Rangaswarny şi Shivanna, 1967) şi hibrizii de Petunia (Numi, 1970). - în cazuri de incompatibilitate la realizarea polenizării încrucişate interspecifice sau intergenerice. Ex. : - Nicotiana alata x Nicotiana tabacum; - la genuri din Familia Caryophyllaceae – se foloseşte metoda polenizării placentei; - producerea de haploizi prin partenogeneză. Hess şi Wagner (1974) au obţinut un haploid de Mimulus luteus prin polenizarea cu polen de Torenia fournieri. - când are loc căderea prematură a florii sau ovulului se poate recurge la polenizarea stigmatului in vitro - realizarea studiilor de fiziologia fecundării şi a studiilor fenomenului de incompatibilitate. Pentru reuşita fecundării in vitro trebuie îndeplinite mai multe condiţii: - gameţii să fie în faza optimă de dezvoltare pentru realizarea fecundării; - mediul de cultură să asigure condiţii optime pentru fecundare, creşterea embrionului şi obţinerea de noi plante. Se folosesc de regulă soluţii foarte complexe; - operaţiile de stabilizare a materialului vegetal trebuie să fie executate rapid pentru a nu determina spălarea lichidului de pe stigmat sau crăparea anterelor; - când se recurge la metoda polenizării stigmatelor nu se înlătură sepalele, deoarece acestea stimulează creşterea şi dezvoltarea ovarului. - temperatura influenţează direct procesul de fecundare. Speciile din genul Narcissus necesită temperaturi mai scăzute, inferioare temperaturii de 25°C (Balatkova şi colab. 1977), în timp ce Papaver somniferum are nevoie de temperaturi ridicate. Tabelele 10.1., 10.2., 10.3. şi 10.4. prezintă rezultatele unor lucrări de cercetare privind androgeneza şi ginogeneza in vitro la plantele horticole.
208
Tabelul 10.1. Denumirea speciei 1 Allium cepa
Asparagus officinalis
Explant iniţial 2 Primordii florale Flori fertilizate Ovule fertilizate Antere Antere
Brassica alba
Antere
Brassica oleracea botrytis
Antere uninucleate Antere uninucleate Fragmente petale Fragmente pedunculi florali Fragm. pedunc. florali Antere
Brassica oleracea gemmifera
Cercetări privind androgeneza şi ginogeneza la plantele legumicole Regulatori de Zaharoză Agar creştere Rezultat Mediu pH (g/l) (g/l) (mg/l) 3 4 5 6 7 8 Lăstari multipli Dunstan&Short 5.5 30 8 (1) BAP (1977a)BDS Cultura de Nitsch (1951)1 5.8 50 7 (0.5)AIA+(0.5-1) Kin ovare/fruct +(4)GA3 Răsad Johri&Guha (1963) 50 7 (1)AIA+(0.5) Kin+(4)GA3 Calus Pelletier et al. (1972) 20 5 (0,1) ANA +(0,5) 2,4Tosauri D +(0,5) BAP Calus Pelletier et al. (1972) 20 5 (0,1) ANA +(1) 2,4-D Tosauri +(0,2) BAP Calus Leelavahti et al 5.6 20 agar (2) 2,4-D (1984) Calus Bagga et al (1982) 1 5.5 20 8 (0.22)2,4-D + (0.22) Kin 42% calus Gamborg et al. 5.5 20 8 (0.5)BAP 8% embrioizi (1968) B5 Lăstari Linsmaier & Skoog 30 lichid (8) AIA + (2,56) Kin (1965) Lăstari Margara (1969a,b) C 45 8 (2.3) BAP Lăstari Embriogeneză
Margara (1977; 1978) N 30 NH4 Keller et al (1975)
209
Autori 9 Dunstan&Short (1979a) Guha&Johri (1966) Johri&Guha (1963) Doré (1974) Pelletier et al (1972 b) Leelavahti et al (1984) Bagga et al (1982) Bagga et al (1982) Crisp & Walkey (1974) Margara (1969 a,b)
-
30
8
(1) IBA + (0,93) ANA
Margara (1978)
-
100
8
(0.1) 2,4-D + (0,1) ANA
Ockendon (1984, 1985)
1 Capsicum annuum
Cichorium intybus
2 Antere
3 Embriogeneză
Antere
Plante haploide
Antere (48h, 4°C) Antere
Embrioizi Embrioizi şi plantule
Antere
Calus
Seminţe, muguri florali, flori, Calus, muguri, fragm. foliare lăstari, rădăcini (0,1-1cm2) antere calus Cucumis sativus Lactuca sativa Lycopersicon esculentum
Phaseolus vulgaris
polen Polen/antere
40% germinare torpedo
Antere
Calus haploid
Antere
Calus
Ovare 8-10 zile Antere
Seminţe viabile Calus
Antere
Calus haploid şi diploid
4 Dumas De Vaulx et al (1981) R George & Narayanaswamy (1973) Sibi et al (1979) Cm Sibi et al (1979) Cm
5 5.9
6 30
7 8
5.8
20
8
5.9 5.9
30 30
8 8
Tabelul 10.1. continuare 8 9 (0.1) Kin Dumas De Vaulx et al (1981) (0.5)AIA George & Narayanaswamy (1973) (2) 2,4 – D + (2) Kin Sibi et al (1979) (0.1) Kin Sibi et al (1979)
Murashige & Skoog (1962)
BA, AIA, ANA, 2,4-D
Smets (1983)
Murashige & Skoog (1962)
BA, AIA
Dabin (1985) Lazarte&Sasser (1982) Eenik (1983) Debergh&Nitsch (1973) Gresshoff&Doy (1972b) Gulshan&Sharma (1981) Uralets (1980) Zamir et all (1980; 1981) Peters et al (1977)
Lazarte&Sasser (1982)L Eenik (1983) Bourgin & Nitsch (1967)H Gresshoff&Doy (1972a,b)DBM1 Gresshoff&Doy (1972a,b)DBM2 Uralets (1980) 1 Murashige & Skoog (1962) Veliky & Martin (1970) 67-V
210
0
agar
-
40 20
lichid lichid
(0.1)ANA+(0.1)BAP
5.86.4 5.8
20
8
(2)ANA+(1.5 )Kin
20
8
(2)ANA+(1)Kin
5.8 5.8
20 20
agar 8
(0.5) AIA + (0.25) Z
20
8
(1) 2,4-D
5.5
1 Raphanus sativus Solanum melongena
2 Muguri florali Sepale, petale, antere Antere Antere
Solanum tuberosum
3 Calus şi embriogeneză Calus şi embriogeneză Calus şi embriogeneză
Antere
Calus şi embriogeneză Embrioizi
Antere
Calus
Antere
Calus
Antere
Embrioizi
Antere
Embriogeneză directă Embrioizi globulari
Polen
4 Konar et al (1972 a)
5 -
6 0
Ranga Swamy (1962) I Murashige & Skoog (1962)
5.8
20
5.8
30
Pelletier et al (1972) Tosauri Bourgin & Nitsch (1967) H Murashige & Skoog (1962) Murashige & Skoog (1962) Bourgin & Nitsch (1967) H Murashige & Skoog (1962) Murashige & Skoog (1962)
5.8
20
5.5
20
5.8
30
5.8
30
5.8
20
5.8
60
5.8
30
211
Tabelul 10.1. continuare 8 9 (1) AIA + 10% CM Konar et al (1972 a) 7 (1) 2,4 –D + 10 % Nataraja & Konar CM (1970) agar (0.25 - 2) 2,4-D + Anon (1981 b) (0.25-1)Kin + (0.2) Rac 7.5 (0.1) ANA + (0.2) Isouard et al BAP (1979) 8 (0.22) Kin Kohlenbach & Geier (1972) agar (1.9) ANA + (0.39) Sopory & Tan Kin (1979) agar (1.86) ANA + (0.23) Sopory & Tan BAP (1979) 8 (0.23) BAP + (1.86) Sopory (1977a ) ANA agar (1.1)AIA + (0.9) BAP Sopory et al (1978)& lichid (1.4) 2,4-D + (0.4) Sopory (1977) Kin 7 7
Tabelul 10.2. Cercetări privind androgeneza şi ginogeneza la plantele pomicole Denumirea speciei
Explant
Rezultat
Mediu
pH
1 Armeniaca vulgaris Cerasus avium
2 Antere
3 Calus
5
Antere
Calus
4 Murashige & Skoog (19620 Seirlis et al, (1979)A
Citrus sp,
Antere
Calus
Murashige & Tucker (1969)
Ovule nedezvoltate
Formarea şi creşterea embrionilor
Murashige & Tucker (1969) Kochba et al, (1972)
Cocos nucifera
Inflorescenţe Antere
Rizogeneză Torpedo
Juglans regia
Polen
Musa acuminata
Muguri florali
80% germinaţie Lăstari
Muguri florali
Lăstari
212
Regulatori de creştere (mg/l) 8 (2)ANA+(2)Kin
6 30
7 agar
30
9
50
agar
5,7
30
8
5,7
30
8
68,5 60
3,9 7
20
6,5
5,8
41
0
(4,95)BAP+10%CM
5,8
40
0
(5)Bap + 10% CM
Eeuwens&Blake(1977) 5,5-5,8 Thanh-Tuyen&De 5,8 Gz,(1983)1 Luza & Polito (1985) Krikorian & Cronauer (1984) Heinz & Mee (1969)
Zaharoză Agar (g/l) (g/l)
(0,5)2,4-D+(0,51)BAP (3)2,4-D+(1)Kin (0,01)2,4D+(0,1)daminozide
(0,022)2,4-D+(1,13)BAP (2)ANA+/-(0,25)2,4D+15%CM
Autori 9 Harn & Kim (1972) Seirlis et al, (1979) Murashige&Tucke r (1969) Gmitter & Moore (1986) Gmitter & Moore (1986) Eeuwens (1978) Thanh-Tuyen&De Gz,(1983)1 Luza & Polito (1985) Cronauer & Krikorian (1985a) Cronauer & Krikorian (1985b)
Tabelul 10.3. Denumirea speciei 1 Clematis gouriana
Cercetări privind cultura embriogeneza somatică la arborii şi arbuştii ornamentali Zaharoză Agar Regulatori de creştere Explant Rezultat Mediu pH (g/l) (g/l) (mg/l) 2 3 4 5 6 7 8 Antere Calus Ranga Swamy (1961)I 5,8 20 7 (1)AIA + 10%CM Antere Embriogeneză Nitsch & Nitsch (1969) 5,8 20 lichid
Ginkgo biloba
Polen
Calus
Lamport (1964)
Larix decidua
Polen Gametofit Gametofit
Calus Calus haploid Calus
Tulecke (1960) A White (1943a) A Nagmani & Bonga (1985) Radojevic et al, (1975)
Paulownia tomentosa Picea abies
Pinus mugo Pinus mugo mughus Pinus nigra austriaca Pseudotsuga menziesii Rosa hybrida
Ovule
Plantule via calus Megagametofit Calus haploid & lăstari adventivi Megagametofit Calus
6 5,8
Huhtinen (1976)
Simola & Honkanen 5,6 (1983) Polen Germinare polen Nygaard (1970) B, Nf 5,2 sau C Megagametofit Calus haploid Brown & Lawrence 5,6(1968) 5,8 Megagametofit Calus haploid Brown & Lawrence 5,6(1968) 5,8 Embrioni Dezvoltare Mapes & Zaerr (1981) 5,8 zigotici embrioni Polen Germinare polen Muren et al (1979) 5,2 Antere Calus haploid Murashige & Skoog 5,8 (1962) 213
20
7,5
20 20 20
10 agar 8
20
7
30 20 3,4
(0,6-6)2,4-D +1040%CM (0,1)ANA + 20% CM (6)2,4-D + 18%CM (2)BAP
Autori 9 Nataraja (1971) Johansson et al (1982) Lamport (1964) Tulecke (1960) Tulecke (1964) Nagmani & Bonga (1985) Radojevic (1979)
(1)2,4-D + (1)Kin + (2)Ad (1-10) 2,4-D + (0,1-1) Huhtinen (1976) Kin 6 (2) 2-4-D +(0,5) Kin Simola & Honkanen (1983) lichid Nygaard (1970)
20
8
(5) 2,4-D
Bonga (1974)
20
8
(5) 2,4-D
Bonga (1974)
30
agar
30
lichid agar
(7,5) AIA +(0,8) Kin
Mapes & Zaerr (1981) Muren et al (1979) Tabaeezadeh & Khosh –K, (1981)
Tabelul 10.4. Cercetări privind androgeneza şi ginogeneza la viţa de vie Zaharoză Agar (g/l) (g/l)
Denumirea speciei
Explant iniţial
Rezultat
Mediu
pH
1 Vitis thunbergii
2 Antere
3 Lăstari
4 Nitsch (1971)1
5 5.5
6 20
7 8
Vitis vinifera
Antere
Calus
5.8
20
8
Vitis vinifera
Lăstari
Dezvoltare
Ovule
Calus
5.6
20 glucoză 20
agar
Vitis vinifera Vitis vinifera
Ovule
Calus
5.6
20
0
Vitis vinifera x Vitis rupestris
Antere
Calus
Gresshoff & Doy (1974)1 Favre & Grenan (1979)S Mullins & Srinivasan (1976) HDVM Mullins&Srinivasan(1 976)N Bourgin & Nitsch (18670 H
20
0
214
0
Regulatori de creştere (mg/l) 8 (1.86) ANA+(0.225) BAP (2) ANA+(2) AIA+(1.5) Kin (2.8)CPA + 10-15% CM (1.1) BAP (1.11) 2,4-D + (0.225) BAP
Autori 9 Hirabayashi et al (19760 Favre & Grenan (1979) Mullins & Srinivasan (1976) Mullins & Srinivasan (1976) Rajakeran & Mullins (1979)
Capitolul 11 Cultura de calus in vitro 11.1. Cultura de calus Calusul reprezintă o aglomerare de celule mai mult sau mai puţin diferenţiate care au o capacitate diferită de multiplicare. Formarea calusului are loc pe diferite tipuri de explante cultivate in vitro pe zonele rănite, sub influenţa unor substanţe specifice. Cultura calusului presupune trei etape: - inducerea formării calusului; - înmulţirea calusului; - regenerarea de organe adventive de calus. Inducerea calusului Pentru iniţierea unei culturi de calus pot fi folosite diferite tipuri de organe: rădăcini, tulpini, frunze, flori şi ţesuturi. Când este nevoie de material juvenil, de regulă se apelează la cotiledoane, embrioni imaturi, puieţi etc. Stimularea formării calusului pe explantele iniţiale se face prin folosirea unor hormoni specifici. Pentru monocotiledonate sunt recomandate auxinele. Unele specii necesită citochinine în timp ce altele au nevoie atât de citochinine cât şi de auxine. La început, la explantele de morcov se folosea 2,4 D şi lapte de cocos pentru obţinerea calusului. Ulterior s-a demonstrat că laptele de cocos are un conţinut ridicat de citochinine care stimulează procesul de calogeneză. Alţi factori care intervin în formarea calusului sunt: genotipul, compoziţia mediului de cultură, pH-ul, factorii fizici de creştere. Pe lângă mediul de cultură MS, în reţeta de bază se mai foloseşte zaharoza în concentraţie de 2-4% şi alte substanţe auxiliare cum ar fi: caseina hidrolizată, extractul de malţ, de drojdie, laptele de cocos. pH-ul ridicat (7) a stimulat formarea şi creşterea producţiei de calus la actinidia (Stănică şi colab., 1995).
215
a) b) Foto 11.1. Formare calusului la kiwi (Actinidia deliciosa) din peţiol (a) şi lim foliar (b) Temperatura ridicată (22-28°C) stimulează procesul de calogeneză în timp ce lumina are efect diferit. Sub influenţa factorilor amintiţi, celulele ţesuturilor diferenţiate suferă un proces de dediferenţiere. În timpul acestuia celulele parenchimatice se convertesc în celule juvenile cu capacitate mare de diviziune. Ţesuturile meristematice nu au nevoie de procese de dediferenţiere, ele fiind capabile de diviziune rapidă şi formare de calus. În masa de calus pot să coexiste celule cu grade diferite de diferenţiere. Cultura de calus După obţinerea calusului, acesta este cultivat pe un alt mediu, de regulă solid în prima fază de cultură şi lichid după aceea. Compoziţia mediilor este similară cu cea din faza de inducţie cu excepţia concentraţiei auxinelor şi citochininelor care este mai redusă. Dacă creşterea calusului este mai redusă atunci se recomandă şi păstrarea unei porţiuni din explantul iniţial în timpul primei subculturi. Calusul format are culori, grade de compactare şi consistenţă (duritate) diferite în funcţie de specie, tipul de explant din care provine şi condiţiile de cultură (Stănică, 1995, 1998). La kiwi, calusul cel mai consistent a fost produs de către limbul foliar, indiferent de mediul de cultură folosit. De asemenea, pH-ul 7, a avut ca efect producerea unui calus mai dens şi de culoare verde intensă, faţă de cel obţinut pe un mediu cu pH- ul de 5.5. Trebuie remarcat calusul cu aspect sticlos deosebit de consistent, de culoare verde, cu infiltraţii roz care a avut şi o mare capacitate organogenetică. Odată cu scăderea consistenţei, culoarea calusului trece de la verde închis strălucitor la verde deschis, verde albicios, brun şi alb gălbui.
216
În acelaşi timp, culoarea şi duritatea calusului, numărul de subculturi şi pH-ul mediului de cultură, s-a dovedit că influenţează radical viteza acestuia de creştere şi capacitatea organogenetică (Stănică F. şi Armeanu I. 2004). S-a observat de asemenea, o corelaţie inversă între cantitatea de calus produs şi procentul de organogeneză indirectă, respectiv între cantitatea de calus produs şi numărul de lăstari formaţi din calus. După o subcultură cu o creştere importantă a calusului, urmează o subcultură cu formarea unui număr mare de lăstari pe calusul respectiv. În funcţie de specie, provenienţă şi compoziţia mediului de cultură, calusul va continua să crească sau va începe să diferenţieze centri meristematici din care se vor forma apoi diferite organe prin organogeneză indirectă (foto 11.2.).
Foto 11.2. Calus cu capacitatea organogenetică ridicată obţinut din frunză de cicoare În trecut, se practica cultura calusului pe mediu solid, însă viteza de creştere a acestuia era mai redusă deoarece: suprafaţa de contact cu mediul era mai redusă, fapt care influenţa negativ absorbţia substanţelor nutritive; cantitatea de oxigen era limitată; o serie de factori prezenţi în mediul solid stimulau diferenţierea şi regenerarea unor organe şi reduceau creşterea calusului. Cultura calusului pe mediul lichid se realizează pe agitatoare în vase Erlenmeyer. În această situaţie, se folosesc agitatoare rotative cu o frecvenţă de rotire de 80-100 rotaţii/minut. Cantitatea de mediu trebuie să reprezinte 20-30% din volumul vasului. În funcţie de specie calusul rămâne agregat (Anthurium andreanum) sau se separă în celule formând o suspensie celulară (la morcov). Tabelele 11.1., 11.2., 11.3., şi 11.4. prezintă câteva rezultate ale lucrărilor de cercetare privind cultura de calus la speciile horticole.
217
Tabelul 11.1. Cercetări privind cultura de calus la plantele legumicole Zaharoză Agar Regulatori de creştere Denumirea speciei Explant iniţial Mediu pH (g/l) (g/l) (mg/l) 1 2 3 4 5 6 7 Ţesut medular Dunstan&Short (1977a) 5,5 30 8 (0,28)2,4-D Allium cepa BDS Radicele Dunstan&Short 1977a 5,5 30 8 (0,138) 2,4BDS D+(0,05)ANA Fragmente rădăcini Mullin (1970) 5,5-6,0 20 6 (6)2,4-D+15%CM Radicele Mullin 1970 5,5-6,0 40 6 (0,6)2,4-D+15%CM Peţiol Murashige&Skoog(1962) 30 agar (0,5)2,4-D+(0,6)Kin Apium graveolens Calus Murashige&Skoog(1962) 30 agar (5)2,4-D Peţiol tânăr sau Murashige&Skoog(1962) 30 9 (0,5)2,4-D+(0,6)Kin frunze Peţiol 3-5cm Murashige&Skoog(1962) 5,6 30 10 (1)ANA+(0,1)Kin Fragmente de Murashige&Skoog(1962) 5,8 30 agar (0,5)2,4-D+(0,6) Kin frunză Internod Linsmaier&Skoog(1965) 30 6 Asparagus officinalis Calus Reuther (1984) 5,8 30 agar (1) AIA + [(0,1) BAP sau (0,5) 2iP] Ţesut medular White (1943 a)A 30 agar (5) ANA + 10% CM Calus Fragmente de hipocotil
Murashige & Skoog (1962) Linsmaier & Skoog (1965)
-
30
lichid
(5) 2,4 -D +10% CM
5,8
30
8
(1) 2,4-D + (0,315) Kin
218
Autori 8 Dunstan&Short (1977a) Dunstan&Short (1977b) Mullin 1970 Mullin 1970 Al-Abta & Collin (1978) Al-Abta & Collin (1978) Browers&Orton (1982) Chen (1976) Zee&Wu (1980) Hunault (1976) Reuther (1984) Steward & Mapes (1971 b) Steward & Mapes (1971 b) Wilmar & Hellendoorn (1968)
1 Brassica oleracea botrytis
2 Fragmente de frunze Ţesut medular Hipocotil Calus
Brassica oleracea capitata Brassica oleracea gemmifera Cichorium intybus Cucumis melo
Cucumis sativus
Minicalus Fragmente de peţiol Fragm. foliare obţinute in vitro Fragmente de frunză sau cotiledon Cotiledon Internod Calus Calus
Tabelul 11.1. continuare 7 8 (0,22)2,4-D +(0,22) Kin Bagga et al (1982)
3 Bagga et al. (1982) 1
4 5,5
5 20
6 8
Gamborg et al. (1968) B5 Murashige&Skoog (1962) Murashige&Skoog (1962) Lillo & Shahin (1986)
5,5
20
8
(2) ANA + (0,5)BAP
Bagga et al (1982)
5,8
30
8
Dietert et al (1982)
5,8
30
8
5,6
30
7
Clare & Collin (1973)
5,7
30
7
(1,1)2,4-D+(0,11) Kin +10% CM (8) IBA + (0,04) Kin +15% CM (1) 2,4-D + (0,5) BAP + (0,1) ANA + (40) AdS (1) IBA + (2) AIA + (0,05) Kin
Murashige & Skoog (1962) Bourgin&Nitsch (1967)H
Heinz&Mee(1969) Murashige&Skoog (1962) Murashige&Skoog (1962) Lazarte&Sasser (1982)MS Fragmente de hipocotil Murashige&Skoog sau cotiledon (1962) Murashige&Skoog Cotiledon sau hipocotil (1962)
ANA, BA 5,7
40 glucoză
8
5,7 5,8 5,8
30 30 30 20
8 agar agar 8
30
agar
30
agar
5,8
219
-
Dietert et al (1982) Lillo & Shahin (1986) Clare & Collin (1974) Saksi şi co. (1986) Blachmon & Reymonds (1982)
(6)Kin+(1,5)AIA Moreno et al.(1984) (0,19)ANA+(0,023)BAP Aziz&McCown(1985) (6,75)BAP Aziz&McCown(1985) (0,1)IBA+(1)BAP+ Lazarte&Sasser (0,1)GA3 + (162)PG (1982) (0,37)ANA+(0,23)BAP Sekioka&Tanaka (1981) (1)ANA+(1)BAP Wehner&Locy (1981)
1 Daucus carota
Ipomoea batatas
2 Fragmente rădăcini Calus
3 Abou-Mandour (1977a)
Cambiu-rădăcină
Butcher&Ingram (1976)C Caplin&Steward(1948)
Fragmente rădăcină Fragmente rădăcină Peţiol Rădăcini Fragmente rădăcină Fragmente rădăcină Calus Fragmente tuberculi Calus
Lactuca sativa
Cotiledon sau frunze cotiledonare Peţiol Calus Fragmente de frunză
4 5,6
5 30
6 10
20
lichid
5,5
20
7
5,6
20
8
5,7-5,8
30
8
5,6 5,7-5,8
20 20 30
agar lichid 8
5,8
30
8
5,8
30
8
20
8
20
8
5,8
30
8
5,7-5,9
20
6
(0,1)ANA+15%CM
5,7-5,9
0
6
(0,1)ANA+15%CM
5,8
30
10
(5)AIA+(0,5)Kin
Gamborg et al.(1968)
Murashige & Skoog (1962) Halperin (1966)A Lamport 1964 Murashige & Skoog (1962) Murashige & Skoog (1962) Murashige & Skoog (1962) Henderson et al.(1984)1. Henderson et al.(1984)2. Murashige&Skoog (1962) Vasil&Hildebrand (1966c) C Fukamil&Hildebrand (1966c) THS Miller (1961a,1963)
Tabelul 11.1. continuare 7 8 (2)AIA+(6)2,4-D+ Abou-Mandour (0,3)Kin+(4)AdS (1977a) (1,1)2,4-D+(0,1)Kin Baldwin&Gresshoff (1978) (0,15)2,4-D+(0,15)Kin Butcher&Ingram (1976) (0,1)ANA+15%CM Caplin&Steward(19 48) (10) 2,4-D+[(2)BAP sau Dodds&Roberts 10%CM] (1982) (0,1-1)2,4-D Halperin (1964) (0,6-6)2,4-D+10-40%CM Lamport (1964) (10) 2,4-D+[(2)BAP sau Dodds& 10%CM] Roberts(1982) (0,25) 2,4-D Handley&Locy (1984) (0,5) 2,4-D+(3)Kin Handley&Locy (1984) (3)2,4-D Henderson et al.(1984) (1)2,4D+(1)ANA+(0,25) Henderson et 2iP+ (2)ABA al.(1984) (0,05)ANA+(0,5)BAP Brown et al (1986)
220
Fukami&Hildebrandt(19 67) Fukami&Hildebrandt (1967) Koevary et al (1978)
1 Lactuca sativa
Lycopersicon esculentum
2 Fragmente de frunză Calus Frunze Ţesut medular Calus Calus Hipocotil Fragmente frunze Fragmente frunze
Pastinaca sativa Petroselinum hortense Phaseolus vulgaris
Pisum sativum
Fragmente de frunze Fragmente de frunze Peţiol Fragmente de frunza/ rădăcini Fragmente de frunze Fragmente de frunze
Tabelul 11.1. continuare 7 8 (6)2,4-D+ Vasil & Hildebrandt (0,1)ANA+15%CM (1966c) (0,1)ANA+15%CM Vasil & Hildebrandt (1966c) (0,5)2,4-D+(1)BAP Behki&Lesley (1980) (2)Z Cassells (1979)
3 Vasil&Hildebrand (1966c)C Vasil&Hildebrand (1966c)C Murashige&Skoog (1962) Murashige&Skoog (1962) Murashige&Skoog (1962) Gresshoff&Doy (1972a,b)DBM3 Murashige&Skoog (1962) Linsmaier&Skoog (1965) Kartha et al. (1974a)
4 5,7-5,9
5 20
6 6
5,7-5,9
20
6
30
8
5,8
3
6
5,8
3
6
(2)Z
Cassells (1979)
5,8-6,4
20
8
(5)ANA+(0,01 )Kin
5,8
30
agar
(2)BAP
Gresshoff&Doy (1972b) Gunay&Rao (1980)
30
agar
(0,4)AIA+(4)Kin
5,8
30
8
Pence & Caruso (1984)
-
30
8
Abou-Mandour (1977a)
5,6
30
10
Vasil & Hildebrandt (1966c)C Abou-Mandour (1977a)
5,7-5,9
20
6
5,6
30
10
Veliky & Martin (1970) 67-V Murashige&Skoog (1962)
4,5
20
10
[(1,1-2,3)BAP+/-(0,021,8)AIA] sau [(0,221,1)+/-(0,18-1,8)AIA] [(2,5) IA, Ala/ (2-3) IA, Gly] + (0,2) BAP (2) AIA + (6) 2,4-D +(0,3) Kin + (4)AdS (6) 2,4-D +(0,1) ANA + 15% CM (2) AIA + (6) 2,4-D +(0,3) Kin + (4)AdS (1) AIA + (10) Kin
5,8
30
10
(0,06) pic + (1) Kin
221
Herman&Haas(1978 ) Kartha et al. (1976) Pence & Caruso (1984) Abou-Mandour (1977a) Vasil & Hildebrandt (1966 b,c) Abou-Mandour (1977a) Crocomo et al (1976) Jacobsen & Kysely (1984)
1 Solanum melongena Solanum tuberosum
2 Fragmente hipocotil Fragmente lăstari Calus Fragmente tuberculi Fragmente tuberculi Fragmente frunze
Spinacia oleracea
Calus din peţiol Calus
Tabelul 11.1. continuare 7 8 (0,8)ANA + (0,225) Matsuoka& Hinata BAP + (10) AdS (1979) (5)ANA Austin & Cassells (1983) (0,2)ANA + (0,1) AIA + Austin & Cassells (0,5) BAP + (0,1) Kin + (1983) (0,2) GA3 (8) ANA + (0,5) Kin Bragdo – Aas (1977) (2) 2,4 -D Gamborg (1966)
3 Matsuoka& Hinata (1979) Murashige&Skoog (1962) Austin & Cassells (1983)4
4 5,5
5 20
6 8
5,8
30
7
5,7
10
10
Engvild (1973) MSN
5,8
30
agar
Gamborg (1966) PRL – 4–C Ratnamba & Chopra (1974) Vasil& Hildebrandt (1966 c)C Fukami & Hildebrandt (1967) THS
5,8
20
agar
5,8
20
7
5,7-5,9
20
6
(3) 2,4-D + (0,3)Kin + (0,4) GA3 + (40 ) AdS (0,1) ANA + 15% CM
5,7-5,9
0
6
(0,05) Kin + 15% CM
222
Gavinlertvatana & Li (1980) Fukami & Hildebrandt (1967) Fukami & Hildebrandt (1967)
Tabelul 11.2. Denumirea speciei 1 Amygdalus communis Ananas comosus
Cerasus avium Cerasus mahaleb
Cerasus vulgaris Cocos nucifera Diospyrus kaki
Cercetări privind cultura de calus la plantele pomicole Zaharoză Agar Regulatori de creştere Autori Explant iniţial Mediul de cultură pH (g/l) (g/l) (mg/l) 2 3 4 5 6 7 8 Fragmente Wu & Kuniyuki (1985) 5 0 8 (0,1)ANA +(0,45) BAP Wu & Kuniyuki lăstari CS (1985) Fragmente Murashige&Skoog 30 0 (20)Ad sau Mapes (1973) lăstari (1962) (30)adenosine Lăstari Murashige & Skoog 30 0 (5,4)ANA+ (5,2)AIA Matheus & (1962) (agar) +(2,1)Kin Rangan (1981) Calus Matheus & Rangan 30 0 (10)ANA+ 15%CM Matheus & (1981) (agar) Rangan (1981) internod Murashige&Skoog(1962) 5,3 30 0 (10)IBA+(1)ABA Feucht&Dausend(1976) Pierik et al (1974) 20 0 (1)ANA+(1)BAP Hedtrich (1977) Fragmente frunze internod Murashige & Skoog 5,6-5,8 30 5,5 (0,25)2,4-D+(0,2)Kin Coffin et al (1976) (1962) Fragmente Pierik et al (1974) 20 0 (4)ANA+(1)BAP Hedtrich (1977) frunze Internod Murashige & Skoog 5,6-5,8 30 5,5 (0,25)2,4-D+(0,2)Kin Coffin et al (1976) (1962) Ţesut medular Eeuwens(1976) Y3 5,5 45 agar (0,022)ANA+(0,05)Kin Eeuwens (1976) +(0,22)GA3 Hipocotil din Yokoyama&Takeuchi 5,6-5,8 30 7 (3)ANA+(0,1)Kin Yokoyama&Take embrioni imaturi (1976) uchi (1976) Ţesut medular Fujii & Nito (1972) 20 agar (5)Ad Fujii & Nito (1972)
223
1 Malus x domestica
2 Calus
3 Murashige & Skoog (1962) Murashige & Skoog (1962) Hurwitz & Agrios (1984)CS Schenk & Hildebrandt(1972) White (1943a)A
4 5,65,8 5,65,8 5,7 5,8
Ţesut medular
Litz et al (1984) Murashige & Skoog (1962) Linsmaier & Skoog (1965) Lavee (1963)21-MW Bradley & Dahmen (1972) Murashige & Skoog (1962) Linsmaier&Skoog (1965) Murashige & Skoog (1962) Murashige & Skoog (1962) Schenk & Hildebrandt (1972) Eeuwens (1976)Y3
Ţesut medular
Harvey (1967)Basal
Internod Fragmente frunze tinere Frunze cotiledonare Diferite surse Mangifera indica Musa cavendishii
Seminţe imature Calus
Musa spp,
Fragmente frunze Calus Mezocarp
Olea europaea Persica vulgaris
Internod Calus
Phoenix dactylifera Prunus domestica
Internod
Pyrus communis
Internod Seminţe
Phoenix dactylifera Ribes nigrum
5 0
6 5,5
0
5,5
30
8
30
8
20
agar
5,7
30 30
5,6
Tabelul 11.2. continuare 7 8 (2)ANA+(0,2)Kin Chong & Taper (1974) (0,25)2,4-d+(0,2)Kin Coffin et al (1976)
8 0
(1)2,4-D+(2)ANA +(0,2)Kin (0,5)2,4-D+(2)CPA +(0,1)Kin (4)ANA+(2)Kin +(1)GA3 + 15% CM (2)2,4-D (5)IBA
Mehra & Sachdeva (1979) Litz et al, (1984b) Ma et al (1978)
30
3
(20)Dicamba
Jarret et al (1985b)
6,6 6,5
20 20
10 8
(2)AIA+suc de piersici
5,65,8 5,7
30
5,5
(0,25)2,4-D+(0,2)Kin
Lavee (1963) Bradley&Dahmen (1972) Coffin et al (1976)
30
8
(3)2iP +(40)AdS
Tisserat et al (1979)
5,65,8 5,65,8 5,9
30
5,5
(0,25)2,4-D+(0,2)Kin
Coffin et al (1976)
30
5,5
(0,25)2,4-D+(0,2)Kin
Coffin et al (1976)
30
6
5,5
45
agar
6
30
10
224
Hurwitz & Agrios (1984) Liu et al (1983a)
(0,5)2,4-D+(2)CPA Schenk & +(0,1)Kin Hildebrandt (1972) (0,022)2,4-D+(0,05)Kin Eeuwens (1976) +(0,22)GA3 (0,15)2,4-D+(1)Kin Harvey&Grasham (1977)
1 Theobroma cacao
2 Pericarp
3 Dublin (1984)
4
5 30
6 agar
Hipocotil
Hall & Collin (1975)
5,7
30
10
Hipocotil
Jalal & Collin (1979)
5,7
30
10
Fragmente frunze Cotiledon
Maraffa & Sharp (1979) Gamborg et al (1968) B5 a:G Murashige & Skoog (1962)
5,5
30
10
5,5
20
7
5,7
30
7
Calus
Tabelul 11.2. continuare 7 8 (0,5-1)2,4-D+[(1)BAP Dublin (1984) sau Z] (2)AIA+(2)IBA+(0,1)K Hall & Collin in +10%CM (1975) (1)IBA+(0,05)Z Jalal & Collin (1979) 2,4-D Maraffa & Sharp (1979) (1)2,4-D+(0,2)Kin Tsai & Kinsella (1981) (1)2,4-D+10%CM Tsai & Kinsella (1981) Tabelul 11.3.
Denumirea speciei 1 Acer negundo Acer pseudoplatanus Acer rubrum Betula pendula
Cercetări privind cultura de calus la arborii şi arbuştii ornamentali Zaharoză Agar Regulatori de creştere Explant Mediul de cultură pH Autori (g/l) (g/l) (mg/l) 2 3 4 5 6 7 8 Calus Radojevic et al (1980) 20 6 (3)ANA + (1)Kin + Radojevic et al (2)Ad (1980) Ţesut cambial Lamport (1964) 20 7,5 (0,6-6)2,4-D+10-40%CM Lamport (1964) Cambiu Sunderland (1966) 5,4 20 agar (0,1)ANA+10%CM Sunderland (1966) Calus Sunderland (1966) 5,4 20 agar [(1)2,4-D sau Sunderland (1966) (10)ANA] +10%CM Cambium 0,5 x Linsmaier&Skoog (1965) 5,6 20 Agar (5)AIA + (0,2)Kin Mathes et al (1973) Fragmente Simola (1985)N7 Supl 5,6 20 6 [(2)2,4-D+(0,5)Kin] sau Simola (1985) frunză [(5)2,4-D+(1)Kin] Calus Simola (1985)N7 5,6 20 6 [(2)2,4-D / ANA] + Simola (1985) (0,5)Kin
225
Tabelul 11.3. continuare 7 8 (1)ANA Jacquiot (1955) (0,25)2,4-D + (0,2)Kin Coffin et al (1976)
1 Betula verrucosa Crataegus x mordensis Fraxinus pennsylvanica
2 Cambiu Internod
3 4 Jacquiot (1955) Murashige&Skoog (1962) 5,6-5,8
5 30 30
6 agar 5,5
Ţesut medular Calus
30 30
10 10
(0,05)2,4-D + (1)Kin (0,04)2,4-D + (1)Kin
Gingko biloba
Calus
Reinert & White (1956) 5,6-5,8 Wolter & Skoog (1966) 5,6Standard 5,8 Tulecke (1964) 5,5
20
10
Hedera helix
Ţesut medular Ţesut medular
30 20
5 8
(1)ANA + (0,5)Kin + (10)AdS (2)ANA + (0,5)BAP (1)ANA + 10%CM
Picea abies
Ţesut medular
10 glucoza
8
(0,5) AIA + (0,5) Kin
Picea glauca
Ţesut
20
agar
Picea pungens
Hipocotil Ţesut medular
35 10 glucoza
5 8
(2,5) ANA + (1) Kin (0,5) AIA + (0,5) Kin
Pinus nigra
Ţesut medular
10 glucoza
8
(1) ANA + (0,5) Kin
Pinus strobus
Lăstari
6
20
6
(0,2) ANA + (2) BAP
5,8 5,5
30 30
8 6
(0,1) 2,4 –D + (0,1) Z (0,9) ANA + (1,13) BAP
20
7,5
40
8
(0,6-6) 2,4-D + 10-40% CM (1) 2,4-D + 15% CM
Pseudotsuga menziesii Rosa sp.
Calus Cotiledoane
Murashige&Skoog(1962) Stoutemyer & Britt (1965) Harvey & Grasham (1969) 1 De Torok & Thimann (1961) Durzan et al (1973) Harvey & Grasham (1969) 1 Harvey & Grasham (1969) 1 Kasperbauer & Reinert (1967) Murashige&Skoog(1962) Cheng (1977; 1978)
Ţesut medular
Lamport (1964)
Syringa vulgaris
Cambiu
Wetmore&Sorokin(1955)
5,7 5,6
5,6
5,5
226
Wolter&Skoog(1966) Wolter & Skoog (1966) Tulecke (1964) Banks (1979) Stoutemyer & Britt (1965) Harvey & Grasham (1969) De Torok & Thimann (1961) Durzan et al (1973) Harvey & Grasham (1969) Harvey & Grasham (1969) Kaul (1986) Minocha (1980) Cheah & Cheng (1978) Lamport (1964) Wetmore&Rier(1963)
Tabelul 11.3. continuare 1 Thuja plicata
2 Ţesut medular
Vinca rosea
Ţesut din sămânţă
3 Harvey & Grasham (1969)3 Schenk & Hildebrandt (1972)
4
5 25 glucoza
6 8
7 (1) ANA
5,9
30
6
(0,5) 2,4-D + (2) CPA + (0,1) Kin
8 Harvey & Grasham (1969) Schenk & Hildebrandt (1972)
Tabelul 11.4. Cercetări privind cultura de calus la viţa de vie Explant iniţial
Rezultatul
Mediu
pH
1 Vitis vinifera
2 Antere
3 Calus
5 5,8
6 20
7 8
Vitis vinifera
Calus
3-5,5
Calus
5,75,8 5,5
20
Vitis vinifera
Lăstari tineri sau peţiol Frunze
20
agar
Vitis vinifera
Calus
Lăstărire
5,5
20
agar
Vitis vinifera
Ovule
Calus
5,6
20
0
Vitis vinifera
Ovule
Calus
5,6
20
0
(0,1)ANA+(0,2)Kin+ 15%CM (0,1)ANA+(0,2)Kin+ 15%CM (2,8)CPA + 10-15% CM (1,1)BAP
Vitis vinifera
Calus
5,6
20
0
(1)NOA+(1,1)BAP
Vitis vinifera x Vitis rupestris
Antere
Calus embriogen Calus
4 Gresshoff & Doy (1974)1 Jona & Webb (1979)C Gamborg (1966) PRL-4-C Gamborg (1966) PRL-4-C Mullins & Srinivasan (1976) HDVM Mullins&Srinivasan(1 976)N Mullins&Srinivasan (1976)N Bourgin & Nitsch (18670 H
20
0
(1,11)2,4-D + (0,225)BAP
227
Zaharoză Agar (g/l) (g/l)
Regulatori de creştere (mg/l) 8 (2)ANA+(2)AIA+ (1,5)Kin (1)ANA+(0,2)Kin
Denumirea speciei
Autori 9 Jona & Webb (1979 Lai & Yye (1980) Lai & Yye (1980) Mullins & Srinivasan (1976) Mullins & Srinivasan (1976) Mullins & Srinivasan (1976) Rajakeran & Mullins (1979)
11.2. Cultura de protoplaşti şi hibridarea somatică Protoplaştii sunt celule lipsite de peretele celular, care au capacitatea de a fuziona, de a se divide în continuare şi de a da naştere la plante noi. Hibridarea somatică, cunoscută sub numele de hibridare parasexuată, constă din fuzionarea (contopirea) a doi protoplaşti realizată prin contopirea nucleilor şi citoplasmei acestora. Celula obţinută este un hibrid somatic şi ea poate da naştere unei plante întregi. În anumite situaţii, schimbul de material genetic este parţial. Se poate întâmpla ca în urma fuziunii protoplaştilor nucleii să nu fuzioneze şi să se realizeze numai o hibridare a citoplasmei. În acest caz vorbim de hibridare citoplasmatică, plantele obţinute fiind numite hibrizi citoplasmatici sau cibrizi. Realizarea unor astfel de hibrizi este importantă pentru transmiterea unor caractere controlate de ereditate citoplasmatică. Este cazul transmiterii sterilităţii mascule care este controlată de gene existente în mitocondrii. Etapele hibridării somatice (Pierik, 1987): 1- Alegerea şi creşterea materialului iniţial. Alegerea genotipurilor este esenţială întrucât nu toate se comportă la fel. Astfel la tomate, Evans şi Bravon,1983 a, au obţinut rezultate pozitive cu un singur genotip din cele 14 încercate. Condiţiile de creştere a materialului vegetal sunt şi ele importante. Se recomandă ca ultimele faze de creştere să se desfăşoare în condiţii controlate (seră, fitotron, etc.) pentru a oferi plantelor condiţii optime (Evans şi Bravon 1983 a). Se preferă folosirea materialului vegetal cultivat in vitro care, pe lângă juvenilitate, prezintă avantajul că nu trebuie sterilizat. Cel mai frecvent, pentru obţinerea protoplaştilor se foloseşte mezofilul frunzei. Alte organe folosite pentru izolarea protoplaştilor sunt vârfurile de lăstari (Binding şi colab., 1981), puieţii în primele faze de creştere, cotiledoanele şi hipocotile (Potrykus şi colab., 1983). Datorită instabilităţii genetice, calusul sau suspensiile celulare sunt mai puţin folosite. 2. Dezinfectarea materialului vegetal se face urmărind tehnica şi metodologia folosită la iniţierea culturilor in vitro. Datorită faptului că ţesuturile folosite sunt juvenile, trebuie acordată o atenţie deosebită timpilor şi concentraţiilor folosite pentru a nu afecta viabilitatea celulelor.
228
Din acest punct de vedere, tratamentele aplicate mezofilului trebuie să fie cât se poate de "blânde". 3. Izolarea protoplaştilor se face prin macerarea enzimatică a peretelui celular. De regulă, se foloseşte un amestec de enzime ca celuloza, pectinoza şi uneori hemiceluloza. Aceste enzime dizolvă celuloza, pectina (lamela mediană) şi stratul de hemiceluloză. În urma procesului de macerare celula rămâne doar cu plasmalema intactă. În timpul tratamentului enzimatic trebuie asigurată în soluţie o presiune osmotică superioară pentru a preveni plasmoliza celulelor. Acest lucru este realizat prin adăugarea de glucoză, manitol şi sorbitol. Datorită efectului negativ al agenţilor osmotici asupra protoplaştilor, durata tratamentului enzimatic trebuie redusă la minimum posibil. Macerarea enzimatică a celulelor se efectuează de regulă la întuneric, fiind importante şi celelalte condiţii de lucru: temperatură, pH, viteza de agitare etc. După obţinerea protoplaştilor aceştia se purifică prin filtrare prin site metalice sau de nylon pentru înlăturarea impurităţilor de tipul pereţilor celulari etc. Urmează apoi o centrifugare la turaţie redusă într-o soluţie cu zaharoză (15-20%) pentru a separa protoplaştii. 4. Fuziunea protoplaştilor se realizează prin inoculare într-o soluţie concentrată de polietilenglicol (PEG), care are şi o mare concentraţie de ioni de Ca2+ şi un pH ridicat (Menczel, 1983). Acest tratament are ca scop înlăturarea sarcinii negative a protoplaştilor. După realizarea fuziunii polietilenglicolul şi ioni de Ca2+ sunt spălaţi. Zimmermann (1982) a propus şi realizat electrofuziunea protoplaştilor (fuziunea întrun câmp electric), această tehnică determinând creşterea viabilităţii lor. Kameya (1984) a realizat, în schimb, fuziunea protoplaştilor prin folosirea dextranului şi a stimulării electrice. După fuzionarea protoplaştilor are loc fuzionarea nucleilor. Atunci când se urmăreşte fuzionarea protoplaştilor proveniţi de la două genotipuri diverse A şi B, apare problema selecţiei hibrizilor somatici din suspensia celulară. În populaţia de celule vor fi întâlniţi protoplaşti nefuzionaţi A, B, celule AA, BB (monocarion) şi hibrizi somatici AB (heterocarion) care trebuie selectaţi. Hibridarea somatică s-a realizat cu succes la plante din familia Solanaceae. Un aspect interesant îl reprezintă hibridarea somatică interspecifică şi mai ales, intergenerică. 229
Au fost astfel realizaţi hibrizi între Solanum tuberosum şi Lycospersicon esculentum, sau între Brassica şi Arabidopsis, între Daucus şi Aegopodium podagraria (Vasil 1978, Thomas şi colab. 1979) Frecvent însă hibrizii realizaţi sunt inutilizabili, fiind sterili. Cercetările continuă pentru obţinerea unor hibrizi utili din punct de vedere agronomic la un număr de specii, vărzoase, lucernă, tomate, cartof, trifoi, morcov, tutun, petunii etc. 5. Cultura protoplaştilor, regenerarea peretelui celular, diviziunea celulară Cultura de protoplaşti presupune asigurarea unor condiţii deosebite. Astfel, în timpul regenerării peretelui celular potenţialul osmotic al mediului de cultură trebuie să fie redus şi concentraţia ionilor de Ca2+ ridicată. După regenerarea peretelui celular (câteva zile) potenţialul osmotic trebuie să crească treptat (Burgess, 1983). După 2-7 zile de la izolarea protoplaştilor, are loc prima diviziune celulară. Cultura de protoplaşti se poate realiza în diferite moduri: -
într-un strat subţire de mediu lichid, în vase Petri;
-
pe mediu solid după tehnica Bergmann (1960);
-
în microcamere de sticlă;
-
în picături de mediu lichid (metoda micropicăturii) în vase Petri;
-
cultura în “creşă” (“nurse culture) - protoplaştii sunt crescuţi pe o punte de hârtie de filtru sau celofan aşezate pe un strat de celule “mamă”.
-
cultura în dublu strat lichid + solid
-
cultura pe pat de agar şi discuri de agar (Shillito şi colab., 1983; Dons şi Bouwer, 1986). După formarea peretelui celular condiţiile de creştere sunt similare celor folosite la cultura de celule izolate, atât în ceea ce priveşte compoziţia mediului de cultură cât şi factorii de creştere. Cele mai bune condiţii de creştere a protoplaştilor se realizează la întuneric sau lumină de slabă intensitate. După formarea aglomerărilor de celule (microcalus) se trece la faza următoare, de regenerare a noilor plante. 6. Regenerarea de noi plante Posibilitatea regenerării de noi plante este încă redusă (Evans şi Bravo, 1983; Binding şi colab., 1982). Acest lucru a fost posibil până în 1983 la 66 de specii din care 38, sunt din Familia Solanaceae. 230
Factorii de care depinde regenerarea sunt: -
familia, specia şi genotipul;
-
nivelul de diferenţiere a materialului iniţial;
-
condiţiile de creştere a materialului iniţial;
-
folosirea mediilor de cultură bogate: Kao şi Michayluk pentru calus (1975), B5, suplimentat cu 5-10% lapte de cocos, pentru embrioni şi organe (Gamborg şi colab., 1982) şi MS (Murashige & Skoog, 1962). Avantajele hibridării somatice sunt multiple:
-
realizarea tetraploizilor, a amfidiploizilor şi fuzionarea protoplaştilor haploizi;
-
hibrizi la plante cu probleme sexuale: organe incomplet/ insuficient dezvoltate, sterilitate masculină etc.
-
hibridare între plante juvenile înainte de primul înflorit;
-
hibridare parţială pentru obţinerea hibrizilor asimetrici la care nu toţi cromozomii se combină după fuziunea nucleară.
-
realizarea transmiterii caracterelor citoplasmatice de la partenerul mascul – ereditatea citoplasmatică – hibrizi citoplasmatici – sterilitate masculină, rezistenţă la boli şi erbicide etc. Problemele şi dezavantajele hibridării somatice sunt redate în continuare:
-
lipsa unei metode eficiente de selecţie a hibrizilor somatici;
-
produşii obţinuţi sunt frecvent necorespunzători, neviabili, sterili, instabili etc.
-
poate apărea formarea unui calus himeric în locul plantelor;
-
apar amfidiploizi, care de regulă sunt nedoriţi (4n);
-
produşii obţinuţi au o variabilitate accentuată;
-
nu se poate asigura transmiterea unui caracter dorit, datorită stabilităţii genetice reduse;
-
frecvent, la combinaţii necompatibile, apare eliminarea cromozomilor străini;
-
producţia de cibrizi este încă slab dezvoltată;
231
11.3. Regenerarea plantelor dintr-o singură celulă După izolarea unor celule, s-a pus problema stimulării fiecăreia dintre ele de a se divide şi eventual de a da naştere unor lăstari sau plante întregi. Primele rezultate pozitive au fost obţinute de Muir şi colab. (1954, 1958) care au cultivat o celulă pe o punte din hârtie de filtru, care a fost aşezată apoi pe o bucată de calus din care celula respectivă a provenit. Extrăgând substanţele hormonale şi nutritive formate de calus prin puntea de filtru, celula a început să crească şi să se dividă. Bergmann (1960), după ce a filtrat o suspensie de celule de tutun şi mazăre, le-a amestecat într-un mediu de cultură cu agar care era pe cale să se solidifice. După dispersarea celulelor şi întărirea mediului de cultură, acestea au început diviziunea şi formarea calusului. Pentru stimularea proliferării la acea dată se folosea 2,4 D şi laptele de cocos. Alte încercări reuşite de inducere şi de realizare a diviziunii unor celule izolate au constat în cultivarea unor celule în micro-camere pe agar în vecinătatea unor "celule-mamă" de calus (Strat, 1973). Pentru obţinerea celulelor izolate există mai multe metode: - filtrarea suspensiilor celulare prin site din diferite materiale; - dezintegrarea calusului pe cale mecanică sau chimică prin adăugarea de pectinoză; - macerarea peretelui celular cu ajutorul unor enzime, urmată de separarea protoplaştilor. Ulterior aceştia îşi refac membrana celulară şi încep diviziunea; - folosirea grăunciorilor de polen pentru obţinerea unor celule izolate; - centrifugarea suspensiilor de celule şi separarea acestora pe baza diferenţelor de masă etc. Obţinerea unei culturi monocelulare este dependentă de: genotip, densitatea celulară, rata diviziunii celulare în material iniţial, vârsta materialului iniţial, prezenţa calusului iniţial, compoziţia mediului de cultură (Pierik, 1987). După separarea celulelor, fiecare dintre ele se divid formând calus din care vor lua naştere apoi lăstarii sau embrionii somatici. Culturile monocelulare au fost realizate cu succes la Nicotiana tabacum, Daucus carota, Cichorium endivia, Asparagus officinalis, Brassica napus, Citrus sinensis, etc.
232
Capitolul 12 Baby plant 12.1. Consideraţii generale O aplicaţie comercială a culturilor in vitro, destul de răspândită după anii 80’, este baby plant. Acest nou produs se obţine prin cultivarea unor specii horticole pe medii colorate în vase din sticlă decorative. Astfel realizat, este destinat valorificării ca obiect decorativ care poate „trăi” 6- 12 luni sau chiar mai mult. În momentul în care explantele au ocupat volumul interior al vasului în care au crescut şi mediul de cultură s-a epuizat, acestea se pot scoate în condiţii in vivo, se pot aclimatiza şi trece la ghivece. Crearea de baby plants a fost posibilă prin îmbinarea tehnicilor de microînmulţire, cu diverse modele de sticlărie şi medii colorate. La baza acestor combinaţii stă bunul gust, imaginaţia şi plăcerea de a crea frumosul. Produsele Baby plant pot înfrumuseţa orice spaţiu interior, conferind prospeţime şi culoare. Ele pot fi aşezate pe mobila din sufragerie, pe consola din baie, pe noptiera din dormitor, pe birou sau în apropierea unei ferestre. Când sticluţele cu baby plant sunt comercializate, ele sunt întotdeauna însoţite de câteva sfaturi practice de întreţinere: - niciodată să nu se îndepărteze dopul; - sticluţele nu se expun direct la soare; - se evită răsturnarea sau agitarea recipientului; - se ţin la distanţă de orice sursă de căldură. Pentru realizarea produselor baby plant se folosesc plante care în principiu, trebuie să răspundă la următoarele cerinţe: - să fie decorative; - să aibă creştere redusă în timp pentru a nu ocupa rapid vasul de prezentare; - să aibă talii asemănătoare; - să aibă cerinţe asemănătoare faţă de mediul de cultură şi, în general să nu fie mari consumatoare de substanţe nutritive; - să nu-şi modifice aspectul la cultivarea pe medii colorate;
233
- să nu aibă cerinţe deosebite faţă de factorii de mediu şi să crească bine la temperatura camerei; - să se aclimatizeze uşor; Dintre speciile cele mai folosite pentru realizarea de produse baby plant amintim: Syngonium, Phylodendron, Vriestea, Spathiphylium, Aechemea, Cordyline, cactuşi şi alte specii de suculente etc. 12.2. Tipuri de produse şi materiale folosite la producerea de baby plant 12.2.1. Vase din sticlă Varietatea gamei de modele şi dimensiuni de vase în care se pot realiza baby plants este impresionantă. În această situaţie, cel mai important rol îl joacă imaginaţia fiecăruia. Se pot folosi vase de laborator de tip Erlenmeyer (100 ml), sticlărie destinată ambalării produselor alimentare (50ml,150ml, 250ml, 400ml), sticluţe de parfum, vase pentru servirea vinului, bomboniere, vase din cristal, etc. Detaliind departamentul formelor recipientelor, putem vorbi despre vase cilindrice, conice, tronconice, rotunde, pătrate, piramidale, prismatice, hexagonale, octogonale, de tip pară, turtite, bombate, cu sau fără mâner, cu gât lung sau scurt, cu deschidere mai mult sau mai puţin largă, etc. Recipiente aparent banale, pot căpăta o imagine deosebită folosindu-le pentru baby plant. În funcţie de ocazia cu care sunt oferite produsele baby plants se pot alege forme adecvate ale vaselor. De exemplu, pentru perioada Crăciunului există recipiente cu forma unui brad sau a unui sfeşnic. Este foarte important ca sticla să fie albă şi perfect transpsrentă pentru a nu împiedica în nici un fel captarea luminii şi pentru
a nu îngreuna vizibilitatea către
interiorul vasului. Dimensiunea recipientului se corelează cu specia pentru a asigura acesteia spaţiul necesar dezvoltării timp de mai multe luni. 12.2.2. Alte materiale Deoarece produsele baby plant se realizează în condiţii aseptice, trebuie alese materiale cu care putem realiza acest lucru. Se pot utiliza dopuri de plastic, sticlă, cauciuc sau plută, capace metalice sau de plastic, iar pentru izolare silicon transparent, folie pentru alimente, chip band sau bandă izolatoare.
234
Pentru a conferii produselor o valoare estetică deosebită se folosesc accesorii adecvate fiecărei ocazii, de exemplu: panglici şi şnururi de diferite culori, dimensiuni şi combinaţii, hârtie creponată sau pânză, ciucuri, flori artificiale şi multe altele în funcţie de imaginaţia fiecăruia. 12.3. Folosirea mediilor de cultură colorate Pentru colorarea mediilor de cultură, se pot folosi mai multe tipuri de substanţe care trebuie să răspundă la următoarele cerinţe: - să nu fie toxice pentru plante; - să nu determine colorarea ţesuturilor plantelor; - să nu formeze compuşi toxici, prin descompunere sau prin reacţie cu celelalte componente ale mediului; - să fi stabile şi să nu se decoloreze prin autoclavare; - să-şi păstreze culoarea în timp, în condiţii de iluminare naturală şi artificială. În general este recomandat să se folosească coloranţi alimentari. În acelaşi timp, se pot folosi coloranţi naturali, dar trebuie testată în prealabil persistenţa culorii în timp şi influenţa asupra explantelor (Groza I., 2004). În tabelul 12.1. şi graficul aferent, este ilustrată influenţa tipului de colorant asupra ratei de multiplicare şi creşterii lăstarilor de Sequoia sempervirens, după o lună de cultură pe mediu colorat.
235
Tabelul 12.1. Comportarea explantelor de Sequoia sempervirens pe medii de cultură colorate Culoarea mediului albastră galbenă violetă verde roşie
Colorantul colorant alimentar praf colorant alimentar lichid amestec colorant albastru şi roşu amestec colorant albastru şi galben colorant alimentar praf
Cantitate/ 100 ml mediu
Rata de multiplicare
Lungimea lăstarilor (cm)
0,02 g
11,00
2,95
1 ml
16,00
5,91
0,01 g+0,01 g
15,20
5,47
0,01 g+0,01 g
8,00
6,46
0,02 g
7,80
3,35
]
S-a observat că pe mediile de cultură colorate mai închis este stimulată formarea şi creşterea rădăcinilor.
236
a
b
c Foto 12.1. Testarea culorilor şi unor specii de plante: a – Gasteria sp. b - Sequoia sempervirens, c - Drosera rotundifolia
237
a
b Foto 12.2. Produse baby plant pregătite pentru livrare
238
Bibliografie selectivă Al-Abta S. & Collin H.A. – Control of embryoid development in tissue culture of celery. Plant Sci. Lett. 16. 773-782, 1978 Austin S. & Cassells A.C. – Variation between plants regenerated from individual calli produced from separated potato stem callus cells. Plant Sci. Lett. 31, 107-114, 1983. Aziz H.A. & Mccown B.H. – Hormonal response curves of shoot and callus culture of cucumber (Cucumis sativus L.). Hortscience 20, 540, 1985 Bagga S., Bhalla-Sarin N., Sopory S.K. & Guha-Mukhrenjee S. – Comparison of in vitro plant formation from somatic tissue and pollen grains in Brassica olearacea var. botrytis. Phytomorph. 32, 152-156, 1982 Barba, M., Cupidi, A. - Il microinnesto del ciliegio e del pesco in vitro studio sull' idoneità dei portinnesti. Frutticoltura 5, p: 37-41, 1989. Barba, M., Cupidi, A., Ammirabile A. -Uso del microinnesto in vitro per il risanamento del mandorlo. Frutticoltura 3, p:73-75, 1990. Behki C., R.M. &Lesley S.M. – Shoot regeneration from leaf callus of Lycopersicon esculentum. Pflanzenphysiol. 90,83-87, 1980 Bigot C, Ohki S. & Mousseau J. – Experimental data for a strategy for the improvement of the shoot forming capacity in vitro. Acta Hort. 78, 125-132, 1977 Blackmon W.J., Reynolds B.D. – In vitro shoot regeneration of Hibiscus acetosella, muskmelon, watermenlon and winged bean. Horscience 17, 588-589, 1982 Blackmon W.J., Reynolds B.D. & Postek C.E. – Production of somatic embryo from callused cantaloupe hypocotyl explants. Hortscience 16, 451,1981b Bloksberg L.N. & Saltveit M.E. – Regenerating plants from axillary buds of field-grown iceberg lettuce hearts. HortScience 20, 540, 1985 Bonner J. – On the growth factor requirements of isolated tomato roots. Bull. Torrey Bot. Club 70 184-189, 1940B Bonner J. & Axtman G. – The growth of plant embryos i vitro. Preliminary experiments on the role of accessory substances. Proc. Nat. Acad. Sci. USA. 23, 453-457, 1937 Bonner J. & Bonner D. – Ascorbic acid and the growth of plant embryos. Proc. Nat. Acad. Sci. USA. 24, 70-75, 1938 Bragdo – Aas M. – Regeneration of plants from, callus of potato tubers. Acta Hort. 78, 133137, 1977 239
Brezeanu A., Roşu Ana, Mirancea D., Iordan M. (1983) - "Modificarea genetică a plantelor cu ajutorul protoplaştilor-perspective şi limite". În: Lucr.celui de al II-lea Simp.Naţ. Cult. Tes. Veg. Piteşti, p. 61-64. Browers M.A. & Orton T.J. – A factorial study of chromosome variability in callus cultures of celery (Apium graveolens). Plant Sci. Lett. 26, 65-73, 1982 Brown D.M. & Charlwood B.V. – The control of callus formation and differentiation in scented pelargoniums. J. Plant Physiol. 123 409-417, 1986 Bui Dang Ha D., Norreel B. & Masset T.A. – Regeneration of Asparagus officinalis L. through callus cultures derived from protoplasts. J. Exp. Bot. 26, 263-270, 1975 Butcher D.N. & Ingram D.S. – Plant Tissue Culture. Inst. of Biology, Studies in Biology no 65. Edward Arnold, 1976 Cachiţă-Cosma, Dorina - Metode in vitro la plantele de cultură - baze teoretice şi practice. Editura Ceres, Bucureşti, 1987. Cachiţă-Cosma, Dorina, Petrescu C. - Curs practic de culturi de ţesuturi in vitro cu aplicaţii în legumicultură şi floricultură. I.A.N.B., Atelierul de multiplicat cursuri, Bucureşti, 1985. Caplin S.M. & Steward F.C. – Effect of coconut milk on the growth of explants from carrot root. Science 108, 688-657, 1948 Capuano G., Piccioni E., Standardi A. – Effect of different treatments on the conversion of M.26 apple rootstock synthetic seeds obtained from encapsulated apical and axillary micropropagated buds. Journal of Horticulture Science and Biotechnology, 73 (3), 299-305, 1998 Carswell G.K. & Locy R.D. – Root and shoot initiation by leaf, stem and storage root explants of Sweet potato. Plant Cell Tiss. Organ Cult.3, 299-236, 1984 Cepoiu, N.; Stănică, FI.; Dumitraş, D.; Ioniţă-Mânzatu, Mirela; Mihăila, Mariana; Cornea, Cornelia - Carbon Dioxide Laser, as work technique in fruit tree biotechnology poster. 2nd International Symposium Biotehnos, "Biotechnology now& tomorow" Lucrări, Volumul II, SP III, 1 pag., 29-30 septembrie, Bucureşti 1994. Chin C.K., Haas J.C. & Still C.C. – Growth and sugar uptake of excised root and callus of tomato. Plant Sci. Lett. 21, 229-234, 1981 Crisp P. & Walkey D.G.A. – The use od aseptic meristem culture in cauliflower breeding. Euphytica 23, 305-313, 1974
240
Crocomoco O.J., Sharp W.R. & Peters J.E. – Plant morphogenesis and the control of callus growth and root induction of Phaseolus vulgaris with the addition of bean seed extract. Z. Pflanzenphysiol. 78, 456-460, 1976 Cupidi, A., Barba, M. - Produzione di materiale virus-essente esperienze di microinnesto in vitro. Frutticoltura 5, p: 25-28, 1988. Diaconescu Oana - Studiul influenţei factorilor ecologici şi a tehnologiei de cultură asupra calităţii andivelor, Lucrare de dizertaţie, U.S.A.M.V.B., Facultatea de Horticultură, 2002 Diaconescu Oana, - The influence of culture medium on in vitro clonal regeneration on witloof chicory (Cichorium intybus L.), Lucrări ştiinţifice U.S.A.M.V.B. Seria B, vol. XLVI, 2003 Diaconescu Oana, Petrescu C. - Influenţa mediului de cultură asupra ratei de multiplicare in vitro la cicoare (Cichorium intybus L.). Sesiunea ştiinţifică a Facultăţii de Horticultură, Iaşi, 2003 Diaconescu Oana, Petrescu C. - Research regarding the in vitro germination of some chicory hybrids (Cichorium intybus L.), Lucrări ştiinţifice U.S.A.M.V.B. Seria B, vol. XLV, 2002 Dietert M.F., Barron S.A. & Yoder O.C. – Effects of genotype on in vitro culture in the genus Brassica. Plant Sci. Lett. 26, 233-240, 1982 Dodds J.H. & Roberts L.W. – Experiments in plant tissue culture. Cambridge University Press, Cambridge, London, New York, 1982 Doerschung M.R. & Miller C.O. – Chemical control of adventious organ formation in Lactuca sativa explants. Am. J. Bot. 54, 410-413, 1967 Doré C. – Production de plantes homoyigotes mâles et jemelles à partir d’anthère d’asperge, cultivées in vitro (Asparagus officinalis). Compt. Rend. Acad. Sci. Paris 278D, 21352138, 1974 Dumas De Vaulx R., Chambonnet D. & Pochard E. – Culture in vitro d’anthère de piment (Capsicum annuum L.) : amélioration des taux d’obtention de plantes chez différents génotipes des traitments à +35°C. Agronomie 1, 859-864, 1981 Dumitraşcu, Monica; Stănică, Fl.; Ion, Ligia. - Cercetări privind stabilirea protocolului de înmulţire in vitro a embrionilor imaturi la hibrizi interspecifici din genul Prunus. Lucrările celui de-al VII-lea Simpozion Naţional de Culturi de Ţesuturi şi Celule Vegetale, 58-62, Arad, 1997.
241
Dunstan D.I. & Short K.C. – In vitro studies on organogenesis and growth in Allium cepa tissue cultures. Acta Hort. 78, 139-148, 1977b Eenik A.H. – Preliminary results of research on storage and in vitro germination of lettuce pollen as an aid in lettuce breeding. Euphytica 32, 521-526, 1983 Elliot R.F. – Growth of excised meristem-tips of Rumara, Ipomoea batatas (Linn.) Poir in axenic culture N.Z.J. Bot. 7, 158-166, 1969 Enescu, V., Ioniţă, Lucia, Palada-Nicolau, Magdalena - Înmulţirea vegetativă a arborilor forestieri. Editura Ceres, Bucureşti, 1994. Engler D.E. & Grogan R.G. – Isolation, culture and regeneration of lettuce leaf mesophyll protoplasts. Plant Sci. Lett. 28, 223-229, 1983 Falcinelli M., Standardi A., Piccioni E. – Il seme sintetico nelle piante agrarie: stato attuale della ricerca. Riv. Sementi elette, XLII, nr. 1, 1997 Famiani, F., Ferradini, N., Standardi, A., Hoza, D. and Stănică, Fl. - In vitro regeneration of different Actinidia species Acta Horticulturae No. 444, ISBN 9066058099 pp 133-138, 1997 Famiani, F.; Ferradini, N.; Hoza, D.; Standardi, A.; Stănică, Fl. - In vitro regeneration of different Actinidia species. Proceedings of the III-Rd International Symposium on Kiwifruit, Tessaloniki, 19-22 September 1995. Ferradini, Nicoletta; Famiani, F.; Proietti, P.; Stănică, Fl. - Influence of growth regulators and light on in vitro regeneration in M.26 apple rootstock. Journal of Horticultural Science 71 (5), 859-865, 1996. Fridborg G., Pedersen M., Landstrom M. & Eriksson T. – The effect of inhibiting morphogenesis. Physiol. Plant. 43, 104-106, 1978 Fukami T. & Hildebrandt A.C. – Growth and chlorophyll formation in edible green plant callus tissues in vitro on media with limitated sugar supplements. Bot. Mag.: Tokyo 80, 199-212, 1967 Gâlă Ruxandra, Stănică Fl., Diaconescu Oana - Cercetări privind iniţierea culturii in vitro de Clematis vitalba, Lucrări ştiinţifice, Facultatea de Horticultură, UŞAMV Iaşi, 2003 Gâlă Ruxandra, Velcea M., Stănică Fl., Diaconescu Oana - Influenţa apei Pi asupra înmulţirii in vitro a smochinului (Ficus carica L.), Simpozionul internaţional „Apa un miracol” Ediţia a III a, Bucureşti 25-26 iunie, pp. 24-25, 2003 Gamborg O.L., Philips G.C. – Plant Cell, Tissue and Organ Culture – fundamental methods. Springer-Verlag, Berlin Heidelberg, 1995
242
Gardi T., Piccioni E., Standardi A. - Effect of bead nutrient composition on regrowth of stored vitro-derived
encapsulated
microcutting
of
diferent
woody
species,
J.
Microencapsulation, vol. 16, nr. 1, 13-25, 1999; Gavinlertvatana P. & Li P.H. – The influence of 2,4 D and kinetin on leaf callus formation in different potato species. Potato Res. 23, 115-120 George E.F., Puttock D.J.M., George H.J – Plant Culture Media: Vol 1, Formulation and uses. Exegetics Limited, Edington, 1987 George L. & Narayanaswamy S. – Haploid Capsicum through experimental androgenesis. Protoplasma 78, 467-470, 1973 Gleddie S., Keller W. & Setterfield G. – In vitro morphogenesis from tissue, cells and protoplasts of Solanum melongena L. Pp 139-140 in Fujiwara (ed), 1982 Goodwin P.B. – An improved medium for the rapid growth of isolated potato buds. J. Exp. Bot 17, 590-595, 1966 Gresshoff P.M. & Doy C.H. – Development and differentiation of haploid Lycopersicon esculentum (Tomato). Planta 107, 161-170, 1972b. Griga M., Tejklova E., Novak F.J. & Kubalakova M. – In vitro clonal propagation of Pisum sativum L. Plant Cell Tiss. Organ Cult. 6, 95-104, 1986 Grigore, Ana; Stănică, Fl. - Stabilirea metodologiei de microînmulţire a unor specii şi hibrizi din genul Actinidia. Simpozionul omagial dedicat semicentenarului Universităţii de Ştiinţe Agricole a Banatului din Timişoara, 1-3 iunie 1995. Groza, Ioana, Stănică, Fl. - In vitro propagation of BA 29 quince rootstock, Abstracts 4th International Symposium Biotehnos, Biotechnology now&tomorow, Bucureşti, 26-27 Sept, SP 48/130, pp XLVIII-XLIX, 1996. Groza Ioana Camelia, - Baby plant, o nouă modalitate de promovare a culturilor in vitro la plantele horticole. Lucrare de diplomă, UŞAMV Bucureşti, Facultatea de Horticultură, 2004. Guha S. & Johri B.M. – In vitro development of ovary and ovule of Allium cepa L. Phytomorph. 16, 353-364, 1966 Gunay A.L. & Rao P.S. – In vitro plant regeneration from hypocotyls and cotyledon explants of red pepper. Plant Sci. Lett. 11, 365-372, 1978 Gunay A.L. & Rao P.S. – In vitro propagation of hybrid tomato plants (Licopersicon esculentum) using hypocotyls and cotyledon explants. Ann. Bot. 45, 205-207, 1980 Halperin W. – Alternative morphogenetic events in cell suspesions. Am.J. Bot. 53, 443-453, 1966 243
Halperin W. & Wetherell D.F. – Ammonium requirement for embryogenesis in vitro. Nature 205, 519-520, 1965 Handley L.W. & Chambliss O.L. – In vitro propagation of Ciucumis sativus L. HortScience 14, 22-23, 1979 Hari V. – Effect of cell density changes and conditioned media on carrot cell embryogenesis. Z. Pflanzenphysiol. 96, 227-231, 1980 Havel L. & Novak F.J. – Meristem tip culture of Allium cepa L. Scientia HOrt. 27, 209, 214, 1985 Herman E.B. & Haas G.J. – Clonal propagation of Coffea Arabica L. from callus culture. HortScience 10, 588-589, 1978 Hoza, D. - Culturi in vitro cu aplicaţii în pomicultură. UŞAMV, Atelierul de multiplicat cursuri, Bucureşti, 1996. Hoza, D.; Standardi, A; Stănică,. Fl.; Tudor, T.A. - Date preliminare privind cultura in vitro a nucului (Juglans regia). Lucrări ştiinţifice USAB, seria B, vol. XXXV, 51-56, 1992. Hunault G. – Obtention de nouvelle souches de tissues à partir de diverse espèces de Liliacées. Compt. Rend. Acad. Sci., Paris 283D, 1401-1404, 1976 Hussey G. & Stacey N.J. – In vitro propagation of potato (Solanum tuberosum L.) Ann. Bot. 48, 787-796, 1981 Ion, Ligia; Stănică, Fl.; Dumitraşcu, Monica; Peticilă, A. - Cercetări privind cultura in vitro a unor embrioni imaturi din genul Prunus. Sesiunea ştiinţifică anuală a cadrelor didactice şi studenţilor, Bucureşti, 11 decembrie 1997. Iordan M., Roşu Ana, Enescu V., Brezeanu A., Grigorescu A., Coman I. (1983) "Regenerarea de plante prin cultura in vitro la Quercus". În:Lucr. II-lea Simp. Naţ. Cult. Ţes. Veg.. Piteşti, p.10-26. Isouard G., Raquin C. & Demarly Y. – Obtention de plantes haploids par culture in vitro d’anthères d’Aubergine (Solanum melongena L.). Compt. Rend. Acad. Sci., Paris 288D, 987-989, 1979 Jarret R.L., Hasegawa P.M. & Erickson H.T. – Factors affecting shoot initiation from tuber discs of potato (Solanum tuberosum). Physiol. Plant. 49, 177-184, 1980 B Jelaska S. – Embroyd formation by fragments of cotyledons and hypocotyls in Cucurbita pepo. Planta 103, 278-280, 1972 Johri B.M. & Guha S. - In vitro development of onion plants from flowers. Pp 215-223 in Maheswari & Ranga Swamy (eds.), 1963 Kartha K.K. – Meristem culture. Pp 19-24 in Wetter and Costabel (eds.), 1982 244
Kartha K.K., Gamborg O.L. & Constable F. – Regeneration of pea (Pisum sativum) plants from shoot apical meristems. Z. Pflanzenphysiol. 72, 172-176, 1974b Koevary K., Rappaport L. &Morris L.L. – Tissue culture propagation of head lettuce. HortScience 13, 39-41, 1978 Lakon, G.- Tho topografical tetrasolium method for determined the germinating capacity of seeds. Plant Phys., 24. p:389-994, 1949. Lamport D.T.A. – Cell suspension cultures of higher plants: isolation and growth energetics. Exp. Cell Res. 33, 195-206, 1964 Lazarte J.E. & Sasser C.C. – Asexual embryogenesis and plantlet development in anther culture of Cucumis sativus HortScience 17, 88, 1982 Leelavahti S., Reddy V.S. & Sen S.K. – Somatic cell genetic studies in Brassica sp. I High Frequency production of haploid plants in Brassica alba (L.) H.f. & T. Plant Cell Rep. 3, 102-105, 1984 Marani F. & Pisi A. – Meristem-tip culture and vegetative propagation in potato. Acta Hort. 78, 415-422, 1977 Morel G. & Martin C. – Curing potatoes infected with vitus. C.R. hebd. Séance. Acad. Agric. Fr. 41, 472-473, 1955 Murashige, T. - A technique of shoot apex grafting and its utilization toward recovering virus citrus clones. Hortic. Science 7, p:118-119, 1972 Neculae Luminiţa, Teodorescu A. – Rezultate privind microînmulţirea portaltoiului de măr MM 106 în condiţii diferite de iluminare. Abstracts 3rd International Symposium Biotehnos, “Biotechnology now & tomorrow” 19-20 octombrie, B 12, Bucureşti, 1995 Neri, D.- Tecniche da innesto con materiale proveniente da colture in vitro. Frutticoltura 3, p: 69-72, 1990. Nielsen L.V. – In vitro bulbet formation from leaf segments of lilies, especially Lilium rubellum. Scientia Hort. 11, 379-390, 1960 Pelletier G., Raquin C. & Simon G. – La culure in vitro d’anthères d’Asperge (Asparagus officinalis). Compt. Rend. Acad. Sci., Paris 274D, 848-851, 1972 Pence V.C. & Caruso J.L. – Effects of IAA and four IAA conjugates on morphogenesis and callus growth from tomato leaf discs. Plant Cell Tiss. Organ Cult. 3, 101-110, 1984 Piccioni E., Standardi A., Ţuţuianu V.C. – Storage of M 26 apple rootstock encapsulates microcuttings. Adv. HortScience, 10, 185-190, 1996 Pierik R.L.M. – In vitro culture of higher plants – Martinus Nijhoff Publishers, Dordrecht, 1987 245
Pink D.A.C. & Walkey D.G.A. – Rapid propagation of Cucurbita pepo L. by culture of meristem tips. Scientia Hort. 24, 107-114, 1984 Pliego-Alfaro, F., Murashighe, T.- Possible rejuvenation of adult avocado by greffage onto juvenile roctstock in vitro. Hortscience, Vol.22 (6),p: 1321-1324, 1987. Quoirin M., Lepoivre P. – Etudes de milieux adaptes aux cultures in vitro de Prunus. Acta Horticulturae, 78: 437-442. 1977 Raicu Petre, Badea, Elena Marcela - Cultura de celule şi biotehnologiile moderne. Editura Ştiinţifică şi Enciclopedică, Bucureşti, 1986. Raicu Petre şi colab. - Culturi de celule şi ţesuturi vegetale – aplicaţii în agricultură, Ed. Ceres, Bucureşti, 1984; Resende R.O. & Paiva M. – Eradication of potato viruses X and S by meristem-tip culture. hortScience 20, 525, 1985 Reuther G. – Chapter 8 – Asparagus. Pp 211-242 in Sharp et al (eds.), 1984 Roşu Ana - An efficient method for rooting of in vitro propagated roses-XXV-th Annual Meeting of ESNA, Piacenza, Italy, 1995 Roşu Ana - Elemente de biotehnologii vegetale – aplicaţii în ameliorare, Ed. Ametist 92, Bucureşti, 1999 Roşu Ana, Brezeanu A., Iordan M. - Micropropagation in Vitis vinifera L. III: Studies regarding in vitro stimulation of multiple axillary shoot development in some grapevine cultivars for clonal multiplication. Rev. Roum. Biol., Biol. veg., 28 (2)., 1983 Roşu Ana, Grigorescu A. -Multiplicarea clonală prin tehnicile de culturi de ţesuturi la Paulownia tomentosa. Studii Cerc.Biol., Biol. Veg., 1, 1984 Roşu Ana, Indreaş A., Sfetcu D. (1992) - A method of in vitro rescue of hybrid embryos from crosses between seeded x seedless table varieties in grapevine (Vitis vinifera L.). Abstract published in: Proceed. of NATO ASI Seminar Plant MorphogenesisMolecular Approaches, Heraclio, Crete., 1992 Roşu Ana, Iordan M., Brezeanu A., Volosciuc E. - Cercetări privind utilizarea calusului de Daucus carota în scopul obţinerii de produşi secundari de importanţă farmaceutică. Studii şi Cercetări de Biologie, Biol. Veget. 34 (1)., 1982 Roşu Ana, Skirvin R. M., Bein A., Norton M.A., Kushad M., Otterba Cher A.G. - The development of putative adventitious shoots from a chimeral thornless rose (Rosa multiflora) in vitro. Journal of Horticultural Science (1995) 70 (6), 1995
246
Roşu Ana, Skirvin R.M. - In vitro culture of plant chimeras. Implications in horticulture Book of Abstract - XXIV.th Annual Meeting of ESNA, Varna, Bulgaria , 1994 Roşu, Ana – Elemente de biotehnologii vegetale-aplicaţii în ameliorare. Editura Ametist 92, Bucureşti, 1999. Săvulescu, Anca, Buliga, A., Stănică Fl. - Influence of X structured waters on in vitro organogenesis of apple varieties and mother plant, Abstracts 4th International Symposium Biotehnos, Biotechnology now&tomorow, Bucureşti 26-27 Sept., B2, 3/7, pp XII, 1996 Smith R.H. & Murashige T. – In vitro development of the isolated shoot apical meristems of angiosperms. Am.J.Bot. 57, 5623-568, 1970 Sopory S.K. & Tan B.H. – Regeneration and cytological studies and anther and pollen calli of dihaploid of Solanum tuberosum. Z. Pflanzenzücht. 82, 31-35, 1979 Standardi A., Micheli M., Piccioni E. – Propagazione in vitro dell’olivo: acquisizioni e prospettive. Riv. Frutticoltura Nr. 7/8, 1998 Standardi A., Piccioni E. - Recent perspectives on synthetic seed technology using nonembryogenanic în vitro-derived explants, Int. J. Plant Sci. 159(6):968-978, 1998 Standardi A., Piccioni E. - Rooting induction în encapsulated buds of M.26 apple rootstock for synthetic seed, biology of root formation and development, Plenum press, New York, 1997; Stănică Fl. – Microînmulţirea plantelor horticole şi alte tehnici de cultură in vitro. Editura Grand, Bucureşti, 1999 Stănică Fl., Armeanu Ileana - Influence quantification of some factors implied in the kiwifruit in vitro organogenesis Scientifical Papers UŞAMV Bucureşti, Serie B, Vol. XLVII, ISBN 973-7753-04-6, Invel Multimedia, 2004 Stănică Fl., Dumitraşcu M., Davidescu V., Madjar R., Peticilă A. - Înmulţirea plantelor horticole lemnoase, Format electronic, Editura Invel Multimedia, Bucureşti, ISBN 973-86341-4-8, 2003 Stănică Fl., Dumitraşcu M., Davidescu V., Madjar R., Peticilă A. - Înmulţirea plantelor horticole lemnoase, Editura Ceres, Bucureşti, ISBN 973-40-0558-8, 431 pg., 2002 Stănică Fl., Gâlă Ruxandra, Diaconescu Oana - Cercetări privind înmulţirea in vitro a smochinului (Ficus carica L.), Lucrări ştiinţifice, Facultatea de Horticultură, UŞAMV Iaşi, 2003
247
Stănică Fl., Gâlă Ruxandra, Velcea M., Diaconescu Oana - Rezultate preliminare privind folosirea apei Pi la microînmulţirea in vitro a unor soiuri de măr - Simpozionul Internaţional Apa un miracol Ediţia a II a, Bucureşti, 25-26.06, pp. 12 , 2002 Stănică Fl.; Hoza, D.; Lăzureanu, C. - The micro-grafting of fruit-growing plants (Microaltoirea plantelor pomicole). Bioterra 1: 33-38, Bulletin of Scientific Information, Athenaeum Academic University, Faculty of Horticultural. Sciences and Bioengineering, Bucureşti, 1992. Stănică, Fl. - Organogenesis via callus in kiwifruit hybrid plants (Actinidia deliciosa Chev. x Actinidia arguta Sieb. e Zucch.). European Society for New Methods in Agricultural Research (ESNA) XXVIII-th Annual Meeting, WG. 4, 151, Brno, 25-29 august, 1998. Stănică, Fl. – Rezultate preliminare privind microînmulţirea in vitro a curmalului chinezesc (Ziziphus jujuba Mill.). Lucrările Simpozionului "Horticultura Clujeană XX", ClujNapoca, 236-238, 19-20 iunie 1997. Stănică, Fl., Cepoiu N., Standardi A., Zuccherelli G.- Aspects of in vitro organogenesis in Actinidia
plants.
2nd
International
Symposium
Biotehnos,
"Biotechnology
now&tomorow", Lucrări, Volumul I, B10, 13 pag., 29-30 septembrie, Bucureşti 1994. Stănică, Fl.; Cepoiu, N.; Dumitraşcu, Monica - Double layer and culture medium composition on in vitro propagation of BA 29 and EM-C quince rootstocks. European Society for New Methods in Agricultural Research (ESNA) XXVI-th Annual Meeting, 145, 12-16 septembrie, Buşteni, 1996. Stănică, Fl.; Groza, Ioana; Cepoiu, N.; Standardi, A. - Influence of inductive factors on M.26 apple rootstocks organogenesis from leaf blade. Abstracts 3rd International Symposium Biotehnos, "Biotechnology now & tomorow" 19-20 octombrie, B 11, Bucureşti, 1995. Stănică, Fl.; Hoza, D.; Cepoiu, N. - Organogeneza in vitro la plantele hibride de kiwi (Actinidia deliciosa Chev. x Actinidia arguta Sieb. e Zuch.). Lucrările Simpozionului omagial dedicat semicentenarului Universităţii de Ştiinţe Agricole a Banatului din Timişoara, 1-3 iunie 1995. Stănică, Fl.; Standardi, A; Hoza, D.; Tudor, T.A. - Cercetări privind microînmulţirea dafinului (Laurus nobilis L.). Lucrări ştiinţifice USAB, seria B, vol. XXXV, 83-90, 1992. Teodorescu A., Neculae Luminiţa – Cercetări pentru stabilirea biotehnologiilor de înmulţire a unor specii pomicole şi dendrologice şi stadiul aplicării acestora în producţie. 2nd International Symposium Biotehnos, “Biotechnology now & tomorrow”, Lucrări, Vol. I, B10, 13 pag., 29-30 sept., Bucureşti, 1994 248
Teodorescu A., Neculae Luminiţa – Rezultate privind înrădăcinarea în condiţii septice a minibutaşilor unor specii horticole înmulţite in vitro. Abstracts 4th International Symposium Biotehnos, Biotechnology now & tomorrow”, 26-27 sept., SP 50, Bucureşti, 1996 Walkey D.G.A., Neeley H.A. & Crisp P. – Rapid propagation of whitw cabbage by tissue culture. Scientia Hort. 12, 99-107, 1980 Yan R.L., G.R. Liu, L. Zhang, Z.X. Wang, E.Q. Yang, - Effect of exogenous plant hormones on rapid multiplication of Ziziphus jujuba test-tube plants, Journal of Fruit Science, 7, 4, 231-233, 1990. Yang H.J. & Clore W.J. – Obtaining virus-free plants from Asparagus officinalis L. by culturing shoot tips and apical meristems. HortScience 11, 474-475, 1976. Zucherelli G.- Metodologie nelle moltiplicazione, industriale in vitro dei portinnesti clonali del pesco. Pescomandorlo GF 677, Susino GF 43, Damasco 1869, San Giuliene 655/2. Atti Convegno “Tecniche di coltura in vitro per la propagazione su vasta scala delle specie ortoflorofrutticole” p: 147-154, 1979. Zucherelli G.- Moltiplicazione in vitro di cinque varieta di nocciolo e loro micorizazione con Tuber melanosporum. L’Informatore Agrario, Verona, XLVI (41), 1990 Zucherelli G., Capaccio V. – Micorrizazione del castagno con simbionti a carpoforo edule. Pianfei-Cuneo, 9 novembre 1990 Zucherelli G., Zucherelli S., Capaccio V. – Production in vitro of two hazelnut varieties and results about inoculum of Tuber magnatum pico on a mass scale. Acta Horticulture 351 *** - Colecţia revistei Frutticoltura. Edagricole, Bologna, 1990-1995 *** - Colecţia revistei Plant Cell Tissue and Organ Culture, Martinus Nijhoff Publishers, 1990-1997 *** - Sigma Plant Culture Catalg, 1994 *** - Tehnici moderne de producere a materialului săditor pomicol. I.C.P.P. Mărăcineni, Piteşti 1983 *** Abstracts VIIth International Congress on Plant Tissue and Cell Culture – Amsterdam, June 24-29 1990.
249
Editură de Carte Electronică
din cadrul SC MAVI SERPICO TRADE SRL str. Belizarie nr 1, bl. 21/5, sc. 1, ap. 2, sector 1 - Bucureşti, PO Box 63-110 tel.: 0723.20.50.48; fax: 021/430.35.42; e-mail:
[email protected] ing. Florin STĂNICĂ
OFERTĂ SPECIALĂ
Avem tehnologia ... dar şi uneltele, pentru a vă oferi:
GRATUIT
♦carte electronică ♦CD personalizat ♦CD multimedia ♦paper to digital text ♦desen proiectiv digital 2D ♦CD film ♦DTP ♦consultanţă birotică/office/IT
în primul trimestru al anului 2005 prelucrăm teze de doctorat în format electronic
Cercetări experimentale privind fertilizarea în livezi TEZĂ DE DOCTORAT Coordonator ştiinţific Acad. David DAVIDESCU 1996
Evaluarea maşinilor şi echipamentelor American Society of Appraisers
CD carte
CD carte
CD carte
CD carte
CD carte
2 CD carte + film
2 CD carte + film
CD film
CD film
MINISTRY OF EDUCATION AND RESEARCH UNIVERSITY OF AGRICULTURAL SCIENCES AND VETERINARY MEDICINE BUCHAREST
SCIENTIFICALLY PAPERS SERIA B - XLV - 2002 SERIA B - XLVI - 2003
HORTICULTURE CD curs universitar CD lucrări ştiinţifice CD colecţie reviste
CD film
CD film
CD film
ISBN 973-7753-07-0
