Yayit Trigiantoro 240210080042 PEMBAHASAN
Praktikum kali ini, praktikan memepelajari cara-cara mengisolasi berbagai jenis mikroorganisme, memeliharanya dalam kultur padat dan cair, serta mengamati bentuknya. 1. Isolasi Bakteri, Kapang dan Khamir
Pada praktikum ini, setiap kelompok praktikan diharuskan membawa berbagai sampel makanan untuk digunakan sebagai substrat pertumbuhan mikroorganisme. Selain itu, perlu disiapkan pula cawan-cawan petri yang berisi berbagai media pertumbuhan mikroorganisme, antara lain, EMB ( Eosin Methylene Blue Agar ) untuk pertumbuhan bakteri, PDA ( Potato Dextrose Agar ) untuk pertumbuhan kapang dan khamir, serta NA ( Nutrient Agar ) untuk
pertumbuhan bakteri. Sampel yang digunakan oleh kelompok kami adalah sejenis biskuit. Biskuit merupakan bahan makanan yang kaya akan karbohidrat, sehingga memudahkan
mikroorganisme
tumbuh
karena
kandungan
karbonnya
digunakan sebagai sumber energi bagi mikroorganisme. Sebelumnya, sampel tersebut harus disuspensikan dalam larutan NaCl fisiologis yang berkadar 85%. Setelah terbentuk suspensi maka dilakukan pengenceran sampai tahap -4
10 . Pengenceran dilakukan agar pertumbuhan mikroorganisme pada sampel tidak terlalu banyak sehingga dapat dilakukan penghitungan. NaCl fisiologis digunakan sebagai pengencer agar suspensi sampel tetap steril dan menghindari adanya kontaminan pada sampel. Selain itu, NaCl fisiologis juga dapat mempertahankan kondisi pH. Sebagaimana kita ketahui bahwa pertumbuhan mikroorganisme sangat peka terhadap perubahan pH, sehingga diperlukan suatu larutan pengencer yang tidak mempengaruhi kondisi pH.
Yayit Trigiantoro 240210080042 Setelah pengenceran selesai dibuat maka dimulailah proses isolasi bakteri, kapang dan khamir yang meliputi dua metode yaitu metode gores untuk PDA dan EMB serta metode agar tuang untuk NA. Metode gores dilakukan dengan cara menggoreskan ose yang telah dicelupkan dengan sampel pada media pertumbuhan PDA dan EMB. Teknik penggoresan meliputi tiga cara yaitu goresan langsung, kuadran dan radian. Sampel yang -1
digunakan untuk menggores adalah sampel dengan pengenceran 10 . Setelah dilakukan penggoresan maka cawan petri tersebut diinkubasi dengan posisis terbalik (untuk mencegah agar uap air tidak merusak sampel dan media) pada o
suhu 30-32 C selama 2 hari. Dengan adanya inkubasi pada kondisi yang baik untuk pertumbuhan mikroorganisme, maka pertumbuhan mikroorganisme tersebut dapat lebih mudah dan lebih cepat untuk tumbuh. Selain dilakukan metode gores, dilakukan juga metode lainnya yaitu metode agar tuang. Pada metode ini, sampel yang telah diencerkan langsung dituang pada cawan petri berisi media pertumbuhan, kemudian digoyangkan supaya rata lalu diinkubasi. Pada praktikum ini digunakan dua sampel pengenceran yang berbeda yaitu pengenceran 10
-3
dan 10
-4
pada dua cawan
petri. Setelah sampel-sampel tersebut diinkubasi dapat terlihat adanya pertumbuhan mikroorganisme yang dicirikan dengan adanya koloni-koloni mikroorganisme. Pada metode gores langsung (media EMB), terlihat adanya pertumbuhan dua (2) koloni bakteri. Koloni bakteri tersebut berwarna gelap ditengahnya dan dapat diidentifikasi bahwa bakteri tersebut adalah bakteri jenis Salmonella. Salmonella adalah jenis bakteri enteric pathogens yang dapat menyebabkan infeksi pada usus ( gastrointestinal infection). Pada metode gores kuadran (media PDA), terlihat pertumbuhan khamir yang sangat banyak. Pertumbuhannya menyebar dan berwarna putih. Tetapi ditemukan pula satu koloni Aspergillus niger yang
merupakan
kontaminan. Kontaminan tersebut dapat disebabkan karena praktikan yang kurang menjaga tingkat kehigienisan saat bekerja. Sehingga perlu diingat,
Yayit Trigiantoro 240210080042 pelaksanaan praktikum harus selalu menggunakan masker, sarung tangan dan selalu bekerja dekat api (bunsen) agar terhindar dari kontaminan. Koloni Aspergillus niger telihat dengan adanya koloni berwarna putih dengan bagian
tengah berwarna hitam. Pada bahan makanan, Aspergillus niger memproduksi asam sitrat, asam glukonat dan enzim amilase dan pektinase, juga dapat merusak apel, jeruk, dan bawang. Metode gores terakhir yaitu metode radian (media PDA), ditemukan koloni kapang yang berjumlah 5 (lima) buah. Koloni tersebut bervariasi bentuknya dari kecil sampai besar. Sedangkan pada metode agar tuang (media NA) ditemukan pula hasil -3
yang berbeda. Untuk sampel dengan pengenceran 10 , ditemukan adanya koloni bakteri sebanyak 8 (delapan) koloni dan untuk sampel dengan -4
pengenceran 10 , ditemukan jumlah koloni yang lebih sedikit yaitu hanya 3 (tiga) buah koloni saja. Jumlah bakteri dalam tiap cawan petri dapat dihitung, baik itu pada metode gores maupun metode tuang. Untuk metode gores dilakukan penghitungan menggunakan rumus:
Dengan menggunakan rumus tersebut, maka jumlah mikroorganisme pada metode gores dapat dihitung dan hasilnya terlihat pada tabel berikut. Metode Gores Goresan langsung Goresan kuadran Goresan radian
Jumlah Koloni 2 Sangat banyak (TBUD) 5
Jumlah sel per ml per g 1 2×10 1 5×10
Pada goresan kuadran, pertumbuhan khamir sangat banyak sehingga hasilnya sulit untuk dihitung. Hal tersebut dikenal dengan TBUD (Tidak Bisa Untuk Dihitung).
Yayit Trigiantoro 240210080042 Pada metode agar tuang, seperti halnya pada metode gores, dapat pula dilakukan penghitungan dengan menggunakan rumus diatas tetapi hasil hasil akhirnya dijumlahkan dan dibagi dengan banyaknya pengeceran yang dilakukan. Penghitungannya adalah sebagai berikut. Untuk pengenceran 10
-3
Untuk pengenceran 10
-4
Hasil yang didapat kemudian dijumlahkan sehingga hasilnya adalah:
Jumlah perhitungan tersebut kemudian dibagi dua, sesuai dengan banyaknya pengenceran yang dilakukan sehingga jumlah sel per ml per g-nya adalah:
Yayit Trigiantoro 240210080042 Pada akhir praktikum dilakukan pewarnaan gram terhadap bakteri yang tumbuh dalam cawan petri. Bakteri tersebut diisolasi menggunakan -4
metode agar tuang (media NA) dengan pengenceran 10 . Setelah dibuat preparatnya kemudian diberi pewarna berturut-turut antara lain larutan kristal violet, lugol, alkohol 95% dan terakhir adalah safranin. Lalu sampel yang telah diberi pewarna tersebut diamati dibawah mikroskop. Sampel terlihat jelas pada perbesaran 40x, dimana terlihat bakteri berbentuk bulat dan berwarna merah yang menunjukkan bakteri tersebut tergolong jenis bakteri gram negatif. Kemungkinan bakteri tersebut adalah Escherchia coli. 2. Pemeliharaan Kultur Cair
Media pertumbuhan yang digunakan dalam pemeliharaan kultur cair adalah LB ( Lactose Broth). Media ini berbeda dengan media yang lain karena tidak mengandung bahan pemadat (agar) sehingga bentuknya cair. Sampel yang digunakan adalah mikroorganisme yang tumbuh di media NA dengan -4
pengenceran 10 . Pemeliharaan pada kultur cair bertujuan untuk memisahkan pertumbuhan sel-sel mikroorganisme yang satu dan yang lainnya. Pertumbuhan mikroorganisme pada media cair dapat dilihat dari permukaannya, apakah bentuknya cincin, pelikel, flokulen atau membran. Setelah
dilakukan
inkubasi
selama
dua
hari,
maka
terlihat
adanya
pertumbuhan mikroorganisme yang diindikasikan dengan terbentuknya membran pada permukaan media dan kekeruhan pada media. Bentuk membran terlihat dengan adanya selaput yang menyelimuti permukaan media cair. Namun hasil inkubasi ini tidak dapat diamati lebih lanjut karena kesalahan praktikkan saat mengambil tabung reaksi dari inkubator. Tabung reaksi tersebut tergoyang sehingga membran yang terbentuk hancur sebelum diamati lebih lanjut. 3. Pemeliharaan Kultur Padat
Pemeliharaan kultur padat dilakukan pada media agar yaitu NA ( Nutrient Agar ). Media tersebut digunakan untuk pertumbuhan bakteri.
Yayit Trigiantoro 240210080042 Metode yang digunakan dalam pemeliharaan kultur padat mencakup dua metode, yaitu agar miring dan agar tegak. Penggunaan kedua
metode ini
didasarkan karena alasan aerasi. Kebutuhan oksigen berbeda-beda pada tiap mikroorganisme, ada mikroorganisme yang membutuhkan banyak oksigen saat proses pertumbuhannya, ada juga yang tidak. Agar miring digunakan untuk membiakkan mikroorganisme yang bersifat aerobik (contohnya, kapang, sebagian khamir, Salmonella, dan Pseodosomonas) dan mikroorganisme anaerobik fakultatif (bakteri asam
laktat, Staphylococcus, dan Bacillus sp) . Sedangkan agar tegak digunakan sebagai media pembiakkan mikroorganisme anaerobik misalnya, Bacteroides dan Clostridium.
Sampel yang digunakan adalah koloni yang tumbuh pada media NA dengan pengenceran 10
-4
dari praktikum sebelumnya. Untuk agar miring,
terdapat beberapa tipe pertumbuhan bakteri, yaitu filiform, ekinulat, beaded, efus, arboresen dan rhizoid. Setelah dilakukan inkubasi selama dua hari, didapat dua tipe pertumbuhan bakteri yaitu filiform dan arboresen. Bentuk filiform menunjukkan bahwa bakteri yang tumbuh adalah bakteri nonmotil (tidak memiliki alat gerak) sehingga koloninya hanya tumbuh pada satu garis lurus, tidak ada koloni menyamping. Sedangkan pada tipe arboresen, selain adanya pertumbuhan memanjang juga terlihat adanya pertumbuhan ke samping yang menyerupai serabut. Hal tersebut mengindikasikan bahwa bakteri yang tumbuh merupakan bakteri motil. Metode yang digunakan selanjutnya adalah metode agar tegak. Sampel yang digunakan sama yaitu koloni yang tumbuh pada media NA sebelumnya. Pada metode ini pertumbuhan bakteri dapat dilihat dari tipe petumbuhannya, yaitu filiform, beaded, papilat, arboresen dan vilous. Setelah diinkubasi didapat hasil pertumbuhan bakteri tipe filiform. Pertumbuhannya memanjang dan tidak ada pertumbuhan menyamping. Sama seperti pada metode agar miring, hal tersebut menunjukkan bahwa bakteri yang tumbuh adalah bakteri nonmotil.
Yayit Trigiantoro 240210080042 4. Pengamatan Bentuk Kapang
Pengamatan bentuk kapang dilakukan pada media PDA, yang dioles dengan kultur murni, yang dalam praktikum kali ini digunakan sampel kapang berjenis Rhizopus. Rhizopus bersifat mesofilik yaitu, tumbuh baik pada suhu kamar, antara 35-37 C. Rhizopus sering juga disebut sebagai kapang roti, karena menyebabkan kerusakan pada roti. Semua kapang bersifat aerobik dan tumbuh dengan baik pada kondisi asam atau pH rendah. Tak seperti bakteri dan khamir, kapang seringkali dapat terlihat dengan mata telanjang, karena adanya pertumbuhan miselium (serabut). Pada praktikum ini terdapat hasil yang menyimpang, yaitu setelah diamati dengan mikroskop tidak terlihat adanya pertumbuhan kapang. Seharusnya pertumbuhan kapang dapat terlihat dengan adanya pertumbuhan serabut pada PDA secara menyamping. Percobaan yang tidak berhasil tersebut bisa disebabkan karena penggunaan ose yang masih panas saat menggores atau kondisi yang kurang sesuai dengan pertumbuhan kapang misalnya kondisi cawan yang kurang lembab. Selain itu, praktikkan juga kurang memperhatikan ketelitian dalam bekerja, sehingga PDA yang digunakan tertekan sehingga menjadi hancur. 5. Pengamatan Bentuk Khamir
Khamir merupakan mikroba bersel tunggal yang berukuran 5-10 kali lebih besar dibandingkan dengan bakteri. Khamir dapat tumbuh baik dalam media padat maupun cair dengan cara yang sama seperti bakteri. Khamir merupakan organisme yang bersifat saprofit terutama pada daun, bunga, dan eksudat dari tanaman. Pada pengamatan ini, khamir yang diamati adalah khamir yang telah ditumbuhkan pada praktikum sebelumnya, yaitu pada media PDA menggunakan metode gores. Setelah diamati di bawah mikroskop terlihat bentuk khamir yang cukup jelas. Pada pembesaran 100x, terlihat bentuk khamir yang bulat dan ogival. Dua bentuk tersebut menunjukkan bahwa jenis khamir yang tumbuh berbeda. Bentuk khamir yang ogival lebih banyak dibandingkan bentuk bulat.
Yayit Trigiantoro 240210080042 Jenis khamir bulat kemungkinan adalah Saccharomyces, dan jenis khamir ogival adalah Candida.
Yayit Trigiantoro 240210080042 KESIMPULAN
Isolasi mikroorganisme pada berbagai media dilakukan untuk mengetahui jenis dan pertumbuhan bakteri dari suatu sampel. Metode yang digunakan dalam isolasi ini adalah metode agar tuang dan metode gores. Sebelumnya, sampel harus diencerkan agar pertumbuhan mikroorganisme tidak terlalu padat dan dapat dihitung. Metode
gores
kuadran
adalah
metode
yang
paling
banyak
tumbuh
mikroorganismenya. Perhitungan mikroorganisme dilakukan dengan metode hitung cawan. Pada media EMB dengan sampel biskuit ditemukan koloni dengan jenis bakteri Salmonella. Pada media PDA ditemukan koloni-koloni kapang dan khamir salah satunya adalah Aspergillus niger . Sedangkan pada media NA ditemukan kolonikoloni bakteri berwarna putih kekuningan. Pemeliharaan kultur cair bertujuan untuk memisahkan pertumbuhan sel-sel mikroorganisme yang satu dan yang lainnya. Media yang digunakan adalah LB. tipe pertumbuhan mikroorganisme yang terbentuk adalah tipe membran dengan adnaya selaput pada permukaan media. Pemeliharaan kultur padat mencakup dua metode yaitu agar miring dan agar tegak. Penggunaan kedua metode ini didasarkan karena alasan aerasi. Pada metode agar miring ditemukan tipe pertumbuhan bakteri filiform dan arboresen, sedangkan pada agar tegak ditemukan tipe pertumbuhan filiform. Pengematan bentuk kapang jenis Rhizopus tidak dapat dilakukan karena sampel tidak menunjukkan adanya pertumbuhan. Hal tersebut dikarenakan, media yang digunakan rusak, penggunaan ose yang panas dan kondisi yang kurang lembab. Pengamatan bentuk khamir dilakukan menggunakan mokroskop dengan perbesaran 40x. Terlihat adanya dua bentuk khanmir yaitu bulat dan ogival. Hal tersebut menunjukkan khamir yang tumbuh pada satu koloni dapat berbeda jenis.
Yayit Trigiantoro 240210080042 DAFTAR PUSTAKA
Balia, Roostita L.2009. Mikropangan02. Diakses di http://www.pdf4free.com pada tanggal 13 Maret 2009 Pukul 13.00 WIB Buckle, K. A., R. A. Edwards, G. H. Fleet, dan M. Wootton. 1987. Ilmu Pangan. Penerjemah : Hari Purnomo dan Adiono. Penerbit Universitas Indonesia ( UIPress) : Jakarta. Fardiaz, Srikandi. 1992. Mikrobiologi Pangan I . Gramedia Pustaka Utama : Jakarta Hadioetomo dan Ratna Siri. 1993. Mikrobiologi Dasar dalam Praktek . Gramedia : Jakarta Pelzcar, dan Chan. 1986. Dasar-dasar Mikrobiologi. Penerbit Universitas Indonesia ( UI-Press) : Jakarta.
Yayit Trigiantoro 240210080042 JAWABAN PERTANYAAN
1. Sebutkan kemungkinan jenis bakteri dan khamir sesuai dengan penglihatan di mikroskop (dilihat dari bentuk dan pewarnaan gram)! Jawab: -4
Bakteri dari media NA dengan sampel rendang pada pengenceran 10 , setelah diberi pewarnaan gram menunjukkan bahwa warna akhir dari bakteri itu adalah merah. Warna merah tersebut mengindikasikan bakteri tersebut termasuk jenis bakteri gram negatif. Bakteri gram negatif tersebut kemungkinan adalah Escherchia coli.
Bentuk khamir pada pengamatan praktikum ini meliputi dua tipe, yaitu bulat dan ogival. Jenis khamir bulat kemungkinan adalah Saccharomyces, dan jenis khamir ogival adalah Candida.
2. Mengapa pada bakteri harus dilakukan pewarnaan gram sebelum dilihat di bawah mikroskop? Jawab: Karena pewarnaan gram pada bakteri memiliki fungsi sebagai berikut.
Mengamati dengan lebih baik tampang morfologi bakteri.
Mengidentifikasi bagian-bagian struktural sel bakteri
Membantu mengidentifikasi dan/atau membedakan organisme yang serupa (bakteri gram positif atau negatif)
3. Sebutkan fungsi pewarna kristal violet dan safranin pada pewarnaan gram! Jawab: Fungsi pewarna kristal violet adalah sebagai pewarna dasar. Bakteri gram positif akan mempertahankan warna ungu sampai akhir prosedur pewarnaan. Fungsi safranin adalah sebagai pewarna akhir yang menentukan apakah bakteri tersebut tergolong bakteri gram negatif atau positif. Bakteri gram negatif akan
Yayit Trigiantoro 240210080042 melepas warna ungu (dari kristal violet) dan menyerap warna merah dari safranin sehingga warna akhir pada bakteri gram negatif adalah merah.
