Yusi Nurmayasari, S.Si
MODUL ANALISIS MIKROBIOLOGI
KELAS XI KIMIA ANALISIS
SMK BINA PUTERA NUSANTARA 0
DAFTAR ISI DEFINISI DAN SEJARAH MIKROBIOLOGI ........................................................................... 3 ANGGOTA DUNIA MIKROBA ............................................................................................. 7 BAB 1 MEDIA PERTUMBUHAN ..................................................................................... 13 BAB 2 STERILISASI......................................................................................................... 21 BAB 3 ISOLASI DAN INOKULASI MIKROORGANISME ................................................... 29 BAB 4 MORFOLOGI MIKROORGANISME ...................................................................... 36 BAB 5 PEMINDAHAN DAN PENGAWETAN MIKROORGANISME .................................. 58 BAB 6 PENGARUH LINGKUNGAN TERHADAP PERTUMBUHAN MIKROORGANISME ... 68 BAB 7 MENENTUKAN JUMLAH DAN UKURAN MIKROORGANISME ............................ 80 BAB 8 UJI REAKSI ENZIMATIS ....................................................................................... 95 BAB 9 ANALISA MIKROBA DALAM AIR ....................................................................... 108 BAB 10 ANALISA MIKROBA DALAM MAKANAN ........................................................... 115 BAB 11 DAYA KERJA ANTI MIKROBA ............................................................................. 125 BAB 12 MONITORING KESTERILAN ............................................................................... 134
1
KATA PENGANTAR
Puji syukur kami panjatkan ke hadirat Allah swt., karena atas ridha dan hidayahNya penulisan modul Analisis Mikrobiologi untuk SMK Bina Putera Nusantara ini dapat terselesaikan dengan baik. Tidak lupa kami ucapkan terima kasih kepada semua pihak yang telah membantu terlaksananya penulisan modul hingga dapat digunakan sebagai bahan ajar di jurusan Kimia Analisis SMK Bina Putera Nusantara Tasikmalaya. Modul ini kami susun dengan harapan dapat membantu siswa untuk memahami materi dasar mikrobiologi dan menguasai cara-cara untuk melaksanakan análisis dalam mikrobiologi. Penyajian materi modul ini disesuaikan dengan silabus pembelajaran sebagaimana tertuang dalam kurikulum SMK Bina Putera Nusantara. Semoga modul ini dapat memberi motivasi baru kepada peserta didik untuk belajar dengan lebih baik. Penulis menyadari bahwa penulisan modul ini masih jauh dari sempurna. Oleh karena itu kami mengharapkan kritik dan saran yang sifatnya membangun demi perbaikan modul ini di masa yang akan datang.
Tasikmalaya, Agustus 2010
Penyusun
2
Definisi & Sejarah Mikrobiologi Mikrobiologi
adalah
sebuah
cabang
dari
ilmu biologi yang
mempelajari organisme yang terlalu kecil untuk dapat dilihat dengan jelas menggunakan mata telanjang; kajian ini mencakup bakteri, archaea, protozoa, algae mikroskopik, dan fungi. Beberapa mikroba (seperti algae dan jamur) cukup besar untuk dapat dilihat dengan mata telanjang, namun kedua organisme masih dimasukkan dalam kajian mikrobiologi, hal ini karena teknik yang digunakan untuk mengkajinya (seperti isolasi, sterilisasi, kultivasi dalam media artifisial) sama seperti anggota
mikroorganisme
lainnya.
Virus sering
juga dimasukkan
walaupun
sebenarnya tidak sepenuhnya dapat dianggap sebagai makhluk hidup. Mikrobiologi adalah ilmu yang mempelajari mikroba. Mikrobiologi adalah salah satu cabang ilmu dari biologi, dan memerlukan ilmu pendukung kimia, fisika, dan biokimia. Mikrobiologi sering disebut ilmu praktek dari biokimia. Dalam mikrobiologi dasar diberikan pengertian dasar tentang sejarah penemuan mikroba, macam-macam mikroba di alam, struktur sel mikroba dan fungsinya, metabolisme mikroba secara umum, pertumbuhan mikroba dan faktor lingkungan, mikrobiologi terapan di bidang lingkungan dan pertanian. Mikrobiologi lanjut telah berkembang menjadi bermacammacam ilmu yaitu virologi, bakteriologi, mikologi, mikrobiologi pangan, mikrobiologi tanah, mikrobiologi industri, dan sebagainya yang mempelajari mikroba spesifik secara lebih rinci atau menurut kemanfaatannya. Whittaker membagi jasad hidup menjadi tiga tingkat perkembangan, yaitu: (1)Jasad prokariotik yaitu bakteri dan ganggang biru (Divisio Monera), (2) Jasad eukariotikuniseluler yaitu algae sel tunggal, khamir dan protozoa (Divisio Protista), dan (3) Jasadeukariotik multiseluler dan multinukleat yaitu Divisio Fungi, Divisio Plantae, dan DivisioAnimalia. Sedangkan Woese menggolongkan jasad hidup
3
terutama berdasarkansusunan kimia makromolekul yang terdapat di dalam sel. Pembagiannya yaitu terdiri Arkhaebacteria, Eukaryota (Protozoa, Fungi, Tumbuhan dan Binatang), dan Eubacteria.
Ciri Umum Mikroba Mikroba di alam secara umum berperanan sebagai produsen, konsumen, maupun redusen. Jasad produsen menghasilkan bahan organik dari bahan anorganik dengan energi sinar matahari. Mikroba yang berperanan sebagai produsen adalah algae dan bakteri fotosintetik. Jasad konsumen menggunakan bahan organik yang dihasilkan oleh produsen. Contoh mikroba konsumen adalah protozoa. Jasad redusen menguraikan bahan organik dan sisa-sisa jasad hidup yang mati menjadi unsur-unsur kimia (mineralisasi bahan organik), sehingga di alam terjadi siklus unsur-unsur kimia. Contoh mikroba redusen adalah bakteri dan jamur (fungi). Sel mikroba yang ukurannya sangat kecil ini merupakan satuan struktur biologi. Banyak mikroba yang terdiri dari satu sel saja (uniseluler), sehingga semua tugas kehidupannya dibebankan pada sel itu. Mikroba ada yang mempunyai banyak sel (multiseluler). Pada jasad multiseluler umumnya sudah terdapat pembagian tugas diantara sel atau kelompok selnya, walaupun organisasi selnya belum sempurna. Setelah ditemukan mikroskop elektron, dapat dilihat struktur halus di dalam sel hidup, sehingga diketahui menurut perkembangan selnya terdapat dua tipe jasad, yaitu: 1. Prokariota (jasad prokariotik/ primitif), yaitu jasad yang perkembangan selnya belum sempurna. 2. Eukariota (jasad eukariotik), yaitu jasad yang perkembangan selnya telah sempurna. Selain yang bersifat seluler, ada mikroba yang bersifat nonseluler, yaitu virus. Virus adalah jasad hidup yang bersifat parasit obligat, berukuran super kecil atau submikroskopik. Virus hanya dapat dilihat dengan mikroskop elektron. Struktur virus terutama terdiri dari bahan genetik. Virus bukan berbentuk sel dan tidak dapat membentuk energi sendiri serta tidak dapat berbiak tanpa menggunakan jasad hidup lain.
Sejarah Mikrobiologi 1626-1697
1713-1781
Francesco Redi, membantah konsep generasi spontan dengan menunjukkan bahwa belatung pada daging busuk berasal dari telur lalat yang meletakkan telur pada daging tersebut, bukan dari daging itu sendiri John Needham, mendukung teori generasi spontan dengan menunjukkan bahwa kaldu yang dipanaskan dalam labu dan kemudian ditutup masih dapat memunculkan mikroorganisme. 4
1729-1799
1822-1895
1820-1893
1773-1856 ± 1845 1822-1895 1872-1912
1843-1910
Lazzaro Spallanzani, menunjukkan bahwa labu yang ditutup dan kemudian dididihkan tidak ada mikroorganisme yang tumbuh, dan menyatakan bahwa udara yang masuk ke labu medium membawa benih, dan udara mungkin diperlukan untuk mendukung pertumbuhan organisme yang sudah ada di medium. Louis Pasteur, menjebak organisme yang terbawa udara dalam kapas, dia juga memanaskan leher labu angsa, mensteril meida, membiarkan labu terbuka; hasil percobaan menunjukkan tidak ada pertumbuhan organisme sebab partikel debu yang membawa organisme tidak mencapai medium; namun debu terjebak dalam leher labu; jika leher labu dipecah, debu akan mencapai medium dan organisme akan tumbuh; dengan cara ini, Pasteur telah mematahkan teori generasi spontan John Tyndall, menunjukkan bahwa debu membawa mikroba dan jika debu tidak ada, medium tetap steril, bahkan jika medium terkena udara. Tydall juga memberikan bukti keberadaan bakteri yang resisten panas. Agostino Bassi , menunjukkan bahwa penyakit ulat sutra disebabkan jamur M. J. Berkeley, menunjukkan bahwa penyakit kentang (the Great Potato Blight) Irlandian disebabkan oleh jamur Louis Pasteur, menunjukkan bahwa penyakit (péine) ulat sutra disebabkan oleh parasit protozoa Joseph Lister, menunjukkan suatu sistem pembedahan yang dirancang untuk mencegah mikroorganisme menginfeksi luka bedah, sehingga pasien jauh lebih sedikit yang terinfeksi pascaoperasi; Lister memberikan bukti tidak langsung bahwa mikroorganisme adalah agen penyebab penyakit manusia Robert Koch, yang menggunakan kritetia yang dikembangkan oleh gurunya, Jacob Henle (1809-1895), dapat menjelaskan hubungan antara Bacillus anthracis and anthrax; kriterianya dikenal sebagai postulat Koch dan masih digunakan untuk menjelaskan hubungan antara mikroorganisme tertentu dengan penyakit tertentu. Postulat Koch: o o o
o
Mikroorganisme harus ada di setiap kasus penyakit tetapi tidak ada pada individu sehat. Mikroorganisme yang dicurigai (suspected) harus dapat diisolasi dan ditumbuhkan dalam kultur murni. Penyakit yang sama harus timbul jika mikroorganisme hasil isolasi diinokulasi tersebut pada individu sehat. Mikroorganisme yang sama harus ditemukan lagi dari individu yang sakit tersebut
Robert Koch dan kawan-kawan mengembangkan teknik, reagen, dan materi lain untuk mengkultur patogen bakteri pada media padat pertumbuhan, dengan demikian mikrobiologis dapat mengisolasi mikroba untuk mendapatkan kultur murni (tunggal). 5
1851-1908
±1798 1822-1895 1854-1917
1845-1916 1856-1953
1851-1931
Charles Chamberland, membuat filter (saringan) bakteri untuk menapis bakteri dan mikroba yang lebih besar dari spesimen; melalui teknik ini juga memungkinkan ditemukannya virus sebagai agen penyebab penyakit. Edward Jenner , menggunakan prosedur vaksinasi untuk melindungi individu dari penyakit cacar (smallpox) Louis Pasteur, mengembangkan vaksin lain untuk penyakit kolera ayam, antraks, dan rabies Emil von Behring dan Shibasaburo Kitasato (1852-1931), menginduksi pembentuk antitoksin toksin diptera pada kelinci; antitoksin digunakan secara efektif untuk mengobati manusia dan memberikan bukti imunitas humoral Elie Metchnikoff, menunjukkan keberadaan sel fagositik dalam darah, yang menunjukkan imunitas dimediasi sel Sergei Winogradsky, yang bekerja dengan bakteri tanah menemukan bahwa bakteri tanah dapat oksidasi besi, belerang, dan amonia untuk mendapatkan energi; Winogradsky juga mengkaji fiksasi nitrogen anaerobik dan dekomposisi selulosa Martinus Beijerinck, mengisolasi bakteri pengikat nitrogen aerobik, suatu bakteri bintil akar yang mampu menambat nitrogen, and bakteri pereduksi sulfat. Beijerinck and Winogradsky memperkenalkan pertama kali penggunaan kultur yang diperkaya dan media selektif.
6
Anggota Dunia Mikroba Bakteri Bakteri merupakan organisme yang paling banyak jumlahnya dan lebih tersebar luas dibandingkan mahluk hidup yang lain . Bakteri memiliki ratusan ribu spesies yang hidup di darat hingga lautan dan pada tempat-tempat yang ekstrim. Bakteri ada yang menguntungkan tetapi ada pula yang merugikan. Bakteri memiliki ciri-ciri yang membedakannya dengan mahluk hidup yang lain. Bakteri adalah organisme uniselluler dan prokariot serta umumnya tidak memiliki klorofil dan berukuran renik (mikroskopis). Ciri-ciri Bakteri: 1. Organisme uniselluler 2. Prokariot (tidak memiliki membran inti sel ) 3. Umumnya tidak memiliki klorofil 4. Memiliki ukuran tubuh yang bervariasi antara 0,12 s/d ratusan mikron umumnya memiliki ukuran rata-rata 1 s/d 5 mikron. 5. Memiliki bentuk tubuh yang beraneka ragam 6. Hidup bebas atau parasit 7. Yang hidup di lingkungan ekstrim seperti pada mata air panas,kawah atau gambut dinding selnya tidak mengandung peptidoglikan 8. Yang hidupnya kosmopolit diberbagai lingkungan dinding selnya mengandung peptidoglikan Bentuk Bakteri Bentuk dasar bakteri terdiri atas bentuk bulat (kokus), batang (basil),dan spiral (spirilia) serta terdapat bentuk antara kokus dan basil yang disebut kokobasil. Berbagai macam bentuk bakteri : 1.
Bakteri Kokus :
7
a. Monokokus/ mikrokokus, yaitu berupa sel bakteri kokus tunggal b. Diplokokus, yaitu dua sel bakteri kokus berdempetan c. Tetrakokus yaitu empat sel bakteri kokus berdempetan berbentuk segi empat sebagai hasil pembelahan sel ke dua arah. d. Sarkina/ sarsina yaitu delapan sel bakteri kokus berdempetan membentuk kubus hasil pembelahan sel ke tiga arah e. Streptokokus yaitu lebih dari empat sel bakteri kokus berdempetan membentuk rantai sebagai hasil pembelahan sel ke satu atau dua arah dalam satu garis. f. Stafilokokus yaitu lebih dari empat sel bakteri kokus berdempetan seperti buah anggur 2. Bakteri Basil :
8
a. Monobasilus, yaitu berupa sel bakteri basil/ batang tunggal b. Diplobasilus, yaitu berupa dua sel bakteri basil/ batang berdempetan c. Streptobasilus, yaitu beberapa sel bakteri basil berdempetan membentuk rantai 3. Bakteri Spirilia atau lengkung:
a. Spiral/ spirillium yaitu bentuk sel bergelombang, spiralnya tebal dan kaku b. Spiroseta / spirochaeta yaitu bentuk sel seperti sekrup, spiralnya halus dan lentur c. Vibrio yaitu bentuk sel seperti tanda baca koma
Archaea Archaea atau arkea dikenal juga sebagai arkeabakteria, merupakan organisme uniseluler yang tidak mempunyai nucleus (inti selnya tidak memiliki membran inti) sehingga digolongkan sebagai prokariot. Dulu arkea digolongkan sebagai kelompok bakteri yang tidak biasa dan dinamakan arkeabakteria, tapi karena ternyata arkea mempunyai system biokimiawi yang berbeda dengan bakteri, maka arkea diklasifikasikan sebagai domain yang berbeda. Arkea dan bakteri mempunyai kesamaan dalam hal ukuran dan bentuk, walaupun beberapa jenis arkea mempunyai bentuk yang sangat tidak biasa, seperti bentuk rata dan kotak (seperti Haloquadra walsbyi.). arkea bereproduksi secara aseksual dan melakukan pembelahan biner, fragmentasi atau pertunasan (budding), tapi berbeda dengan bakteri dan eukariot lain, arkea tidak membentuk spora
9
Awalnya arkea ditemukan di lingkungan yang ekstrem, seperti di sumber air panas dan danau air asin, tapi sekarang sudah banyak dijumpai di berbagai habitat seperti lumpur, laut dan rawa-rawa. Belum ditemukan adanya arkea yang bersifat pathogen atau parasite, biasanya arkea bersimbiosis secara mutualisme atau komensalisme dengan organisme lain.
Protozoa Istilah protozoa berasal dari bahasa Yunani, yaitu protos artinya pertama dan zoon artinya hewan. Jadi,Protozoa adalah hewan pertama. Protozoa merupakan kelompok lain protista eukariotik. Kadang-kadang antara algae dan protozoa kurang jelas perbedaannya. Kebanyakan Protozoa hanya dapat dilihat di bawah mikroskop. Beberapa organisme mempunyai sifat antara algae dan protozoa. Protozoa dibedakan dari prokariot karena ukurannya yang lebih besar, dan selnya eukariotik. Protozoa dibedakan dari algae karena tidak berklorofil, dibedakan dari jamur karena dapat bergerak aktif dan tidak berdinding sel, serta dibedakan dari jamur lendir karena tidak dapat membentuk badan buah. Kelas Utama Protozoa:
Kelompok Utama (Nama Utama)
Mastighophora (Flagelata)
Sarcodina (Amoeba)
Ciliata (siliata)
Cara Berkembang Biak
Cara Gerak
Flagela (satu atau lebih)
Pseudopodia
Silia (banyak)
Ciri-ciri Lain
Pembelahan biner membujur, pada beberapa kelompok ada reproduksi seksual
Nutrisinya fototropik, heterotropik atau keduanya
Pembelahan biner,
Kebanyakan spesies hidup
tak ada reproduksi seksual Pembelahan biner melintang, reproduksi seksual dengan konjugasi
10
bebas, heterotropik Kebanyakan spesies hidup bebas, heterotropik
Pembelahan Sporozoa (sporozoa)
Gerak dengan meluncur atau tidak bergerak
bahurangkap, mungkin ada mikro gamet berflagela pada reproduksi seksual
Semua spesies parasit
Algae Mikroskopik Algae adalah organisme eukariotik fotosintetik aerobic. Ukuran algae sangat beragam, dari beberapa micrometer hingga beberapa meter. Organisme ini mengandung klorofil serta pigmen-pigmen lain untuk melangsungkan fotosintesis. Kebanyakan algae berukuran mikroskopis atau disebut sebagai algae mikroskopis. Dan ilmu yang mempelajarinya disebut fikologi. Algae biasanya terdapat sebagai sel tunggal yang berbentuk bola, batang, gada atau kumparan. Ada yang dapat bergerak (dengan flagella) dan ada yang tidak, bereproduksi secara asekaual dan seksual. Untuk yang berukuran makro, ada yang multiseluler. Di dunia mikrobia, algae termasuk eukariotik, umumnya bersifat fotosintetik dengan pigmen fotosintetik hijau (klorofil), coklat (fikosantin), biru kehijauan (fikobilin), dan merah (fikoeritrin). Morfologi algae ada yang berbentuk uniseluler, ada pula yang multiseluler tetapi belum ada pembagian tugas pada sel-sel komponennya. Algae dibedakan dari tumbuhan hanya karena hal tersebut.
Khamir Pada umumnya, sel khamir lebih besar daripada kebanyakan bakteri, tapi khamir yang paling kecil tidak sebesar bakteri paling besar. Ukurannya berkisar antara 1-5 mikron (lebar) dan 5-30 mikron (panjang). Biasanya berbentuk bulat telur tapi beberapa ada yang memanjang atau berbentuk bola. Khamir tidak dilengkapi flagella atau alat gerak lainnya. Pada dasarnya, tubuhnya hanya terdiri dari dua bagian, yaitu miselium dan spora (sel resisten, istirahat atau dorman). Miselium merupakan kumpulan beberapa filament yan g dinamakan hifa. Setiap hifa lebarnya 5-10 mikron (sel bakteri biasanya berdiameter 1 mikron). Ada tiga macam morfologi hifa, yaitu aseptat, septat uninukleat dan septat multinukleat. 11
Khamir atau disebut yeast, merupakan jamur bersel satu yang mikroskopik,tidak berflagela. Beberapa genera membentuk filamen (pseudomiselium). Carahidupnya sebagai saprofit dan parasit. Hidup di dalam tanah atau debu di udara, tanah,daun-daun, nektar bunga, permukaan buahbuahan, di tubuh serangga, dan cairan yangmengandung gula seperti sirup, madu dan lain-lain.Khamir berbentuk bulat (speroid), elips, batang atau silindris, seperti buahjeruk, sosis, dan lain-lain. Bentuknya yang tetap dapat digunakan untuk identifikasi.Khamir dapat dimasukkan ke dalam klas Ascomycetes, Basidiomycetes danDeuteromycetes. Gambar sel Khamir:
12
Bab 1 Media Pertumbuhan Pengertian dan Fungsi Media pertumbuhan mikroorganisme adalah suatu bahan yang terdiri dari campuran zat-zat makanan (nutrisi) yang diperlukan mikroorganisme untuk pertumbuhannya. Mikroorganisme memanfaatkan nutrisi media berupa molekulmolekul kecil yang dirakit untuk menyusun komponen sel. Dengan media pertumbuhan dapat dilakukan isolat mikroorganisme menjadi kultur murni dan juga memanipulasi komposisi media pertumbuhannya.
Bahan-bahan media pertumbuhan 1. Bahan dasar
air (H2O) sebagai pelarut agar (dari rumput laut) yang berfungsi untuk pemadat media. Agar sulit didegradasi oleh mikroorganisme pada umumnya dan mencair pada suhu 45 o C. gelatin juga memiliki fungsi yang sama seperti agar. Gelatin adalah polimer asam amino yang diproduksi dari kolagen. Kekurangannnya adalah lebih banyak jenis mikroba yang mampu menguraikannya dibanding agar. Silicagel, yaitu bahan yang mengandung natrium silikat. Fungsinya juga sebagai pemadat media. Silica gel khusus digunakan untuk memadatkan media bagi mikroorganisme autotrof obligat.
2. Nutrisi atau zat makanan Media harus mengandung unsur-unsur yang diperlukan untuk metabolisme sel yaitu berupa unsur makro seperti C, H, O, N, P; unsur mikro seperti Fe, Mg dan unsur pelikan/trace element.
Sumber karbon dan energi yang dapat diperoleh berupa senyawa organik atau anorganik esuai dengan sifat mikrobanya. Jasad heterotrof memerlukan sumber karbon organik antara lain dari karbohidrat, lemak, protein dan asam organik. Sumber nitrogen mencakup asam amino, protein atau senyawa bernitrogen lain. Sejumlah mikroba dapat menggunakan sumber N anorganik seperti urea. Vitamin-vitamin. 13
3. Bahan tambahan Bahan-bahan tambahan yaitu bahan yang ditambahkan ke medium dengan tujuan tertentu, misalnya phenolred (indikator asam basa) ditambahkan untuk indikator perubahan pH akibat produksi asam organik hasil metabolisme. Antibiotik ditambahkan untuk menghambat pertumbuhan mikroba nontarget/kontaminan. 4. Bahan yang sering digunakan dalam pembuatan media
Agar, agar dapat diperoleh dalam bentuk batangan, granula atau bubuk dan terbuat dari beberapa jenis rumput laut. Kegunaannya adalah sebagai pemadat (gelling) yang pertama kali digunakan oleh Fraw & Walther Hesse untuk membuat media. Jika dicampur dengan air dingin, agar tidak akan larut. Untuk melarutkannya harus diasuk dan dipanasi, pencairan dan pemadatan berkali-kali atau sterilisasi yang terlalu lama dapat menurunkan kekuatan agar, terutama pada pH yang asam Peptone, peptone adalah produk hidrolisis protein hewani atau nabati seperti otot, liver, darah, susu, casein, lactalbumin, gelatin dan kedelai. Komposisinya tergantung pada bahan asalnya dan bagaimana cara memperolehnya. Meatextract. Meatextract mengandung basa organik terbuat dari otak, limpa, plasenta dan daging sapi. Yeastextract. Yeastextract terbuat dari ragi pengembang roti atau pembuat alcohol. Yeast extract mengandung asam amino yang lengkap & vitamin (B complex). Karbohidrat. Karbohidrat ditambahkan untuk memperkaya pembentukan asam amino dan gas dari karbohidrat. Jenis karbohidrat yang umumnya digunkan dalam amilum, glukosa, fruktosa, galaktosa, sukrosa, manitol, dll. Konsentrasi yang ditambahkan untuk analisis fermentasi adalah 0,5-1%.
Macam-Macam Media Pertumbuhan 1. Medium berdasarkan sifat fisik
Medium padat yaitu media yang mengandung agar 15% sehingga setelah dingin media menjadi padat. Medium setengah padat yaitu media yang mengandung agar 0,3-0,4% sehingga menjadi sedikit kenyal, tidak padat, tidak begitu cair. Media semi solid dibuat dengan tujuan supaya pertumbuhan mikroba dapat menyebar ke seluruh media tetapi tidak mengalami percampuran sempurna jika tergoyang. Misalnya bakteri yang tumbuh pada media NfB
14
(NitrogenfreeBromthymolBlue) semisolid akan membentuk cincin hijau kebiruan di bawah permukaan media, jika media ini cair maka cincin ini dapat dengan mudah hancur. Semisolid juga bertujuan untuk mencegah/menekan difusi oksigen, misalnya pada media NitrateBroth, kondisi anaerob atau sedikit oksigen meningkatkan metabolisme nitrat tetapi bakteri ini juga diharuskan tumbuh merata diseluruh media. Medium cair yaitu media yang tidak mengandung agar, contohnya adalah NB (NutrientBroth), LB (LactoseBroth).
2. Medium berdasarkan komposisi
Medium sintesis yaitu media yang komposisi zat kimianya diketahui jenis dan takarannya secara pasti, misalnya Glucose Agar, Mac Conkey Agar. Medium semi sintesis yaitu media yang sebagian komposisinya diketahui secara pasti, misanya PDA (Potato Dextrose Agar) yang mengandung agar, dekstrosa dan ekstrak kentang. Untuk bahan ekstrak kentang, kita tidak dapat mengetahui secara detail tentang komposisi senyawa penyusunnya. Medium non sintesis yaitu media yang dibuat dengan komposisi yang tidak dapat diketahui secara pasti dan biasanya langsung diekstrak dari bahan dasarnya, misalnya Tomato Juice Agar, Brain Heart Infusion Agar, Pancreatic Extract.
3. Medium berdasarkan tujuan
Media untuk isolasi Media ini mengandung semua senyawa esensial untuk pertumbuhan mikroba, misalnya Nutrient Broth, Blood Agar. Media selektif/penghambat Media yang selain mengandung nutrisi juga ditambah suatu zat tertentu sehingga media tersebut dapat menekan pertumbuhan mikroba lain dan merangsang pertumbuhan mikroba yang diinginkan. Contohnya adalah Luria Bertani medium yang ditambah Amphisilin untuk merangsang E.coli resisten antibotik dan menghambat kontaminan yang peka, Ampiciline. Salt broth yang ditambah NaCl 4% untuk membunuh Streptococcus agalactiae yang toleran terhadap garam. Media diperkaya (enrichment) Media diperkaya adalah media yang mengandung komponen dasar untuk pertumbuhan mikroba dan ditambah komponen kompleks seperti darah, serum, kuning telur. Media diperkaya juga bersifat selektif untuk mikroba tertentu. Bakteri yang ditumbuhkan dalam media ini tidak hanya membutuhkan nutrisi sederhana untuk berkembang biak, tetapi
15
membutuhkan komponen kompleks, misalnya Blood Tellurite Agar, Bile Agar, Serum Agar, dll. Media untuk peremajaan kultur Media umum atau spesifik yang digunakan untuk peremajaan kultur Media untuk menentukan kebutuhan nutrisi spesifik. Media ini digunakan unutk mendiagnosis atau menganalisis metabolisme suatu mikroba. Contohnya adalah Koser’s Citratemedium, yang digunakan untuk menguji kemampuan menggunakan asam sitrat sebagai sumber karbon. Media untuk karakterisasi bakteri Media yang digunakan untuk mengetahui kemempuan spesifik suatu mikroba. Kadang-kadang indikator ditambahkan untuk menunjukkan adanya perubahan kimia. Contohnya adalah Nitrate Broth, Lactose Broth, Arginine Agar. Media diferensial Media ini bertujuan untuk mengidentifikasi mikroba dari campurannya berdasar karakter spesifik yang ditunjukkan pada media diferensial, misalnya TSIA (Triple Sugar Iron Agar) yang mampu memilih Enterobacteria berdasarkan bentuk, warna, ukuran koloni dan perubahan warna media di sekeliling koloni.
Ciri-ciri beberapa bahan kompleks yang digunakan sebagai bahan pembuat media: Bahan Mentah
Ciri
Ekstrak daging sapi (beef extract)
Suatau ekstrak cair jaringan daging sapi yang empuk, dikonsentrasikan menjadi pasta
Pepton
Produk yang dihasilkan dari bahan-bahan yang mengandung protein seperti daging, kasein, dan gelatin
Agar
Ekstrak khamir (yeast extract)
Suatu karbohidrat kompleks yang diperoleh dari algae marin tertentu (agar laut), diolah untuk membuang substansi yang tidak dikehendaki Suatu ekstrak cair sel khamir, tersedia juga
16
Nilai Nutrisi Mengandung karbohidrat, senyawa nitrogen organic, vitamin yang larut dalam air dan berbagai garam Sumber utama nitrogen organic, dapat pula mengandung vitamin dan kadang-kadang karbohidrat, bergantung pada jenis bahan awal. Digunakan sebagai bahan pemadat media, bukan sumber nutrient bagi bakteri Suatu sumber yang sangat kaya dengan vitamin B,
dalam bentuk bubuk (komersial)
mengandung nitrogen organic dan senyawasenyawa karbon
Ø Pembuatan Nutrient Agar 1.Timbang komponen medium dengan menggunakan timbangan analitis untuk volume yang diinginkan sesuai dengan komposisi berikut: § Beefextract 3 g § Peptone 5 g § Agar 15 g § Akuades s.d 1000 ml 2. Akuades sebanyak 100 ml dibagi menjadi dua satu bagian untuk melarutkan Beefextract dan peptone dan sebagian lagi untuk melarutkan agar. Sebaiknya air untuk melarutkan agar lebih banyak 3. Larutkan agar pada sebagian air tersebut dengan mengaduk secara konstan dan diberi panas. Dapat menggunakan kompor gas atau hot plate stirrer (jangan sampai overheat, karena akan terbentuk busa dan memuai sehingga tumpah).
4.Sementara itu sebagian akuades digunakan untuk melarutkan peptone dan beef extract, cukup dengan pengadukan.
17
5. Setelah keduanya larut, larutan dituangkan ke larutan agar dan diaduk sampai homogen. Kemudian pH media diukur dengan mencelupkan kertas pH indikator. Jika pH tidak netral maka dapat ditambahkan HCl/NaOH. 6. Setelah itu media dimasukkan ke dalam labu Erlenmeyer dan disterilisasi dengan autoklaf. 7. Tuang media steril ke cawan petri steril secara aseptis. Jika diinginkan media tegak atau miring pada point ke 5, media langsung dituang ke tabung kemudian disterilisasi.
Ø Pembuatan Nutrient Broth Komposisi untuk media NB sama dengan NA tetapi tidak memakai agar sebagai pemadat. Proses pembuatannyapun lebih sederhana, tinggal melarutkan peptone dan beef extract kemudian ditampung dalam labu Erlenmeyer atau tabung reaksi dan siap disterilisasi. Proses pembuatan ini tidak memerlukan panas, peptone dan beef extract akan mudah larut sempurna pada air suhu kamar jika diaduk
ØPembuatan Potato Dextrose Agar (PDA) 1. Timbang komponen media dengan menggunakan timbangan analitis untuk volume yang diinginkan sesuai dengan komposisi berikut: § Potato/kentang 3 g § Peptone 5 g § Agar 15 g § Akuades s.d 1000 ml § (sebelum ditimbang, sebaiknya kentang dikupas dan diiris kecil-kecil) 2. Rebus kentang dalam sebagian akuades tadi selama 1-3 jam sampai lunak, kemudian diambil ekstraknya dengan menyaring dan memerasnya menggunakan kertas saring lalu ditampung di Beakerglass baru. 3. Agar dilarutkan dengan Hot Plate Stirrer dalam 50 ml akuades lalu setelah larut dapat ditambahkan dekstrosa dan dihomogenkan lagi. 4. Setelah semua larut, ekstrak kentang dan agar-dekstrosa dicampur dan dihomogenkan. Atur pH media menjadi 5-6 dengan meneteskan HCl/NaOH.
18
5. Media dituang ke dalam Erlenmeyer atau ke tabung reaksi kemudian siap untuk disterilisasi.
2.
3.
4.
19
Bab 2 Sterilisasi Pengertian Sterilisasi yaitu proses atau kegiatan membebaskan suatu bahan atau benda dari semua bentuk kehidupan.
Macam-macam sterilisasi Pada prinsipnya sterilisasi dapat dilakukan dengan 3 cara yaitu secara mekanik, fisik dan kimiawi. 1. Sterilisasi secara mekanik (filtrasi) menggunakan suatu saringan yang berpori sangat kecil (0.22 mikron atau 0.45 mikron) sehingga mikroba tertahan pada saringan tersebut. Proses ini ditujukan untuk sterilisasi bahan yang peka panas, misal nya larutan enzim dan antibiotik. 2. Sterilisasi secara fisik dapat dilakukan dengan pemanasan & penyinaran. · Pemanasan a. Pemijaran (dengan api langsung): membakar alat pada api secara langsung, contoh alat : jarum inokulum, pinset, batang L, dll. b. Panas kering: sterilisasi dengan oven kira-kira 60-1800C. Sterilisasi panas kering cocok untuk alat yang terbuat dari kaca misalnya erlenmeyer, tabung reaksi dll. c. Uap air panas: konsep ini mirip dengan mengukus. Bahan yang mengandung air lebih tepat menggungakan metode ini supaya tidak terjadi dehidrasi. d. Uap air panas bertekanan : menggunalkan autoklaf · Penyinaran dengan UV Sinar Ultra Violet juga dapat digunakan untuk proses sterilisasi, misalnya untuk membunuh mikroba yang menempel pada permukaan interior Safety Cabinet dengan disinari lampu UV 3. Sterilisasi secara kimiawi biasanya menggunakan senyawa desinfektan antara lain alkohol.
20
Sterilisasi dengan penyaringan (filtrasi) Sterilisasi dengan penyaringan dilakukan untuk mensterilisasi cairan yagn mudah rusak jika terkena panas atu mudah menguap (volatile). Cairan yang disterilisasi dilewatkan ke suatu saringan (ditekan dengan gaya sentrifugasi atau pompa vakum) yang berpori dengan diameter yang cukup kecil untuk menyaring bakteri. Virus tidak akan tersaring dengan metode ini. Sterilisasi dengan penyaringan dapat dilakukan dengan berbagai cara : · Non-disposable filtration apparatus - Disedot dengan pompa vakum - Volume 20-1000 ml
· Disposable filter cup unit - Disedot dengan pompa vakum - Volume 15-1000 ml
· Disposable filtration unit dengan botol penyimpan - Disedot dengan pompa vakum - Volume 15-1000 ml
· Syringe filters - Ditekan seperti jarum suntik - Volume 1-20 ml
· Spin filters - Ditekan dengan gaya setrifugasi - Volume kurang dari 1 ml
21
Cara kerja menggunakan Non-disposable filtration apparatus · Sterilkan saringan (dapat menggunakan saringan Bekerfeld, Chamberland Zeitz), membran penyaring (kertas saring) dan erlenmeyer penampung. · Pasang atau rakit alat-alat tersebut secara aseptis (sesuai gambar), lalu isi corong dengan larutan yang akan disterilkan. · Hubungkan katup erlenmeyer dengan pompa vakum kemudian hidupkan pompa. · setelah semua larutan melewati membran filter dan tertampung dierlenmeyer, maka larutan dapat dipindahkan kedalam gelas penampung lain yang sudah steril dan tutup dengan kapas atau aluminium foil yang steril.
Tyndalisasi Konsep kerja metode ini merip dengan mengukus. Bahan yang mengandung air dan tidak tahan tekanan atau suhu tinggi lebih tepat disterilkan dengan metode ini. Misalnya susu yang disterilkan dengan suhu tinggi akan mengalami koagulasi dan bahan yang berpati disterilkan pada suhu bertekanan pada kondisi pH asam akan terhidrolisis. Cara kerja : · Bahan dimasukkan kedalam erlenmeyer atau botol dan ditutup rapat dengan sumbat atau aluminium foil. · Erlenmeyer/botol lalu dimasukkan kedalam alat sterilisasi (alat standar menggunakan Arnold Steam Sterilizen atau dandang). · Nyalakan sumber panas dan tunggu hingga termometer menunjukkan suhu 100 0C kemudian hitung waktu mundur hingga 30 menit (uap panas yang terbentuk akan mematikan mikroba). · Setelah selesai alat sterilisasi dimatikan dan bahan yang steril dikeluarkan. · Setelah 24 jam, bahan tersebut di sterilkan lagi dengan cara yang sama, sedang waktu ini dimaksudkan untuk memberi kesempatan spora atau sel vegetatif yang belum mati untuk tumbuh sehingga mudah dibunuh. Sterilisasi dengan udara panas (Dry heat sterilization) Sterilisasi dengan metode ini biasanya digunakan untuk peralatan gelas seperti cawan petri, pipet ukur dan labu erlenmyer. Alat gelas yang disterilisasi dengan udara panas tidak akan timbul kondensasi sehingga tidak ada tetes air (embun) didalam alat gelas. 22
· Bungkus alat-alat gelas dengan kertas payung atau aluminium foil · Atur pengatur suhu oven menjadi 1800C dan alat disterilkan selama 2-3 jam. Prinsip kerja Biological Saferty Cabinet atau Laminar Air Flow Biological Safety Cabinet merupakan kabinet kerja yang sterilkan untuk kerja mikrobiologi. BSC memiliki suatu pengatur aliran udara yang menciptakan aliran udara kotor (dimungkinkan ada kontaminan) untuk disaring dan diresirkulasi melalui filter. BSC juga disebut biosafety hood, dan juga dikenal dengan Laminar flowhood atau Class II vertical flow cabinet yang menyediakan alat filtrasi dan aliran udara yang bersirkulasi didalam ruang kerja. Aliran udara diatur untuk menghambat udara luar masuk dan udara di dalam keluar, untuk mencegah kontaminasi dari luar dan pencemaran bakteri dari ruang BSC. Udara yang keluar disaring melewati penyaring sehingga sel-sel yang berbahaya tidak lepas keluar ke ruangan lain. Berbagai kelas Biological Safety Cabinet.
TEKNIK KERJA ASEPTIS (TANPA KONTAMINASI) Tehnik aseptis atau steril adalah suatu sistem cara bekerja (praktek) yang menjaga sterilitas ketika menangani pengkulturan mikroorganisme untuk mencegah kontaminasi terhadap kultur mikroorganisme yang diinginkan. Dasar digunakannya tehnik aseptik adalah adanya banyak partikel debu yang mengandung mikroorganisme (bakteri atau spora) yang mungkin dapat masuk ke dalam cawan, mulut erlenmeyer, atau mengendap di area kerja. Pertumbuhan mikroba yang tidak diinginkan ini dapat mempengaruhi atau mengganggu hasil dari suatu percobaan. 23
Mikroorganisme dapat juga ”jatuh” dari tangan operator, sarung tangan atau jas laboratorium karena pergerakan lengan yang relatif cepat. Penggunaan tehnik aseptik meminimalisir material yang digunakan terhadap agen pengontaminasi. Pada kenyataanya tehnik aspetis tidak dapat melindungi secara sempurna dari bahaya kontaminan. Namun semakin banyak belajar dari pengalaman maka semakin mengurangi resiko yang ditimbulkan. Tehnik aseptis digunakan pada saat : - Teknik aseptis seharusnya digunakan saat kita bekerja dengan mikroorganisme hidup dan dengan segala media pertumbuhannya. - Teknik aseptis sebaiknya digunakan ketika kita tidak ingin larutan dari suatu botol tidak berubah sifat akibat aktivitas mikroorganisme, seperti saat membuat buffer meskipun buffer dengan konsentrasi garam tinggi atau mengandung deterjen. - Teknik aseptis disarankan pada saat kita bekerja menggunakan agen atau senyawa yang berbahaya seperti bahan kimia beracun atau bahan radioaktif. Tentu saja perlindungan diri sendiri dari bahaya senyawa ini lebih penting. Beberapa contoh : - Mentransfer biakan dari media satu ke media lainnya. Bakteri kontaminan yang tumbuh tentu saja dapat mengganggu kemurnian biakan dan mungkin saja membuat rancu hasil yang didapatkan. - Memfilter media atau serum dan menghitung jumlah bakteri dengan cara filtrasi. Kontaminasi yang ikut tersaring dapat tumbuh pada media baru yang membuat tidak terpakainya media pertumbuhan tersebut atau mempengaruhi jumlah total bakteri. - Membuka dan merehidrasi bakteri terliofolisasi. Teknik aseptis dapat menjaga sel yang terrehidrasi dari bakteri kontaminan dan menjaga tidak keluarnya sel ke meja kerja. - Melakukan reaksi restriksi atau PCR. Walaupun enzim restriksi pada umumnya disimpan dalam gliserol 50% (bakteriostatik) tapi enzim yang diencerkan akan lebih rentan rusak akibat aktivitas mikroorganisme atau dihambat oleh ion atau unsur tertentu. Kontaminasi DNA asing yang masuk ke dalam tube PCR mungkin dapat teramplifikasi sehingga hasil yang didapat membingungkan. - Melabeli sel dengan (32P) fosfat. Pada kasus ini kerja aseptis ditujukan untuk melindungi operator dari bahan kimia berbahaya. Jika menggunakan teknik aseptis maka Anda tidak akan membiarkan tutup bahan radioaktif terbuka atau secara tidak sengaja menggunakan pipet bekas bahan radioaktif. Aturan umum tehnik aseptis: - Meja kerja sebaiknya jauh dari sesuatu yang dapat menciptakan aliran udara, misalnya tidak ada jendela yang terbuka, tidak dekat dengan pintu yang selalu dibuka-tutup dan jauh dari lalu-lintas orang. Penggunaan kabinet biosafety dapat menjaga dan mengatur aliran udara tetapi ini bukan merupakan suatu jaminan mutlak dari resiko terkontaminasi. - Pastikan meja kerja bersih dari kotoran dan benda-benda yang tidak akan digunakan. Kultur tua atau pipet bekas seharusnya tidak berada di meja kerja. Kotoran seringkali sulit dibersihkan pada sudut-sudut ruang. - Usap meja kerja dengan antiseptik atau senyawa pembersih lain sebelum digunakan. Di 24
sebagian besar laboratorium umumnya menggunakan etanol 70% untuk membersihkannya. Sediakan etanol pada posisi selalu dekat dengan meja. Jika telah selesai bekerja, sebaiknya meja kerja dikosongkan dari peralatan dan bersihkan lagi. - Semua peralatan (pipet, cawan dll.) yang digunakan harus steril. Sebaiknya semua peralatan yang telah disterilisasi diberi label. Jika menemukan alat yang sepertinya telah disterilisai tapi masih ragu terhadap sterilitasnya maka sebaiknya jangan digunakan. Bungkus peralatan baik alat steril sekali pakai atau bukan (pipet, syringe dll.)diperiksa terlebih dahulu apakah terdapat kebocoran atau tersobek. - Atur peralatan di meja kerja sedemikian rupa sehingga meminimalisir pergerakan tangan. Alat-alat yang biasanya digunakan dengan tangan kanan (jarum inokulum, filler, pipet dll.) letakkan disebelah kanan begitu juga sebaliknya (rak tabung, cawan petri, erlenmeyer dll.) terkecuali untuk tangan kidal. Di bagian tengah meja kerja disediakan ruang lapang untuk bekerja. - Membakar mulut atau bagian tepi dari suatu alat dapat membunuh mikroorganisme yang menempel. - Telah siap dengan segala peralatan dan bahan yang dibutuhkan. Semua bahan dan alat untuk prosedur tertentu telah dipersiapkan di meja kerja. Jangan sampai meninggalkan meja kerja untuk mengambil sesuatu yang terlupa atau tertinggal. Perhitungkan semua yang diperlukan beserta cadangannya. - Pakai sarung tangan lateks dan ganti secara berkala. Sarung tangan membantu melindungi dari tumpahan biakan atau bahan kimia berbahaya. Tidak menggunakan sarung tangan dirasa tidak bermasalah jika materi dan bakteri yang diteliti dipastikan tidak berbahaya. - Cuci tangan sebelum dan sesudah bekerja. Cuci tangan dengan desinfektan atau sabun bila tidak ada desinfektan. Cuci tangan dapat membilas mikroorganisme yang ada di tangan. Saran-saran tehnik aseptis: - Minimalisasi gerak : pergerakan tangan dapat menciptakan aliran udara . semakin cepat pergerakannya semakin cepat aliran udara yang ditimbulkan. Pergerakan lengan sebaiknya dilakukan seperlu mungin dan bergerak secara lembut. - Minimalisasi jarak: jarak antar peralatan diatur seefektif dan seefisien mungkn. Antar peralatan jangan diletakkan terlalu jauh. - Minimalisasi keterpaparan : semakin sering menggerakkan sesuatu (mis: cawan berisi media) melewati udara maka semakin besar partikel udara untuk masuk. Semakin lama tutup erlenmeyer terbuka juga semakin besar terkontaminasi. Catatan penting dalam kerja aspetis : - Tutup erlenmeyer, botol atau cawan sebaiknya dibuka kira-kira 450. tujuannya untuk meminimalisasi udara masuk namun masih dapat mentransfer sesuatu. - Jika diharuskan untuk membuka penuh dan tutup diletakkan di meja kerja, maka tutup dapat diletakkan tertelungkup atau terlentang (muka menghadap ke atas). Jika tertelungkup pastikan permukaannya bersih dan bila terlentang pastikan juga tidak ada gerakan di atasnya. - Untuk menghindari bakteri yang menempel pada jarum inokulum terpental/terciprat maka diameter loops harus berkisar 2-3 mm dan untuk memperkecil getaran panjang kawat tidak 25
lebih dari 6cm. - Tidak boleh menyedot cairan pada saat pippeting dengan mulut. - Untuk menghindari penyebaran mikroba dari tetesan pipet yang terjatuh maka dapat digunakan kain steril yang diberi desinfektan sebagai alas. Kain ini setelah selesai dibuang sebagai limbah berbahaya.
UJI STERILITAS Uji sterilitas dilakukan untuk mengetahui apakah bahan atau sediaan yang harus steril sudah memenuhi syarat atau tidak. Uji sterilitas dilakukan secara mikrobiologi dengan menggunakan medium pertumbuhan tertentu. Media untuk pengujian diperlukan dalam uji ini. Beberapa media yang dapat digunakan dalam pengujian ini adalah : 1. Media Tioglikolat Cair Komposisi : L-sistin P 0,5 g NaCl P 2,5 g Glukosa P 5,5 g Agar P Granul 0,75 g Ekstrak ragi P 5,0 g Digesti pancreas kasein P 15,0 g Natrium tioglikolat atau P 0,5 g Asam tioglikolat P 0,3 ml Larutan natrium resazurin P 1,0 ml Air 1000 ml pH setelah sterilisasi 7,1 ± 0,2 Campur dan panaskan hingga larut. Atur pH larutan hingga setelah sterilisasi 7,1 ± 0,2 menggunakan NaOH 1 N. jika perlu saring selagi panas menggunakan kertas saring. Tempatkan media dalam tabung yang sesuai, yang memberikan perbandingan permukaan dengan kedalaman media sedemikian rupa sehingga tidak lebih dari setengah bagian atas media yang mengalami perubahan warna sebagai indikasi masuknya oksigen pada akhir masa inkubasi. Sterilisasi dalam autoklaf. Jika lebih dari sepertiga bagian atas terjadi perubahan warna merah muda, media dapat diperbaiki satu kali dengan pemanasan di atas tangas air atau dalam uap yang mengalir bebas hingga warna merah muda hilang. Media siap digunakan jika tidak lebih dari sepersepuluh bagian atas media berwarna merah muda. 2. Media Tioglikolat Alternatif Komposisi : L-sistin P 0,5 g NaCl P 2,5 g Glukosa P 5,5 g Ekstrak ragi P 5,0 g Digesti pancreas kasein P 15,0 g Natrium tioglikolat atau P 0,5 ml Asam tioglikolat P 0,3 ml Air 1000 ml pH setelah sterilisasi 7,1 ± 0,2 Soybean-Casein Digest Medium
26
Komposisi : Digesti pancreas kasein P 17 ,0 g Digesti papaik tepung kedele 3,0 g NaCl P 5,0 g Kalium fosfat dibasa P 2,5 g Glukosa P 2,5 g Air 1000 ml pH setelah sterilisasi 7,3 ± 0,2 Tabel Jumlah Untuk Bahan Cair
Vol. minimum untuk media Volume Isi Wadah (ml) minimum Untuk inokulasi Untuk membran (ml) langsung Semua 15 100 <1 1 15 100 < 10
10 – 50 50 – <100 50 – <100 (I.V) 100 – 500 > 500
Jumlah Wadah Permedia 20 20
5
40
100
20
10
80
100
20
Semua
-
100
10
Semua
-
100
10
Semua
-
100
10
Prosedur pengujian terdiri dari (1) inokulasi langsung ke dalam media uji dan (2) teknik penyaringan membran. Penyaringan membran berguna untuk cairan dan serbuk yang dapat larut yang bersifat bakteriostatik atau fungistatik, untuk memisahkan mikroba kontaminan dari penghambat pertumbuhan. Cara ini juga sangat bergun untuk bahan seperti minyak, salep/krim yang dapat melarut ke dalam larutan pengencer bukan bakteriostatik atau bukan fungistatik. Teknik penyaringan membran dapat juga digunakan untuk uji sterilitas permukaan atau lumen kritis alat-alat kesehatan. Perincian dari prosedur inokulasi dan penyaringan tabung uji, termasuk modifikasimodifikasi untuk keadaan tertentu, terdapat dalam USP. Penafsiran dan metode uji. Prinsip faktor pelaksanaan dalam uji tersebut adalah bahwa bagian bahan yang akan di uji di tempatkan dalam lingkungan yang dirancang sedemikian rupa, sehingga tiap organisme yang ada hidup dan tumbuh. Tetapi diketahui bahwa mikroorganisme tidak selalu bereproduksi atau bervegatasi (spora) hanya dengan menempatkannya dilingkungan yang diperkirakan baik. Pelemahan yang diakibatkan oleh radiasi sinar
27
ultraviolet atau pemaparan non lethal terhadap panas, tidak adanya stimulasi yang seringkali perlu untuk membuat spora bervegetasi, dan kontak sebelumnya dengan suatu zat bakteriostatik adalah beberapa efek yang biasa mengganggu pertumbuhan organisme tersebut. Dalam hal seperti itu akan diperoleh hasil negative palsu. Prosedur sterilisasi merupakan tahap penting dalam mencapai produk steril, namun semua prosedur dan kondisi-kondisi lain yang dibutuhkan untuk pembuatan produk tersebut harus dirancang untuk membantu tahap ini. Pembersihan ruangan yang baik, lingkungan yang terkontrol dengan efektif, suatu muatan dari produk yang dapat dikontrol dan diidentifikasi, proses produksi yang direncanakan dan dikontrol dengan baik, serta personel yang ditatar dengan baik dan berdedikasi tinggi untuk produksi dan pengujian sangat penting untuk produksi suatu produk steril. Hanya bila semua factor ini melengkapi penemuan-penemuan dari uji sterilisasi, dapatlah disimpulkan dengan penuh kepercayaan bahwa produk tersebut steril.
28
Bab 3 Isolasi & Inokulasi Mikroorganisme Pengertian Di alam populasi mikroba tidak terpisah sendiri menurut jenisnya, tetapi terdiri dari campuran berbagai macam sel. Di dalam laboratorium populasi bakteri inidapat diisolasi menjadi kultur murni yang terdiri dari satu jenis yang dapat dipelajari morfologi, sifat dan kemampuan biokimiawinya.
Teknik Pengambilan Sampel Sebelum melakukan isolasi terlebih dahulu dilakukan pengambilan sampel. Berikut merupakan prosedur pengambilan sampel. 1. Sampel tanah Jika mikroorganisme yang diinginkan kemungkinan berada di dalam tanah, maka cara pengambilannya disesuaikan dengan tujuan dan kebutuhan. Misal jika yang diinginkan mikroorganisma rhizosfer maka sampel diambil dari sekitar perakaran dekat permukaan hingga ujung perakaran.. 2. Sampel air Pengambilan sampel air bergantung kepada keadaan air itu sendiri. Jika beerasal dari air sungai yang mengalir maka botol dicelupkan miring dengan bibir botol melawan arus air. Bila pengambilan sampel dilakukan pada air yang tenang, botol dapat dicelupkan dengan tali, jika ingin mengambil sampel dari air keran maka sebelumya keran dialirkan dulu beberapa saat dan mulut kran dibakar.
29
Isolasi Dengan Cara Pengenceran (Dilution) 1. Teknik Preparasi Suspensi Sampel yang telah diambil kemudian disuspensikan dalam akuades steril. Tujuan dari teknik ini pada prinsipnya adalah melarutkan atau melepaskan mikroba dari substratnya ke dalam air sehingga lebih mudah penanganannya. Macam-macam preparsi bergantung kepada bentuk sampel : a. Swab (ulas), dilakukan menggunakan cotton bud steril pada sampel yang memiliki permukaan luas dan pada umumnya sulit dipindahkan atau sesuatu pada benda tersebut. Contohnya adalah meja, batu, batang kayu dll. Caranya dengan mengusapkan cotton bud memutar sehingga seluruh permukaan kapas dari cotton bud kontak dengan permukaan sampel. Swab akan lebih baik jika cotton bud dicelupkan terlebih dahulu ke dalam larutan atraktan semisal pepton water. b. Rinse (bilas) ditujukan untuk melarutkan sel-sel mikroba yang menempel pada permukaan substrat yang luas tapi relatif berukuran kecil, misalnya daun bunga dll. Rinse merupakan prosedur kerja dengan mencelupkan sampel ke dalam akuades dengan perbandingan 1 : 9 (w/v). Contohnya sampel daun diambil dan ditimbang 5 g kemudian dibilas dengan akuades 45 ml yang terdapat dalam beakerglass. c. Maseration (pengancuran), sampel yang berbentuk padat dapat ditumbuk dengan mortar dan pestle sehingga mikroba yang ada dipermukaan atau di dalam dapat terlepas kemudian dilarutkan ke dalam air. Contoh sampelnya antar alain bakso, biji, buah dll. Perbandingan antar berat sampel dengan pengenceran pertama adalah 1 : 9 (w/v). Unutk sampel dari tanh tak perlu dimaserasi 2. Teknik Pengenceran Bertingkat
30
Tujuan dari pengenceran bertingkat yaitu memperkecil atau mengurangi jumlah mikroba yang tersuspensi dalam cairan. Penentuan besarnya atau banyaknya tingkat pengenceran tergantung kepada perkiraan jumlah mikroba dalam sampel. Digunakan perbandingan 1 : 9 untuk sampel dan pengenceran pertama dan selanjutnya, sehingga pengenceran berikutnya mengandung 1/10 sel mikroorganisma dari pengenceran sebelumnya. Cara Kerja : a. Sampel yang mengandung bakteri dimasukan ke dalam tabung pengenceran pertama (1/10 atau 10-1) secara aseptis (dari preparasi suspensi). Perbandingan berat sampel dengan volume tabung pertama adalah 1 : 9 dan ingat akuades yang digunakan jika memakai teknik rinse dan swab sudah termasuk pengencer 10-1. Setelah sampel masuk lalu dilarutkan dengan mengocoknya (pengocokan yang benar dapat dilihat pada gambar disamping) b. Diambil 1 ml dari tabung 10-1 dengan pipet ukur kemudian dipindahkan ke tabung 10-2 secara aseptis kemudian dikocok dengan membenturkan tabung ke telapak tangan sampai homogen. Pemindahan dilanjutkan hingga tabung pengenceran terakhir dengan cara yang sama, hal yang perlu diingat bahwa pipet ukur yang digunakan harus selalu diganti, artinya setiap tingkat pengenceran digunakan pipet ukur steril yang berbeda/baru. Prinsipnya bahwa pipet tidak perlu diganti jika memindahkan cairan dari sumber yang sama. 3. Teknik Penanaman a. Teknik penanaman dari suspensi Teknik penanaman ini merupakan lajutan dari pengenceran bertingkat. Pengambilan suspensi dapat diambil dari pengenceran mana saja tapi biasanya untuk tujuan isolasi (mendapatkan koloni tunggal) diambil beberapa tabung pengenceran terakhir. a.1. Spread Plate (agar tabur ulas) Spread plate adalah teknik menanam dengan menyebarkan suspensi bakteri di permukaan agar diperoleh kultur murni. Adapun prosedur kerja yang dapat dilakukan adalah sebagai berikut :
31
Ambil suspensi cairan senamyak 0,1 ml dengan pipet ukur kemudian teteskan diatas permukaan agar yang telah memadat. Batang L atau batang drugal diambil kemudian disemprot alkohol dan dibakar diatas bunsen beberapa saat, kemudian didinginkan dan ditunggu beberapa detik. Kemudian disebarkan dengan menggosokannya pada permukaan agar supaya tetesan suspensi merata, penyebaran akan lebih efektif bila cawan ikut diputar. Hal yang perlu diingat bahwa batang L yang terlalu panas dapat menyebabkan sel-sel mikroorganisme dapat mati karena panas.
a.2. Pour Plate (agar tuang) Teknik ini memerlukan agar yang belum padat (>45oC) untuk dituang bersama suspensi bakteri ke dalam cawan petri lalu kemudian dihomogenkan dan dibiarkan memadat. Hal ini akan menyebarkan sel-sel bakteri tidak hanya pada permukaan agar saja melainkan sel terendam agar (di dalam agar) sehingga terdapat sel yang tumbuh dipermukaan agar yang kaya O2 dan ada yang tumbuh di dalam agar yang tidak banyak begitu banyak mengandung oksigen. Adapun prosedur kerja yang dilakukan adalah sebagai berikut :
Siapkan cawan steril, tabung pengenceran yang akan ditanam dan media padat yang masih cair (>45oC) Teteskan 1 ml secara aseptis.suspensi sel kedalam cawan kosong Tuangkan media yang masih cair ke cawan kemudian putar cawan untuk menghomogenkan suspensi bakteri dan media, kemudian diinkubasi.
32
Alasan diteteskannya bakteri sebanyak 0,1 ml untuk spread plate dan 1 ml untuk pour plate karena spread plate ditujukan untuk menumbuhkan dipermukaanya saja, sedangkan pour plate membutuhkan ruang yang lebih luas untuk penyebarannya sehingga diberikan lebih banyak dari pada spread plate.
b. Teknik Penanaman dengan Goresan (Streak) Bertujuan untuk mengisolasi mikroorganisme dari campurannya atau meremajakan kultur ke dalam medium baru. b.1 Goresan Sinambung Cara kerja :
Sentuhkan inokulum loop pada koloni dan gores secara kontinyu sampai setengah permukaan agar. Jangan pijarkan loop, lalu putar cawan 180oC lanjutkan goresan sampai habis.
Goresan sinambung umumnya digunakan bukan untuk mendapatkan koloni tunggal, melainkan untuk peremajaan ke cawan atau medium baru.
b.2 Goresan T Cara kerja :
Bagi cawan menjadi 3 bagian menggunakan spidol marker Inokulasi daerah 1 dengan streak zig-zag Panaskan jarum inokulan dan tunggu dingin, kemudian lanjutkan streak zigzag pada daerah 2 (streak pada gambar). Cawan diputar untuk memperoleh goresan yang sempurna Lakukan hal yang sama pada daerah 3
33
B.3 Goresan Kuadran (Streakquadrant) Cara kerja : Hampir sama dengan goresan T, namun berpola goresan yang berbeda yaitu dibagi empat. Daerah 1 merupakan goresan awal sehingga masih mengandung banyak sel mikroorganisma.Goresan selanjutnya dipotongkan atau disilangkan dari goresan pertama sehingga jumlah semakin sedikit dan akhirnya terpisah-pisah menjadi koloni tunggal.
Cara Kerja Isolasi Bakteri dari Sampel Tanah : 1. Tanah seberat 1 g dimasukan ke dalam tabung pengenceran 10-1 secara aseptis dan selanjutnya dilakukan pengenceran bertingkat sampai 10-8 2. Tiga pengenceran terakhir diambil 0,1 ml untuk ditanam secara spread plate pada medium NA, setelah selesai, diinkubasi pada 37oC selama 1x24 jam 3. Koloni akan tumbuh pada ketiga cawan tersebut kemudian dipilih koloni yang relatif terpisah dari koloni lain dan koloni yang mudah dikenali 4. Koloni yang terpilih kemudian ditumbuhkan atau dimurnikan ke NA baru dengan teknik streak kuadran 5. Inkubasi 1x24 jam.
34
Cara Kerja Isolasi Jamur dari Tanah : 1. Tanah dalam cawan petri dipanaskan dengan oven pada suhu 80oC selama 30 menit dengan cawan petri untuk membunuh sel vegetatiftetap bertahan 2. Tanah yang telah dioven diambil 1 g kemudian dimasukan ke dalam tabung pengenceran bertingkat 3. Tiga pengenceran terakhir diambil untuk ditanama secara spread plate ke media PDA yang ditambah streptomycin atau penicillin. Kemudian diinkubnasi pada suhu ruang 5-7 hari 4. Koloni jamur yang tumbuh dimurnikan dan ditanam pada medium PDA baru, 5. Inkubasi pada suhu ruang 5-7 hari.
Biakan Penyuburan: Digunakan untuk meningkatkan peluang terisolasinya suatu organisme yang mempunyai beberapa ciri fisiologi atau biokimiawi yang unik. Langkahnya adalah sebagai berikut:
Lakukan pemindahan biakan secara berturut-turut (5-6 kali) dalam medium berisikan nutrient yang dikehendaki Tanam pada media agar yang berisi nutrient yang sama lalu isolasi koloninya.
35
Bab 4 Morfologi Mikroorganisme Mikroorganisme atau mikroba adalah organisme yang berukuran sangat kecil sehingga untuk mengamatinya diperlukan alat bantu. Mikroorganisme disebut juga organisme mikroskopik . Mikroorganisme seringkali bersel tunggal (uniseluler) maupun bersel banyak (multiseluler) . Namun, beberapa protista bersel tunggal masih terlihat oleh mata telanjang dan ada beberapa spesies multisel tidak terlihat mata telanjang. Virus juga termasuk ke dalam mikroorganisme meskipun tidak bersifat seluler .
Perbandingan ukuran sel prokariot dengan sel lain dan biomolekul (skala logaritma)
Bakteri A. Mengamati Morfologi Bakteri Struktur bakteri terbagi menjadi dua yaitu: 1. Struktur dasar (dimiliki oleh hampir semua jenis bakteri) Meliputi: dinding sel, membran plasma, sitoplasma, ribosom, DNA, dan granula penyimpanan 2. Struktur tambahan (dimiliki oleh jenis bakteri tertentu) Meliputi kapsul, flagelum, pilus, fimbria, klorosom, Vakuola gas dan endospora. Struktur dasar sel bakteri: 1. Dinding sel tersusun dari peptidoglikan yaitu gabungan protein dan polisakarida (ketebalan peptidoglikan membagi bakteri menjadi bakteri
36
gram positif bila peptidoglikannya tebal dan bakteri gram negatif bila peptidoglikannya tipis). 2. Membran plasma adalah membran yang menyelubungi sitoplasma tersusun atas lapisan fosfolipid dan protein. 3. Sitoplasma adalah cairan sel. 4. Ribosom adalah organel yang tersebar dalam sitoplasma, tersusun atas protein dan RNA. 5. Granula penyimpanan, karena bakteri menyimpan cadangan makanan yang dibutuhkan.
Struktur tambahan bakteri : 1. Kapsul atau lapisan lendir adalah lapisan di luar dinding sel pada jenis bakteri tertentu, bila lapisannya tebal disebut kapsul dan bila lapisannya tipis disebut lapisan lendir. Kapsul dan lapisan lendir tersusun atas polisakarida dan air. 2. Flagelum atau bulu cambuk adalah struktur berbentuk batang atau spiral yang menonjol dari dinding sel. 3. Pilus dan fimbria adalah struktur berbentuk seperti rambut halus yang menonjol dari dinding sel, pilus mirip dengan flagelum tetapi lebih pendek, kaku dan berdiameter lebih kecil dan tersusun dari protein dan hanya terdapat pada bakteri gram negatif. Fimbria adalah struktur sejenis pilus tetapi lebih pendek daripada pilus. 4. Klorosom adalah struktur yang berada tepat dibawah membran plasma dan mengandung pigmen klorofil dan pigmen lainnya untuk proses fotosintesis. Klorosom hanya terdapat pada bakteri yang melakukan fotosintesis.
37
5. Vakuola gas terdapat pada bakteri yang hidup di air dan berfotosintesis. 6. Endospora adalah bentuk istirahat (laten) dari beberapa jenis bakteri gram positif dan terbentuk didalam sel bakteri jika kondisi tidak menguntungkan bagi kehidupan bakteri. Endospora mengandung sedikit sitoplasma, materi genetik, dan ribosom. Dinding endospora yang tebal tersusun atas protein dan menyebabkan endospora tahan terhadap kekeringan, radiasi cahaya, suhu tinggi dan zat kimia. Jika kondisi lingkungan menguntungkan endospora akan tumbuh menjadi sel bakteri baru. B. Mengamati Morfologi Koloni Bakteri Kegiatan ini merupakan tindakan pertama kali jika ingin mempelajari suatu jenis bakteri lebih lanjut, khususnya untuk tujuan identifikasi. Setelah mendapatkan kultur murni maka biakan yang diinginkan ditumbuhkan ke berbagai bentuk media untuk dikenali ciri koloninya. Cara Kerja : · Tumbuhkan biakan pada media NA cawan dengan streak kuadran · Tumbuhkan biakan pada media NA miring dengan pola inokulasi yang tegak lurus · Tumbuhkan biakan pada media NA tegak dengan stabinoculation · Tumbuhkan biakan pada media NB
A.1. Pertumbuhan pada Cawan Petri Ciri-ciri yang perlu diperhatikan adalah sebagai berikut : · Ukuran; a. pinpoint/punctiform (titik) b. Small (kecil) c. Moderate (sedang) d. Large (besar)
a b c d
· Pigmentasi : mikroorganisme kromogenik sering memproduksi pigmen intraseluler, beberapa jenis lain memproduksi pigmen ekstraseluler yang dapat terlarut dalam media
38
· Karakteristik optik : diamati berdasarkan jumlah cahaya yang melewati koloni. a. Opaque (tidak dapat ditembus cahaya) b. Translucent (dapat ditembus cahaya sebagian) c. Transparant (bening)
· Bentuk : a. b. c. d. e.
Circular Irregular Spindle Filamentous Rhizoid
a
b c d
e
- Elevasi : a. b. c. d.
Flat Raised Convex Umbonate
a b
c
d
· Permukaan : a. b. c. d.
Halus mengkilap Kasar Berkerut Kering seperti bubuk
39
· Margins : 1. Entire 2. Lobate 3. Undulate 4. Serrate 5. Felamentous 6. Curled
1 2
3 4 6
A.2. Pertumbuhan pada Agar Miring Ciri-ciri koloni diperoleh dengan menggoreskan jarum inokulum tegak dan lurus Ciri koloni berdasarkan bentuk:
A.3 Pertumbuhan pada Agar Tegak Cara penanaman adalah dengan menusukkan jarum inokulum needle ke dalam media agar tegak. Ciri-ciri koloni berdasar bentuk :
40
Ciri koloni berdasar kebutuhan O2 :
A.4 Pertumbuhan pada Media Cair Pola pertumbuhan berdasarkan kebutuhan O2
A. Mengamati Morfologi Bakteri Sel bakteri dapat teramati dengan jelas jika digunakan mikroskop dengan perbesaran 100x10 yang ditambah minyak imersi. Jika dibuat preparat ulas tanpa pewarnaan, sel bakteri sulit terlihat. Pewarnaan bertujuan untuk memperjelas sel bakteri dengan menempelkan zat warna ke permukaan sel bakteri. Zat warna dapat mengabsorbsi dan membiaskan cahaya, sehingga kontras sel bakteri dengan sekelilingnya ditingkatkan. Zat warna yang digunakan bersifat asam atau basa. Pada zat warna basa, bagian yang berperan dalam memberikan warna disebut kromofor dan mempunyai muatan positif. Sebaliknya pada zat warna asam bagian yang berperan memberikan zat warna memiliki muatan negatif. Zat warna basa lebih banyak digunakan karena muatan negatif banyak banyak ditemukan pada permukaan sel. Contoh zat warna 41
asam antara lain Crystal Violet, Methylene Blue, Safranin, Base Fuchsin, Malachite Green dll. Sedangkan zat warna basa antara lain Eosin, Congo Red dll.
Pewarnaan Pewarnaan sederhana pewarnaan positif pewarnaan negatif
Pewarnaan diferensial pewarnaan gram pewarnaan acid fast dll.
Pewarnaan khusus pewarnaan endospora pewarnaan flagella dll.
B.1. Pewarnaan Sederhana (Pewarnaan Positif) Merupakan pewarnaan yang hanya menggunakan satu jenis zat pewarna (tunggal). Misalnya metylen blue, Carbol fuchsin, dll. Sebelum dilakukan pewarnaan dibuat ulasan bakteri di atas object glass yang kemudian difiksasi. Jangan menggunakan suspensi bakteri yang terlalu padat, tapi jika suspensi bakteri terlalu encer, maka akan diperoleh kesulitan saat mencari bakteri dengan mikroskop. Fiksasi bertujuan untuk mematikan bakteri dan melekatkan sel bakteri pada object glass tanpa merusak struktur selnya. Cara Kerja : · Bersihkan object glass dengan kapas · Jika perlu tulislah kode atau nama bakteri pada sudut object glass · Bila menggunakan biakan cair maka pindahkan setetes biakan dengan pipet tetes atau dapat juga dipindahkan dengan jarum inokulum. Jangan lupa biakan dikocok terlebih dahulu. Jika digunakan biakan padat, maka biakan dipindahkan dengan jarum inokulum, satu ulasan saja kemudian diberi akuades dan disebarkan supaya sel merata. · Keringkan ulasan tersebut sambil memfiksasinya dengan api bunsen (lewatkan di atas api 2-3 kali) · Setelah benar-benar kering dan tersebar selanjutnya ditetesi dengan pewarna (dapat digunakan Methylen blue, Safranin, CrystalViolet) dan tunggu kurang lebih 30 detik. · Cuci dengan akuades kemudian keringkan dengan kertas tissue · Periksa dengan mikroskop (perbesaran 100 x 10).
42
B.2 Pewarnaan Negatif Beberapa bakteri sulit diwarnai dengan zat warna basa. Tapi mudah dilihat dengan pewarnaan negatif. Zat warna tidak akan mewarnai sel melainkan mewarnai lingkungan sekitarnya, sehingga sel tampak transparan dengan latar belakang hitam. Prosedur: 1. Ambil dua object glass, teteskan nigrosin atau tinta cina di ujung kanan salah satu object glass 2. Biakan diambil lalu diulaskan atau diteteskan dalam tetesan nigrosin tadi, lalu dicampurkan 3. Tempelkan sisi object glass yang lain kemudian gesekkan ke samping kiri 4. Biarkan preparat mengering di udara, jangan difiksasi atau dipanaskan di atas api.
1
2
43
3
4 5. Setelah dilihat di mikroskop, maka akan tampak bentuk sel bakteri.
A.3. Pewarnaan Gram Adalah pewarnaan diferensial yang sangat berguna dan paling banyak digunakan dalam laboratorium mikrobiologi, karena merupakan tahapan penting dalam langkah awal identifikasi. Pewarnaan ini didasarkan pada tebal atau tipisnya lapisan peptidoglikan di dinding sel dan banyak sedikitnya lapisan lemak pada membran sel bakteri. Jenis bakteri berdasarkan pewarnaan gram dibagi menjadi dua yaitu gram positif dan gram negatif. Bakteri gram positif memiliki dinding sel yang tebal dan membran sel selapis. Sedangkan baktri gram negatif mempunyai dinding sel tipis yang berada di antara dua lapis membran sel. Berikut merupakan tabel prosedur pewarnaan Gram:
44
Dengan metode ini, biasanya bakteri Gram (+) berwarna ungu dan Gram (-) berwarna merah. Perbedaan tersebut karea perbedaan struktur dinding sel bakteri Gram (+) yang mengandung peptidoglikan dan Gram (-) yang mengandung kadar lipid yang tinggi sehingga terjadi perbedaan reaksi dalam permiabilitas zat warna dan penambahan zat pemucat. Hal-hal yang perlu diperhatikan dalam pewarnaan gram adalah sbb: a.
Fase yang paling kritis dari prosedur di atas adalah tahap dekolorisasi yang mengakibatkan CV-iodine lepas dari sel. Pemberian ethanol jangan sampai
45
berlebih yang akan menyebabkan overdecolorization sehingga sel gram positif tampak seperti gram negatif. Namun juga jangan sampai terlalu sedikit dalam penetesan etanol (underdecolorization) yang tidak akan melarutkan CV-iodine secara sempurna sehingga sel gram negatif seperti gram positif. b. Preparasi pewarnaan gram terbaik adalah menggunakan kultur muda yang tidak lebih lama dari 24 jam. Umur kultur akan berpengaruh pada kemampuan sel menyerap warna utama (CV), khususnya pada gram positif. Mungkin akan menampakkan gram variabel yaitu satu jenis sel, sebagian berwarna ungu dan sebagian merah karena pengaruh umur. Walaupun ada beberapa species yang memang bersifat gram variabel seperti pada genus Acinetobacter dan Arthrobacter. PERBEDAAN BAKTERI GRAM POSITIF DAN GRAM NEGATIF: PERBEDAAN RELATIF CIRI GRAM POSITIF GRAM NEGATIF Tebal (15-80 nm), berlapis Tipis (10-15 nm), berlapis Sturktur dinding sel tunggal (mono) tiga (multi) Kandungan lipid tinggi (11Kandungan lipid rendah (1-4 22%), peptidoglikan ada di %), peptidoglikan ada Komposisi dinding sel dalam lapisan kaku sebagai lapisan tunggal, ada sebelah dalam, tidak ada asam tekoat aam tekoat Kerentanan terhadap Lebih rentan Krang rentan penisilin Pertumbuhan dihambat oleh warnaPertumbuhan dihambat Pertumbuhan tidak begitu warna dasar (seperti dengan nyata dihambat Kristal ungu) Relative rumit pada banyak Persyaratan nutrisi Relative sederhana spesies Resistensi terhadap Lebih resisten Kurang resisten gangguan fisik Asam tekoat = polimer gliserol dan ribitol fosfat menempel pada peptodoglikan atau membran sitoplasma. Fungsi asam teikoat (muatan negatif) adalah : • untuk transport ion positif dari dan keluar sel • penyimpanan fosfor B.4. Pewarnaan Endospora Anggota dari genus Clostridium, Desulfomaculatum dan Bacillus adalah bakteri yang memproduksi endospora dalam siklus hidupnya. Endospora merupakan 46
bentuk dorman dari sel vegetatif, sehingga metabolismenya bersifat inaktif dan mampu bertahan dalam tekanan fisik dan kimia seperti panas, kering, dingin, radiasi dan bahan kimia. Tujuan dilakukannya pewarnaan endospora adalah membedakan endospora dengan sel vegetatif, sehingga pembedaannya tampak jelas. Endospora tetap dapat dilihat di bawah mikroskop meskipun tanpa pewarnaan dan tampak sebagai bulatan transparan dan sangat refraktil. Namun jika dengan pewarnaan sederhana, endospora sulit dibedakan dengan badan inklusi (kedua-duanya transparan, sel vegetatif berwarna), sehingga diperlukan teknik pewarnaan endospora. Berikut merupakan prosedur pewarnaan endospora dengan metode Schaeffer-Fulton.
47
48
Berikut merupakan beberapa tipe endospora dan contohnya
B.5. Pewarnaan Khusus (Pewarnaan Bakteri Tahan Asam)/ BTA Bakteri-bakteri tahan asam memiliki lapisan lipid/lemak yang tebal dalam dinding selnya sehingga menyebabkan dinding sel bakteri tersebut relatif tidak permeable terhadap zat warna yang umum sehingga sel-sel tersebut tidak terwarnai oleh metode pewarnaan biasa. Pada pewarnaan ini, mikroorganisme dapat menahan zat warna yang tidak terpucatkan oleh asam alcohol sehingga dikatakan tahan asam dan tampak merah, sedangkan yang tidak tahan asam (terpucatkan) akan berwarna biru. Metode yang paling sering digunakan adalah Zeihl-Nelssen dan Kinyoun Gabbet/ Tan Thiam Hok.
C. Mengamati motilitas C.1 Pengamatan Langsung Cara Kerja :
49
· Teteskan biakan bakteri motil seperti Bacillus atau E.coli ke object glass (sebaiknya dari biakan cair). Jika digunakan biakan padat maka ulas dengan jarum inokulum lalu ditambah akuades satu tetes, ratakan. · Tutup dengan cover glass · Amati menggunakan mikroskop dengan perbesaran maksimak. Bakteri akan tampak transparan dan pola pergerakannya tidak beraturan. Hati-hati jangan salah membedakan antara sel yang bergerak sendiri karena flagel atau bergerak terkena aliran air.
C.2 Pengamatan tidak langsung Cara Kerja : · Tanam biakan pada media NA tegak atau Media Motilitas dengan cara tusuk (Stab inoculation) sedalam + 5 mm. · Inkubasi pada suhu 370 C selama 1x 24 jam · Hasil positif (motil) jika bakteri tumbuh pada seluruh permukaan media, hasil negatif menunjukan bakteri hanya tumbuh pada daerah tusukan saja Bakteri motil akan bermigrasi ke seluruh permukaan agar dan bekas tusukan
ARKEA Diameter arkea berkisar antara 0,1 mikrometer (μm) hingga 15 μm dan terdapat dalam berbagai bentuk seperti bulat, berbentuk seperti tongkat, spiral, seperti lempengan, filament seperti jarum atau persegi. Struktur selnya mirip bakteri gram positif, tapi komponen selnya berbeda serta mempunyai flagella.
50
Salah satu jenis arkea yang hidup di sumber air panas sebuah gunung berapi.
PROTOZOA Ukuran tubuh protozoa biasanya berkisar antara 10-50 μm, tetapi dapat tumbuh sampai 1 mm, dan mudah dilihat di bawah mikroskop. Protozoa ada yang bergerak dengan flagela da nada yang menggunakan silia. Lebih dari 30.000 jenis telah ditemukan. Protozoa terdapat di seluruh lingkungan berair dan tanah, tubuh protozoa amat sederhana, yaitu terdiri dari satu sel tunggal (unisel). Namun demikian, Protozoa merupakan sistem yang serba bisa. Semua tugas tubuh dapat dilakukan oleh satu sel saja tanpa mengalami tumpang tindih. Bentuk tubuh macam-macam, ada yang seperti bola, bulat memanjang, atau seperti sandal bahkan ada yang bentuknya tidak menentu. Protozoa adalah mikroorganisme menyerupai hewan yang merupakan salah satu filum dari Kingdom Protista. Seluruh kegiatan hidupnya dilakukan oleh sel itu sendiri dengan menggunakan organel-organel antara lain membran plasma, sitoplasma, dan mitokondria. Ciri-ciri umum :
Organisme uniseluler (bersel tunggal)
Eukariotik (memiliki membran nukleus)
Hidup soliter (sendiri) atau berkoloni (kelompok)
Umumnya tidak dapat membuat makanan sendiri (heterotrof)
Hidup bebas, saprofit atau parasit
Dapat membentuk sista untuk bertahan hidup
Alat gerak berupa pseudopodia, silia, atau flagela
Semua protozoa mempunyai vakuola kontraktil. Vakuola dapat berperan sebagai pompa untuk mengeluarkan kelebihan air dari sel, atau untuk mengatur tekanan osmosis. Jumlah dan letak vakuola kontraktil berbeda pada setiap spesies. Protozoa dapat berada dalam bentuk vegetatif (trophozoite), atau bentuk istirahat yang disebut kista. Protozoa pada keadaan yang tidak menguntungkan dapat membentuk kista untuk mempertahankan hidupnya. Saat kista berada pada keadaan yang menguntungkan, maka akan berkecambah menjadi
sel
vegetatifnya.
Protozoa
tidak
mempunyai
mengandung selulosa atau khitin seperti pada jamur dan algae.
51
dinding
sel,
dan
tidak
Yeast / Khamir A. Mengamati morfologi koloni yeast Sel khamir dapat tumbuh setelah ditanamkan pada media agar selama 1 sampai 3 hari. Selama waktu tersebut, khamir akan menghasilkan koloni berwarna pucat keruh dan umumnya mempunyai diameter anatar 0.5 sampai 3.0 mm. Sebagaian kecil species dapat menghasilkan pigmen, tetapi kebanyakan hanya menghasilkan warna krem. Dibawah mikroskop dan secara morfologi koloni , kebanyakan species khamir sulit dibedakan karena perbedaannya yang sangat kecil. Untuk membedakannya seringkali harus dilakukan tes fisiologi. Ragi dengan nilai ekonomi paling penting yang saat ini dikenal adalah khamir yang digunakan dalam pembuatan roti (‘baker’s’) dan dalam pembuatan bir (‘brewer’s’), yang merupakan anggota dari genus Saccharomyces.
Hal-hal yang perlu diperhatikan dalam mengidentifikasi khamir adalah: 1. Ada tidaknya askospora, kalau ada bagaimana pembentukannya (konyugasi isogami, heterogami, atau konyugasi askospora), bentuk, warna, ukuran, dan jumlah spora. 2. Bentuk, warna, dan ukuran sel vegetatifnya. 3. Cara reproduksi aseksual (bertunas, membelah, dsb) 52
4. Ada tidaknya filamen atau pseudomiselium. 5. Pertumbuhan dalam medium dan warna koloninya. 6. Sifat-sifat fisiologi, misalnya sumber karbon (C) dan nitrogen (N), kebutuhan vitamin, bersifat oksidatif atau fermentatif, atau keduanya, lipolitik, uji pembentukan asam, penggunaan pati, dan lain-lain. Berikut ini merupakan cara pengamatan morfologi khamir: a. Tanam biakan yeast (dapat berupa Sacharomyces cereviceae atau Candida albicans) pada PDA dengan cara streakquadrant. b. Inkubasi selama 2x24 jam. c. Setelah didapatkan koloni tunggal, pengamatan ciri-ciri morfologi koloni hampir sama dengan ciri morfologi bakteri. B. Mengamati Morfologi Sel Yeast Yeast merupakan fungi mikroskopik uniseluler, tidak membentuk hifa (beberapa spesies dapat membentuk pseudohifa). Bentuk selnya bervariasi dapat berbentuk bulat, bulat telur, bulat memanjang dengan ukuran 1-9x20 μm. Beberapa spesies yeast memiliki sifat dimorfisme yaitu bentuk sel tunggal dan bentuk hifa atau pseudohifa. Pseudohifa adalah hifa yeast yang terbentuk dari rangkaian sel hasil pembelahan aseksual secara budding, tetapi tidak melepaskan diri dari induk. Morfologi internal sel mudah dilihat dan terdiri dari inti dan organel seperti mitkondria, grannula lemak dan glikogen. B.1 Melihat bentuk sel Yeast Cara Kerja : · Tumbuhkan Sacharomyces cereviceae pada glukosa cair selama 24 jam. · Ulaskan suspensi biakan pada object glass lalu teteskan Methilene Blue hingga rata (jangan difiksasi). · Tutup preparat dengan cover glass. · Amati dengan perbesaran 40x10 atau 100x10. B.2 Melihat bentuk spora sel Yeast Cara kerja : · Buat preparat ulas dari biakan yeast pada Goodkowa Agar yang berumur 10 hari. · Fiksasi dengan api bunsen. · Warnai dengan cara Shager dan Fulgen yaitu:
53
Tetesi preparat dengan MalachiteGreen dan biarkan 30-60 detik. Panasi preparat dengan api bunsen selama + 30 detik (sampai timbul uap). Cuci preparat dengan air mengalir. Keringkan dengan tissue kemudian biarkan pada udara terbuka. Amati di bawah mikroskop. Perhatikan spora yang berwarna Kapang / Jamur Jamur merupakan mikroba dengan struktur talus berupa benang-benang (hifa) yang terjalin seperti jala (myselium). Hifa dapat berekat (septat) dengan inti tunggal/ lebih dan hifa tidak bersekat (aseptat). Penampakan morfologi koloni pada
umumnya
pertumbuhannya
seperti
benang
membentuk
(filamentous)
lingkaran.
yang
Morfologi
koloninya dapat dengan mudah dibedakan dengan bakteri walaupun ada beberapa jenis bakteri yang koloninya mirip jamur, seperti dari kelompok Actinomycetes atau Bacillus mycoides. Koloni kapang memiliki keragaman warna yang muncul dari sporanya. A. Mengamati morfologi koloni kapang Cara kerja : · Tanam/pindahkan biakan kapang dengan jarum inokulum needle yang diletakan di tenganh-tengah cawan petri. · Inkubasi selam beberapa hari. · Amati pertumbuhan koloni (miselium) yang menyebar. B. Mengamati sel morfologi kapang dengan metode SlideCulture (Microculture) Teknik ini bertujuan untuk mengamati sel kapang dengan menumbuhkan spora pada object glass yang ditetesi media pertumbuhan. Pengamatan struktur spora dan miselium dapat juga dilakukan dengan preparat ulas seperti yang telah diuraikan di depan. Namun seringkali miselium atau susunan spora menjadi pecah atau terputus sehingga penampakan di mikroskop dapat membingungkan. Dengan teknik ini, spora dan miselium tumbuh langsung pada slide sehingga dapat mengatasi masalah tersebut.
54
B.1 Metode Heinrich’s, cara kerja : a. Siapkan object glass, cover glass, tissue basah yang dimasukkan dalam cawan dan sterilkan dengan autoclave. b. Setelah selesai sterilisasi berikan lilin (parafin-petrolatum) steril pada sebelah kiri dan kanan tempat yang akan ditutup cover glass (aseptis). c. Tutup dengan cover glass. d. Teteskan suspensi spora jamur dalam media cair pada media cover glass yang tidak diberi lilin. Berikan sampai setengah luasan cover glass. Tekan cover galss secara media merata. e. Inkubasi pada suhu kamar selama 3x24 jam. f. Ambil preparat dan amati di bawah mikroskop.
B. 2 Metode Riddel, cara kerja : a. Persiapan sama seperti di atas b. Setelah semua steril, potong media Saboraud Dextrose Agar steril berbentuk kubus dan letakkan di atas object glass. c. Inokulasikan spora jamur pada bagian atau potongan agar. d. Tutup potongan agar dengan cover glass. e. Inkubasi pada suhu kamar selama 3x24 jam. f. Ambil preparat dan diamati di bawah mikroskop.
55
B.3 Prosedur yang lebih sederhana, cara kerja : a. Sterilkan cawan petri yang berisi kapas yang di atasnya terdapat object glass dan cover glass. b. Siapkan media PDA dan dijaga supaya tetap cair. c. Teteskan media PDA pada object glass secara aseptis lalu tunggu memadat (teteskan jangan terlalu banyak). d. Belah media yang memadat dengan jarum inokulum yang berujung L. e. Ulaskan spora jamur yang akan diamati pada belahan tersebut. f. Tutup dengan cover glass tepat di atas media dan tekan hingga merata. g. Inkubasi selama 2x24 jam. h. Amati pertumbuhan miselium dan spora pada object glass dengan perbesaran sedang
56
MIKROBA YANG PENTING DALAM INDUSTRI FERMENTASI 1. BAKTERI a. Acetobacter aceti. Bakteri ini penting dalam produksi asam asetat dengan mengoksidasi alkohol sehingga menjadi asam asetat. Banyak terdapat pada ragi tapai, yang menyebabkan tapai yang melewati dua hari fermentasi akan menjadi berasa asam b. Acetobacter xylinum.Bakteri ini digunakan dalam pembuatan nata de coco. A.xylinum mampu mensintesis selulosa dari gula yang dikonsumsi. Bakteri ini juga terdapat pada produk kombucha yaitu fermentasi dari teh c. Bacillus sp. Merupakan genus dengan kemampuan yang paling luas. Pada mulanya hanya digunakan untuk menghasilkan enzim amylase, namun berkembang untuk bioinsektisida yang diwakili oleh Bacillus thuringiensis maupun untuk penanganan limbah seperti B. subtilis dan B. megaterium, juga digunakan untuk memproduksi bahan baku plastik ramah lingkungan. d. Bividobacterium sp. Bersifat anaerob dan digunakan sebagai mikrobia probiotik, yaitu mikroba yang dikonsumsi untuk mengatur keseimbangan flora usus. e. Lactobacillus sp. Digunakan dalam produksi asam laktat, fermentasi pangan seperti yoghurt, sauerkraut dan juga produk probiotik. Asam laktat dari bakteri ini dapat juga dibuat poli asam laktat sebagai bahan baku plastic ramah lingkungan. 2. KHAMIR a. Saccharomyces cerevisiae, digunakan dalam industry wine dan pengembang adonan roti b. Saccharomyces roxii, digunakan dalam pembuatan kecap dan berkontribusi pada pembentukan aroma 3. JAMUR/ KAPANG a. Aspergillus niger,digunakan dalam pembuatan asam sitrat (pada pembuatan permen dan minuman kemasan), sering mengkontaminasi makanan misalnya roti tawar. b. Rhizopus oryzae, penting dalam pembuatan tempe c. Neurospora sitophila, merupakan sumber beta karoten pada fermentasi tradisional seperti produksi oncom. d. Monascus purpureus, dalam pembuatan angkak (fermentasi pada beras). Jamur ini menghasilkan pewarna alami yang umumnya digunakan pada masakan cina. e. Penicillium sp., mampu menghasilkan antibiotic yang disebut penisilin.
57
Bab 5 Pemindahan & Pengawetan Mikroorganisme Di samping beragam jenisnya, mikroba juga sangat mudah mengalami perubahan sifat sehingga menjadi strain baru yang berbeda dengan aslinya. Dalam melaksanakan kegiatan ilmiahnya, para pakar mikrobiologi dan pakar ilmu yang terkait seperti pakar fitopatologi dan entomologi perlu mempunyai koleksi plasma nutfah mikroba, baik untuk digunakan sehari-hari, untuk jangka menengah, maupun jangka panjang. Oleh karena itu, perlu melakukan koleksi, menyimpan, dan memelihara mikroba dengan baik. Para ilmuwan tersebut perlu memiliki metode pembuatan dan penyimpanan koleksi (preservasi) yang sesuai untuk menjaga agar biakan mikroba tetap hidup, ciri-ciri genetiknya tetap stabil dan tidak berubah, serta hemat biaya dan tenaga. Metode yang dipilih sangat tergantung pada sifat mikroba dan tujuan preservasi. Sifat mikroba tercermin dalam: (1) ciri-ciri morfologi mikroba yang beragam (virus, bakteri, jamur, nematoda, algae, khamir, dan protozoa) (2) ciri-ciri fisiologi dan biokimia mikroba (3) kemampuan mikroba bertahan hidup baik dalam lingkungan alaminya maupun lingkungan buatan. Tujuan koleksi dan preservasi meliputi tujuan jangka pendek dan jangka panjang.: 1.
Preservasi jangka pendek dilakukan untuk keperluan rutin penelitian yang disesuaikan dengan kegiatan program atau proyek tertentu.
2. Preservasi jangka panjang dilakukan dalam kaitannya dengan koleksi dan
konservasi plasma nutfah mikroba, sehingga apabila suatu saat diperlukan, dapat diperoleh kembali atau dalam keadaan tersedia. 58
Keberhasilan pembuatan koleksi plasma nutfah mikroba tergantung pada tiga faktor, yaitu: (1) penguasaan teknologi (2) ketersediaan fasilitas preservasi (3) ketersediaan tenaga terampil, tekun, dan rutin.
Tujuan utama preservasi, yaitu: (1) mereduksi atau mengurangi laju metabolisme dari mikroorganisme hingga sekecil mungkin dengan tetap mempertahankan viabilitas (daya hidupnya) (2) memelihara sebaik mungkin biakan, sehingga diperoleh angka perolehan (recovery) dan kehidupan (survival) yang tinggi dengan perubahan ciri-ciri yang minimum. CARA PENYIMPANAN: 1. Penyimpanan jangka pendek mikroba dilakukan dengan memindahkan
secara berkala jangka pendek misalnya sebulan sekali dari media lama ke media baru. Teknik ini memerlukan waktu dan tenaga yang banyak. Beberapa teknik penyimpanan sederhana yang efektif untuk penyimpanan isolat jangka pendek atau menengah, dan biasanya tidak sesuai untuk penyimpanan jangka panjang. Di antara teknik tersebut ialah penyimpanan dalam minyak mineral, parafin cair, tanah steril, air steril, manik-manik porselin, lempengan gelatin, dan P2O5 dalam keadaan vakum. 2. Metode penyimpanan jangka panjang yang paling efektif dan banyak dilakukan ialah metode liofilisasi atau kering beku Qiophylization atau freeze drying) dan kriopreservasi (cryopreservation atau cryogenic preservation). Kedua teknik tersebut dilaporkan paling berhasil untuk penyimpanan jangka panjang berbagai mikroba. Kendala utamanya adalah tidak semua laboratorium mempunyai peralatan tersebut. Tahapan dalam pembuatan koleksi dan preservasi plasma nutfah mikroba pada dasamya sama, yaitu meliputi koleksi contoh mikroba, isolasi (pemurnian), dan karakterisasi isolat, preservasi, pemeliharaan dan pembuatan bank data.Penyimpanan kultur mempunyai prinsip bahwa mikroba tetap hidup tetapi secara biologi tidak aktif dan mutasi tidak terjadi selama penyimpanan yang lama. Untuk menyimpan kultur dapat digunakan cara sebagai berikut:
59
1. Ekstrak tanah agar Agar lunak (3 g/L) yang mengandung ekstrak tanah (1 kg tanah subur dalam 2 L air dan disterilkan selama 1 jam pada suhu 1300 C kemudian disaring) diinokulasi secara tusukan pada bagian tengah. Setelah terjadi pertumbuhan, ditutup rapat dan disimpan pada suhu 40C. 2. Agar miring dengan paraffin Kultur ditumbuhkan pada agar miring yang mengandung pepton tetapi tanpa gula. Setelah pertumbuhan terjadi, permukaannya ditutup paraffin steril untuk mencegah penguapan dan membatasi penggunaan oksigen. Kultur juga disimpan pada suhu rendah (40C dalam ruang pendingin) 3. Deep Freezing Saat kultur didinginkan, beberapa sel mati. Selama penyimpanan dalam keadaan dingin sebagian sel akan tahan dan lainnya akan mati meskipun laju kematian berkurang dengan rendahnya suhu pendinginan. 4. Liofilisasi (kering beku) Sel-sel mikroba disuspensikan pada medium pembawa (suspending medium) untuk melindungi sel. Hasil liofilisasi ini berupa tepung yang terdiri atas sel mikroba yang liofilik, sangat mudah mengikat air. Contohnya kultur Yersenia pestis yang diliofilisasi pada keadaan hampa dalam ampul gelas pada suhu 40C selama 25 tahun, lebih dari 25% sel maih hidup. 5. Kultur tanah Teknik ini digunakan untuk mikroba pembentuk spora seperti Penicillium, Aspergillus, Bacillus, dan Streptomyces. Campuran tanah (20%), pasir (78%) dan kalsium karbonat (2%), beberapa gram dimasukan dalam tabung dan disterilisasi selama 8-15 jam pada suhu 1300C. setelah dingin, sejumlah suspense spora ditambahkan, kelebihan air diuapkan dalam desikator pada keadaan hampa dan tabung ditutup. Dengan cara ini, spora dapat bertahan beberapa tahun tanpa berkecambah. 6. Dehidrasi dengan silica gel anhidrat Tabung diisi setengahnya dengan silica gel dan disterilisasi kering pada suhu 1750C selama 1,5 hingga 2 jam. Suspensi (0,5 mL) yang telah didinginkan terlebih dahulu diteteskan pada setiap tabung yang berisi silica gel, didinginkan pada suhu 00C selama 10-15 menit, lalu disimpan selama 1 minggu dalam desikator yang menggunakan silica ge aktif, sebelum dilakukan uji viabilitas. Masing-masing tabung kemudian di tutup dengan Parafilm dan disimpan dalam wadah tertutup pada suhu 20 - 40C.
60
CARA PENYIMPANAN DAN PENGAWETAN BIAKAN FUNGI (JAMUR) Tujuan utamamemelihara biakansuatu fungus adalah untuk menjaga galur fungus tersebut di dalam suatu media tanpa terjadinya perubahan morfologi, fisiologi, atau genetic Teknik pengawetan sangat bervariasi, dapat dengan mengurangi kecepatan metabolisme atau bahkan dapat menunda metabolisme mikroorganisme. Pengawetan yang baik bila digunakan biakan yang sehat dan kondisi pertumbuhan yangoptimum. Mickroorganisme tumbuh dalam lingkungan dan kondisi yang berbeda-beda. Beberapa diantaranya memiliki spesifisitas tertentu sebagai syarat pertumbuhannya. Umumnya mikroorganisme tumbuh baik dalam media yang dibuat mendekati kondisi lingkungan tempat asalnya. Contoh : tanah, bagian tanaman atau komponen air, dll.
Pertumbuhan Mikroorganisme
Media pertumbuhan dapat bervariasi. Misalnya Raper & Thom (1949) menggunakan Czapek's Agar, Steep Agar and Malt Extract Agar untuk pertumbuhan Penicillia dan Aspergilli Pitt (1980) menganjurkan penggunaan Czapek Yeast Autolysate (CYA) dan Malt Extract Agar (MEA) untuk penicillia Standarisasi formula media penting dilakukan Media akan mempengaruhi morfologi dan warna koloni, karena kandungan media akan mempengaruhi pembentukan senyawa tertentu atau menginduksi sifat tertentu dari mikroorganisme
Pengaruh Media terhadap morfologi koloni
Kontaminasi pada kultur fungi • Biakan Fungi sering terkontaminasi oleh Tyroglyphus or Tarsonemus • Di alam banyak terdapat pada tanah, dan hampir semua bahan organik • Terbawa ke laboratorium dari bahan tanaman, produk yang sudah kadaluarsa, pada sepatu, serangga atau biakan mikroorganisme lain. • Cepat berkembang biak dalam keadaan lembab dan suhu ruang • Biakan fungi menjadi rusak dan tidak dapat disimpan
Pencegahan Kontaminasi • Melakukan pekerjaan sesuai prosedur • Menjaga kebersihan dan kesehatan diri 61
• Selalu memeriksa setiap barang yang masuk ke laboratorium • Menutup setiap biakan atau barang yang digunakan sesuai prosedur
Metode pencegahan kontaminasi Hygiene • Bersihkan seluruh permukaan dan hindari biakan dari udara luar dan debu • Cuci peralatan dengan desinfektan yang sesuai.
Fumigation • Digunakan selang waktu tertentu untuk ruang laboratorium atau korikor. Pekerjaan ini harus dilakukan oleh yang berwenang Mechanical and chemical barriers • Universal bottles, kapas lemak, tabung bersumbat Tempat penyimpanan yang aman • Lemari pendingin 4-8°C • Lemari penyimpanan “deep freeze” (< -20°C) • Menutup kultur dengan minyak mineral • Simpan dengan silica gel • Freeze-dry • Simpan di ultra-low temperatures case
Pengawetan dan Penyimpanan • Continuous culture Pada media padat atau cair Refrigeration Di bawah lapisan minyak mineral Di dalam air • Pengeringan • Freeze drying • Cryopreservation Bagi biakan awal dan simpan 1 biakan sebagai seed stock, Simpan satu biakan sebagai cadangan. Setelah pengawetan, viability, purity, dan identitas harus di cek ulang dan dibandingkan dengan data aslinya atau referensi. Morfologi, patogenitas, sifat-sifat fisik dan biokimia harus diuji. Semua pengamatan harus dicatat dan disimpan untuk referensi di masa yang akan datang.
62
Metode Pengawetan mikroorganisme agar miring Merupakan suatu metode yang paling mudah dan murah, beberapa kerugian dari sub-kultur pada agar adalah sebagai berikut: • Kemungkinan terjadi variasi genetic akibat pemindahan berulang, hilangnya sifat patogenitas atau karakteristik fisiologi dan morfologi lainnya • Kemungkinan kontaminasi besar • Memerlukan pengawasan yang ketat supaya biakan tidak tertukar atau terkontaminasi Sedangkan keuntungan metode sub-kultur pada agar adalah: • Koleksi biakan dapat disimpan dalam waktu cukup lama di bawah pengawasan ahlinya. • Metodenya cukup murah dan tidak memerlukan teknisi khusus. Untuk jumlah koleksi yang sedikit, metode ini cukup menguntungkan • Penumbuhan mudah karena tidak perlu waktu adaptasi yang lama. • Periode pemindahan : 2 – 4 minggu atau2 – 4 bulan
Metode Pengawetan mikroorganisme di bawah minyak mineral
Biakan di atas agar miring di dalam 30 ml universal bottles lalu dituangkan minyak mineral di atasnya. Hal ini dapat mencegah dehidrasi dan memperlambat aktivitas metabolisme dan pertumbuhan karena kurangnya tekanan oksigen Metode pengawetan dengan minyak mineral ini pertama kali digunakan oleh Buell &Weston (1947). Biakan sehat yang cukup usianya ditutup dengan 10 mm minyak mineral steril (liquid paraffin or medicinal paraffin dengan specific gravity 0.830-0.890). Minyak disterilkan dengan autoklaf dua kali pada121°C selama 15 menit. Penumbuhan kembali dari minyak dilakukan dengan cara mengambil sejumlah koloni dengan jarum biakan dan minyak dibuang sebanyak mungkin. Cara menginokulasi agar di posisi tengah-tengah kadang kala memberikan hasil yang lebih baik sehingga minyak dapat dikeluarkan dengan mudah melalui slope Kerugian penyimpanan dalam minyak mineral, diantaranya adalah : • Kontaminasi oleh spora mikroba dari udara • Hambatan pertumbuhan pada saat retrieval • Pertumbuhan terus terjadi di bawah kondisi yang tidak nyaman dapat mengarah pada mutasi Dan keuntungannya adalah : • Peralatan murah dan pengerjaan mudah 63
• Beberapa mikroorganisme hanya dapat disimpan di dalam minyak mineral • Namun penyimpanan di bawah minyak mineral disarankan untuk laboratorium yang memiliki keterbatasan sumbar daya dan fasilitas
Metode penyimpanan dalam air
Cara kerja: 1. Potongan agar ukuran 6 mm diambil dari ujung pertumbuhan koloni jamur 2. Potongan tersebut ditempatkan di dalam air sterildi dalam botol McCartney dan tutup erat , lalu disimpan pada suhu 20-25°C. 3. Peremajaan dilakukan dengan mengambilpotongan agar tersebut, tempatkan terbalik pada medium pertumbuhan yang sesuai Jangka waktu penyimpanan dapatmencapai 2-3 tahun , misalnya untuk spesies of Phytophthora dan Pythium tanpa adanya perubahan fisik. Pertama kali dilakukan oleh Castellani (1939,1967) yang menyimpan fungi yang pathogen terhadap manusia. Figueiredo (1967) menyimpan 22 patogen tanaman tanpa kehilangan patogenitasnya. Figueiredo & Pimentel (1975) melaporkan penyimpanan dalam air bisa mencapai 10 tahun. Boeswinkel (1976) menyimpan 650 patogenantara lain Oomycota, Ascomycota, Basidiomycotadan mitotic fungi selama 7 tahun. Ellis (1979) menyimpan Entomophthorales, Pyrenomycetes, Hymenomycetes, Gasteromycetes dan Hyphomycetes.
Penyimpanan dan pengawetan dengan teknik pengeringan beku (freeze-drying) • Penghilangan air akan mengurangi laju metabolisme sel • Dapat dilakukan dengan pengeringan udara • Dapat pula dengan penambahan absorbant seperti tanah, silica gel, atau desiccant lain. • Cara Freeze-dry dengan vacuum dari keadaan beku dengan cara sublimasi es
Penyimpanan dalam Silica Gel
64
Sporulating fungi dapat disimpan selama 7-18 tahun, bahkan ada yang sampai 25 tahun
Penyimpanan dalam Silica Gel Cara kerja: 1. Sepertiga penuh botol universal 30 ml isi dengan silica gel dan sterilkan dengan dry heat (180°C selama 3 jam). 2. Tempatkan botol di dalam rak dengan air dan bekukan (nominal- 20°C). 3. Siapkan suspensi spora di dalam 5% (w/v) skimmed milk yang telah didinginkan. 4. Tambahkan kira-kira 1 ml biakan tersebut ke dalam silica gel dan goyangkan agar tercampur homogen. 5. Simpan botol dengan tutup longgar selama 10-14 hari pada25°C sampai silica gel crystals mengering dan siap untuk dipisahkan. 6. Kencangkan tutupnya dan simpan botol pada 4°C dalam wadah kedap udara dengan indicator silica gel untuk mengabsorbsi lembab. Banyak fungi yang tahan lama dengan metode ini, tapi spora yang berdinding tipis cenderung tidak dapat bertahan. Keberhasilannya tergantung biakan yang sehat, dan hal ini dapat ditunjukkan dari perbedaan biakan dari setiap isolat. Metode ini dapat digunakan bila fasilitas freezedrying tidak tersedia, walaupun ada beberapa fungi yang tidak dapat bertahan lama dengan cara ini.
Penumbuhan kembali dgn cara menyebarkan beberapa kristal ke dalam medium pertumbuhan yang sesuai
Kekurangan cara silica gel : • Hanya terbatas pada sporulating fungi, dan tidak sesuai untuk Pythium, Phytophthora dan beberapa Oomycota, juga beberapa fungi bermiselium yang memiliki spora yang kompleks. • Kemungkinan terjadinya kontaminasi cukup besar setelah beberapa kali peremajaan. Keuntungan cara silica gel : • Murah dan sederhana • Menghasilkan biakan yang stabil untuk banyak sporulating fungi termasuk Basidiomycota. • Kontaminasi dari bakteri dapat dihindari karena kondisi yang kering •Peremajaan inokulum dapat dilakukan dengan mengambil beberapa butir dari satu botol, walaupun disarankan tetap memisahkan biakan stock dari biakan kerja.
65
Penyimpanan dalam tanah
Tanah harus diautoklaf dua kali (121°C for 15 min) sebelum diinokulasi dengan 1 ml suspensi spora dalam air steril. Inkubasi pada 20-25°C selama 5-10 hari tergantung pada laju pertumbuhan fungi Keuntungan : • Biakan dapat bertahan sampai 10 tahun. • Peremajaan berulang dapat dilakukan dari sampel yang sama, walaupun sebaiknya stok harus ditempatkan terpisah. • Biaya murah dan alat sederhana Kerugian : • Kemungkinan terjadi variasi genetik • Beberapa fungi tidak dapat tahan didesikasi • Kemungkinan kontaminasi lebih besar
Oomycota Paling baik disimpan di bawah nitrogen cair dengan kecepatan pendinginan 10°C min-1, walaupun beberapa galur tidak dapat disimpan dengan cara ini. Di bawah minyak mineral dapat disimpan sampai 6 bulan Tiga galur Phytophthora dapat tahan sampai 40 tahun (laporan dari CABI-UK) Kultur dapat disimpan dalam air namun perlu di transfer setiap 2 tahun
Zygomycota • Nitrogen cair sangat disarankan untuk penyimpanan Mucor, Rhizopus dan genus lainnya • Dapat pula dengan cara freeze-dried • Tidak semua genus tahan proses dehidrasi, terutama dengan silica gel, misalnya Coemansia, Martensiomyces, Condiobolus, Entomophthora, Piptocephalis and Syzygites. Dari genus2 ini, hanya Piptocephalis dan Coemansia yang dapat di freeze dried.
Basidiomycota • Umumnya tumbuh dalam bentuk miselium Fungi demikian hanya dapat disimpan dengan cara transfer regular pada agar dengan atau tanpa minyak, atau disimpan di nitrogen cair.
66
• Fungi tersebut menghasilkan dinding hifa yang tebal jadi mudah di freeze-dried tetapi sukar ditumbuhkan kembali • Basidiospores yang diperoleh dari fungi yang tumbuh di alam, dapat di freeze-dried Fungi Deuteromycota • Fungi yang ber konidia relatif mudah disimpan • Freeze-drying adalah teknik yang paling tepat. • Aspergillus, Penicillium and Paecilomyces dapat disimpan mulai dari 6 bulan sampai 2 tahun pada agar miring pada -18°C. Ragi • Ragi (single celled vegetative yeasts) dapat disimpan dengan cara freezedrying. • Kebanyakan spesies dapat tahan disimpan dalam silica gel namun sukar ditumbuhkan kembali • Liquid nitrogen adalah cara yang paling baik.
67
Bab 6 Pengaruh Lingkungan Terhadap Pertumbuhan Mikroorganisme Aktivitas mikroba dipengaruhi oleh faktor-faktor lingkungannya. Perubahan lingkungan dapat mengakibatkan perubahan sifat morfologi dan fisiologi mikroba. Beberapa kelompok mikroba sangat resisten terhadap perubahan faktor lingkungan. Mikroba tersebut dapat dengan cepat menyesuaikan diri dengan kondisi baru tersebut. Faktor lingkungan meliputi faktor-faktor abiotik (fisika dan kimia), dan faktor biotik. A. FAKTOR ABIOTIK 1. Suhu a. Suhu pertumbuhan mikroba Pertumbuhan mikroba memerlukan kisaran suhu tertentu. Kisaran suhu pertumbuhan dibagi menjadi suhu minimum, suhu optimum, dan suhu maksimum. Suhu minimum adalah suhu terendah tetapi mikroba masih dapat hidup. Suhu optimum adalah suhu paling baik untuk pertumbuhan mikroba. Suhu maksimum adalah suhu tertinggi untuk kehidupan mikroba. Berdasarkan
kisaran
suhu
pertumbuhannya,
mikroba
dapat
dikelompokkan menjadi mikroba psikrofil (kriofil), mesofil, dan termofil. Psikrofil adalah kelompok mikroba yang dapat tumbuh pada suhu 0-300C dengan suhu optimum sekitar 150C. Mesofil adalah kelompok mikroba pada umumnya, mempunyai suhu minimum 150C suhu optimum 25-370C dan suhu maksimum 45-550C. Mikroba yang tahan hidup pada suhu tinggi dikelompokkan dalam mikroba termofil. Mikroba ini mempunyai membran sel yang mengandung lipida jenuh, sehingga titik didihnya tinggi. Selain itu 68
dapat memproduksi protein termasuk enzim yang tidak terdenaturasi pada suhu tinggi. Di dalam DNA-nya mengandung guanin dan sitosin dalam jumlah yang relatif besar, sehingga molekul DNA tetap stabil pada suhu tinggi. Kelompok ini mempunyai suhu minimum 40 0C, optimum pada suhu 55-60 0C dan suhu maksimum untuk pertumbuhannya 75 0C. Untuk mikroba yang tidak tumbuh dibawah suhu 30 0C dan mempunyai suhu pertumbuhan optimum pada 60 0C, dikelompokkan kedalam mikroba termofil obligat. Untuk mikroba termofil yang dapat tumbuh dibawah suhu 30
0
C,
dimasukkan kelompok mikroba termofil fakultatif. Bakteri yang hidup di dalam tanah dan air, umumnya bersifat mesofil, tetapi ada juga yang dapat hidup diatas 50 0C (termotoleran). Contoh bakteri termotoleran adalah Methylococcus capsulatus. Contoh bakteri termofil adalah Bacillus, Clostridium, Sulfolobus, dan bakteri pereduksi sulfat/sulfur. Bakteri yang hidup di laut (fototrof) dan bakteri besi (Gallionella) termasuk bakteri psikrofil. b. Suhu tinggi Apabila mikroba dihadapkan pada suhu tinggi diatas suhu maksimum, akan memberikan beberapa macam reaksi. (1) Titik kematian thermal, adalah suhu yang dapat memetikan spesies mikroba dalam waktu 10 menit pada kondisi tertentu. (2) Waktu kematian thermal, adalah waktu yang diperlukan untuk membunuh suatu spesies mikroba pada suatu suhu yang tetap. Faktorfaktor yang mempengaruhi titik kematian thermal ialah waktu, suhu, kelembaban, spora, umur mikroba, pH dan komposisi medium. Contoh : waktu kematian thermal (TDT/ thermal death time) untuk beberapa jenis bakteri adalah sebagai berikut : Waktu Nama mikrobia
(menit)
Escherichia coli Staphylococcus aureus Spora Bacilus subtilis
20-30 19 20-50
69
Suhu (0C)
57 60 100
Spora Clostridium botulinum
100-330
100
c. Suhu rendah Apabila mikroba dihadapkan pada suhu rendah dapat menyebabkan gangguanmetabolisme. Skibat-akibatnya adalah (1) Cold shock , adalah penurunan suhu yang tiba-tibamenyebabkan kematian bakteri, terutama pada bakteri muda atau pada fase logaritmik, (2)Pembekuan (freezing), adalah rusaknya sel dengan adanya kristal es di dalam airintraseluler, (3) Lyofilisasi , adalah proses pendinginan dibawah titik beku dalam keadaanvakum secara bertingkat. Proses ini dapat digunakan untuk mengawetkan mikroba karenaair protoplasma langsung diuapkan tanpa melalui fase cair (sublimasi). 2. Kandungan air (pengeringan) Setiap mikroba memerlukan kandungan air bebas tertentu untuk hidupnya,biasanya diukur dengan parameter aw (water activity) atau kelembaban relatif. Mikrobaumumnya dapat tumbuh pada aw 0,998-0,6. bakteri umumnya memerlukan aw 0,90-0,999.Mikroba yang osmotoleran dapat hidup pada aw terendah (0,6) misalnya khamirSaccharomyces rouxii. Aspergillus glaucus dan jamur benang lain dapat tumbuh pada aw 0,8.Bakteri umumnya memerlukan aw atau kelembaban tinggi lebih dari 0,98, tetapi bakterihalofil hanya memerlukan aw 0,75. Mikroba yang tahan kekeringan adalah yang dapatmembentuk spora, konidia atau dapat membentuk kista. 3. Tekanan osmose Tekanan osmose sebenarnya sangat erat hubungannya dengan kandungan air. Apabilamikroba diletakkan pada larutan hipertonis, maka selnya akan mengalami plasmolisis, yaitu terkelupasnya membran sitoplasma dari dinding sel akibat mengkerutnya sitoplasma. Apabiladiletakkan pada larutan hipotonis, maka sel mikroba akan mengalami plasmoptisa, yaitu pecahnya selkarena cairan masuk ke dalam sel, sel membengkak dan akhirnya pecah.Berdasarkan tekanan osmose yang diperlukan dapat dikelompokkan menjadi
70
(1) mikrobaosmofil, adalah mikroba yang dapat tumbuh pada kadar gula tinggi, (2) mikroba halofil, adalahmikroba yang dapat tumbuh pada kadar garam halogen yang tinggi, (3) mikroba halodurik, adalahkelompok mikroba yang dapat tahan (tidak mati) tetapi tidak dapat tumbuh pada kadar garam tinggi,kadar garamnya dapat mencapai 30 %. Contoh mikroba osmofil adalah beberapa jenis khamir. Khamir osmofil mampu tumbuhpada larutan gula dengan konsentrasi lebih dari 65 % wt/wt (aw = 0,94). Contoh mikroba halofiladalah bakteri yang termasuk Archaebacterium, misalnya Halobacterium. Bakteri yang tahan padakadar garam tinggi, umumnya mempunyai kandungan KCl yang tinggi dalam selnya. Selain itubakteri ini memerlukan konsentrasi Kalium yang tinggi untuk stabilitas ribosomnya. Bakteri halofilada yang mempunyai membran purple bilayer, dinding selnya terdiri dari murein, sehingga tahanterhadap ion Natrium. 4. Ion-ion dan listrik a. Kadar ion hidrogen (pH) Mikroba umumnya menyukai pH netral (pH 7). Beberapa bakteri dapat hidup pada pHtinggi (medium alkalin). Contohnya adalah bakteri nitrat, rhizobia, actinomycetes, dan bakteripengguna urea. Hanya beberapa bakteri yang bersifat toleran terhadap kemasaman, misalnyaLactobacilli, Acetobacter, dan Sarcina ventriculi. Bakteri yang bersifat asidofil misalnyaThiobacillus. Jamur umumnya dapat hidup pada kisaran pH rendah. Apabila mikroba ditanam padamedia dengan pH 5 maka pertumbuhan didominasi oleh jamur, tetapi apabila pH media 8 makapertumbuhan didominasi oleh bakteri. Berdasarkan pH-nya mikroba dapat dikelompokkan menjadi 3 yaitu (a) mikroba asidofil,adalah kelompok mikroba yang dapat hidup pada pH 2,0-5,0, (b) mikroba mesofil (neutrofil), adalahkelompok mikroba yang dapat hidup pada pH 5,5-8,0,
71
(c) mikroba alkalifil, adalah kelompokmikroba yang dapat hidup pada pH 8,4-9,5. Contoh pH minimum, optimum, dan maksimum untukbeberapa jenis bakteri adalah sebagai berikut : pH Nama mikroba Escherichia coli Proteus vulgaris Enterobacter aerogenes Pseudomonas aeruginosa Clostridium sporogenes Nitrosomonas spp Nitrobacter spp Thiobacillus Thiooxidans Lactobacillus acidophilus
minimum 4,4 4,4 4,4 5,6 5,0-5,8 7,0-7,6 6,6 1,0 4,0-4,6
optimum 6,0-7,0 6,0-7,0 6,0-7,0 6,6-7,0 6,0-7,6 8,0-8,8 7,6-8,6 2,0-2,8 5,8-6,6
maksimum 9,0 8,4 9,0 8,0 8,5-9,0 9,4 10,0 4,0-6,0 6,8
b. Buffer Untuk menumbuhkan mikroba pada media memerlukan pH yang konstan, terutama padamikroba yang dapat menghasilkan asam. Misalnya Enterobacteriaceae dan beberapaPseudomonadaceae. Oleh karenanya ke dalam medium diberi tambahan buffer untuk menjagaagar pH nya konstan. Buffer merupakan campuran garam mono dan dibasik, maupun senyawasenyawaorganik amfoter. Sebagai contoh adalah buffer fosfat anorganik dapat mempertahankanpH diatas 7,2. Cara kerja buffe adalah garam dibasik akan mengadsorbsi ion H+ dan garammonobasik akan bereaksi dengan ion OHc. Ion-ion lain Logam berat seperti Hg, Ag, Cu, Au, dan Pb pada kadar rendah dapat bersifat meracun(toksis). Logam berat mempunyai daya oligodinamik, yaitu daya bunuh logam berat pada kadarrendah. Selain logam berat, ada ion-ion lain yang dapat mempengaruhi kegiatan fisiologimikroba, yaitu ion sulfat, tartrat,
klorida,
nitrat,
dan
benzoat.
Ion-ion
tersebut
dapat
mengurangipertumbuhan mikroba tertentu. Oleh karena itu sering digunakan untuk mengawetkan suatubahan, misalnya digunakan dalam
72
pengawetan makanan. Ada senyawa lain yang jugamempengaruhi fisiologi mikroba, misalnya asam benzoat, asam asetat, dan asam sorbat.
d. Listrik Listrik dapat mengakibatkan terjadinya elektrolisis bahan penyusun mediumpertumbuhan. Selain itu arus listrik dapat menghasilkan panas yang dapat mempengaruhipertumbuhan mikroba. Sel mikroba dalam suspensi akan mengalami elektroforesis apabila dilaluiarus listrik. Arus listrik tegangan
tinggi
yang
melalui
suatu
cairan
akan
menyebabkan
terjadinyashock karena tekanan hidrolik listrik. Kematian mikroba akibat shock terutama disebabkan olehoksidasi. Adanya radikal ion dari ionisasi radiasi dan terbentuknya ion logam dari elektroda jugamenyebabkan kematian mikroba. e. Radiasi Radiasi menyebabkan ionisasi molekul-molekul di dalam protoplasma. Cahaya umumnyadapat merusak mikroba yang tidak mempunyai pigmen fotosintesis. Cahaya mempunyaipengaruh germisida, terutama cahaya bergelombang pendek dan bergelombang panjang.Pengaruh germisida dari sinar bergelombang panjang disebabkan oleh panas yangditimbulkannya, misalnya sinar inframerah. Sinar x (0,005-1,0 Ao), sinar ultra violet (40002950Ao), dan sinar radiasi lain dapat membunuh mikroba. Apabila tingkat iradiasi yang diterima selmikroba rendah, maka dapat menyebabkan terjadinya mutasi pada mikroba.
f. Tegangan muka Tegangan muka mempengaruhi cairan sehingga permukaan cairan tersebut menyerupaimembran yang elastis. Seperti telah diketahui protoplasma mikroba terdapat di dalam sel yangdilindungi dinding sel, maka
apabilaada
perubahan
tegangan
muka
dinding
sel
akanmempengaruhi pula permukaan protoplasma. Akibat selanjutnya dapat mempengaruhipertumbuhan mikroba dan bentuk morfologinya. Zat-
73
zat seperti sabun, deterjen, dan zat-zatpembasah (surfaktan) seperti Tween80 dan Triton A20 dapat mengurangi tegangan mukacairan/larutan. Umumnya mikroba cocok pada tegangan muka yang relatif tinggi. g. Tekanan hidrostatik Tekanan hidrostatik mempengaruhi metabolisme dan pertumbuhan mikroba. Umumnyatekanan 1-400 atm tidak mempengaruhi atau hanya sedikit mempengaruhi metabolisme danpertumbuhan mikroba. Tekanan hidrostatik yang lebih tinggi lagi dapat menghambat ataumenghentikan pertumbuhan, oleh karena tekanan hidrostatik tinggi dapat menghambat sintesis RNA, DNA, dan protein, serta mengganggu fungsi transport membran sel maupun mengurangiaktivitas berbagai macam enzim.Tekanan diatas 100.000 pound/inchi2 menyebabkan denaturasiprotein. Akan tetapi ada
mikroba
yang
tahan
hidup
pada
tekanan
tinggi
(mikroba
barotoleran),dan ada mikroba yang tumbuh optimal pada tekanan tinggi sampai 16.000 pound/inchi2 (barofil).Mikroba yang hidup di laut dalam umumnya adalah barofilik atau barotoleran. Sebagai contohadalah bakteri Spirillum. h. Getaran Getaran mekanik dapat merusakkan dinding sel dan membran sel mikroba. Oleh karenaitu getaran mekanik banyak dipakai untuk memperoleh ekstrak sel mikroba. Isi sel dapatdiperoleh dengan cara menggerus
sel-sel
dengan
menggunakan
abrasif
atau
dengan
carapembekuan kemudian dicairkan berulang kali. Getaran suara 10010.000 x/ detik juga dapatdigunakan untuk memecah sel. B. FAKTOR BIOTIK Di alam jarang sekali ditemukan mikroba yang hidup sebagai biakan murni, tetapi selaluberada dalam asosiasi dengan jasad-jasad lain. Antar jasad dalam satu populasi atau antarpopulasi jasad yang satu dengan yang lain saling berinteraksi. 1. Interaksi dalam satu populasi mikroba Interaksi antar jasad dalam satu populasi yang sama ada dua macam, yaitu interaksipositif maupun negatif. Interaksi positif menyebabkan meningkatnya
kecepatan
pertumbuhansebagai
74
efek
sampingnya.
Meningkatnya kepadatan populasi, secara teoritis meningkatkankecepatan pertumbuhan. Interaksi positif disebut juga kooperasi. Sebagai contoh adalahpertumbuhan satu sel mikroba menjadi koloni atau pertumbuhan pada fase lag (fase adaptasi). Interaksi negatif menyebabkan turunnya kecepatan pertumbuhan dengan meningkatnyakepadatan populasi. Misalnya populasi mikroba yang ditumbuhkan dalam substrat terbatas, atauadanya produk metabolik yang meracun. Interaksi negatif disebut juga kompetisi. Sebagai contohjamur Fusarium dan Verticillium pada tanah sawah, dapat menghasilkan asam lemak dan H2Syang bersifat meracun. 2. Interaksi antar berbagai macam populasi mikroba Apabila dua populasi yang berbeda berasosiasi, maka akan timbul berbagai macaminteraksi. Interaksi tersebut menimbulkan pengaruh positif, negatif, ataupun tidak ada pengaruhantar populasi mikroba yang satu dengan yang lain. Nama masing-masing interaksi adalahsebagai berikut: Pengaruh interaksi Populasi A Populasi B Netralisme 0 0 Komensalisme 0 + Sinergisme (protokooperasi) + + Mutualisme (simbiosis) + + Kompetisi Amensalisme (antagonisme) + Predasi + Parasitisme + Keterangan: 0: tidak berpengaruh, +: pengaruh positif, -: pengaruh negatif Nama Interaksi
a. Netralisme Netralisme adalah hubungan antara dua populasi yang tidak saling mempengaruhi. Halini dapat terjadi pada kepadatan populasi yang sangat rendah atau secara fisik dipisahkan dalammikrohabitat, serta populasi yang keluar dari habitat alamiahnya. Sebagai contoh interaksi antaramikroba allocthonous (nonindigenous) dengan mikroba autochthonous (indigenous), dan antarmikroba nonindigenous di atmosfer yang kepadatan populasinya sangat rendah. Netralisme jugaterjadi pada keadaan mikroba tidak aktif, misal dalam keadaan kering beku, atau fase istirahat(spora, kista). 75
b. Komensalisme Hubungan komensalisme antara dua populasi terjadi apabila satu populasi diuntungkan tetapi populasi lain tidak terpengaruh. Contohnya adalah: - Bakteri Flavobacterium brevis dapat menghasilkan ekskresi sistein. Sistein dapatdigunakan oleh Legionella pneumophila. - Desulfovibrio mensuplai asetat dan H2 untuk respirasi anaerobik Methanobacterium. c. Sinergisme Suatu bentuk asosiasi yang menyebabkan terjadinya suatu kemampuan untuk dapatmelakukan perubahan kimia tertentu di dalam substrat. Apabila asosiasi melibatkan 2 populasiatau lebih dalam keperluan nutrisi bersama, maka disebut sintropisme. Sintropisme sangatpenting dalam peruraian bahan organik tanah, atau proses pembersihan air secara alami.Contoh sinergisme: Streptococcus faecalis dan Escherichia coli d. Mutualisme (Simbiosis) Mutualisme adalah asosiasi antara dua populasi mikroba yang keduanya salingtergantung dan sama-sama mendapat keuntungan. Mutualisme sering disebut juga simbiosis.Simbiosis bersifat sangat spesifik (khusus) dan salah satu populasi anggota simbiosis tidak dapatdigantikan tempatnya oleh spesies lain yang mirip. Contohnya adalah Bakteri Rhizobium sp. Yanghidup pada bintil akar tanaman kacang-kacangan. Contoh lain adalah Lichenes (Lichens), yangmerupakan simbiosis antara algae sianobakteria dengan fungi. Algae (phycobiont) sebagaiproduser yang dapat menggunakan energi cahaya untuk menghasilkan senyawa organik. Senyawaorganik dapat digunakan oleh fungi (mycobiont), dan fungi memberikan bentuk perlindungan(selubung) dan transport nutrien / mineral serta membentuk faktor tumbuh untuk algae. e. Kompetisi Hubungan negatif antara 2 populasi mikroba yang keduanya mengalami kerugian.Peristiwa ini ditandai dengan menurunnya sel hidup dan
76
pertumbuhannya.
Kompetisi
terjadi
pada2
populasi
mikroba
yang
menggunakan nutrien / makanan yang sama, atau dalam keadaan nutrient terbatas. Contohnya adalah antara protozoa Paramaecium caudatum dengan Paramaeciumaurelia. f. Amensalisme (Antagonisme) Satu bentuk asosiasi antar spesies mikroba yang menyebabkan salah satu pihak dirugikan,pihak lain diuntungkan atau tidak terpengaruh apapun. Umumnya merupakan cara untukmelindungi diri terhadap populasi mikroba lain. Misalnya dengan menghasilkan senyawa asam,toksin, atau antibiotika. Contohnya adalah bakteri Acetobacter yang mengubah etanol menjadiasam asetat. Thiobacillus thiooxidans menghasilkan asam sulfat. Asam-asam tersebut dapatmenghambat pertumbuhan bakteri lain. Bakteri amonifikasi menghasilkan ammonium yang dapatmenghambat populasi Nitrobacter. g. Parasitisme Parasitisme terjadi antara dua populasi, populasi satu diuntungkan (parasit) dan populasilain dirugikan (host / inang). Umumnya parasitisme terjadi karena keperluan nutrisi dan bersifatspesifik. Ukuran parasit biasanya lebih kecil dari inangnya. Terjadinya parasitisme memerlukankontak secara fisik maupun metabolik serta waktu kontak yang relatif lama. Contohnya adalahbakteri Bdellovibrio yang memparasit bakteri E. coli. Jamur Trichoderma sp. memparasit jamurAgaricus sp. h. Predasi Hubungan predasi terjadi apabila satu organisme predator memangsa atau memakan danmencerna organisme lain (prey). Umumnya predator berukuran lebih besar dibandingkan prey,dan peristiwanya berlangsung cepat. Contohnya adalah Protozoa (predator) dengan bakteri (prey).Protozoa Didinium nasutum (predator) dengan Paramaecium caudatum (prey).
77
Cara Kerja Penentuan Pengaruh suhu terhadap pertumbuhan mikroorganisme · 8x2 tabung yang berisi Nutrient Broth untuk suhu inkubasi 50C, 250C, 370C, dan 500C dan mikroorganisma yang berbeda (E.coli dan Bacillus sp.) diberi label . Setelah diinokulasi dengan bekteri yang berbeda, diinkubasi sesuai suhu yang tertera · setelah ditumbuhkan selama 48 jam, bandingkan derajat kekeruhannya.
Cara Kerja Penentuan Pengaruh tekanan osmotik terhadap pertumbuhan mikroorganisme · buat 4 buah cawan NutrientAgar yang mengandung NaCl 0,5%, 3%, 5% dan 15%. · Setiap konsentrasi, cawan dibagi menjadi 2 dengan spidol kemudian labeli dengan bakteri E.coli dan Bacillus sp. · Inokulasikan E.coli dan Bacillus sp. dengan streak kontinyu · Gunakan kontrol untuk masing-masing biakan dengan media yang tidak ditambahi NaCl. · Inkubasi selama 48 jam dan amati pertumbuhannya
Cara Kerja Penentuan Pengaruh sinar ultraviolet terhadap pertumbuhan mikroorganisme Sinar UV panjang gelombang 210-300 nm dapat membunuh mikroorganisme jika di paparkan. Komponen seluler yang dapat menyerap sinar UV adalah asam nukleat sehingga dapat rusak dan menyebabkan kematian. Cara Kerja: · Inokulasikan Aspergillus sp., E.coli dan Bacillus sp. pada 3 cawan NA.
78
· Dedahkan ketiga cawan tersebut pada sinar UV dengan panjang 254 nm selama 1 menit, 5 menit, dan 15 menit (ingat tutup cawan dibuka dan diusahakan lingkungan sekitar steril). Jarak antar UV dan cawan sekitar 12 inchi · Gunakan kontrol untuk masing-masing biakan dengan tidak memaparkan pada sinar UV · Inkubasi selama 48 jam dan amati pertumbuhan koloninya Cara Kerja Penentuan Pengaruh pH terhadap pertumbuhan mikroorgansime Cara Kerja : · Buatlah tabung reaksi berisi NB dan atur pH-nya (pH 3, 7 dan 9) masing-masing 2 tabung untuk tiap nilai pH · Labeli dengan nama bakteri yang akan diinokulasikan · Inokulasi tiap tabung dengan Bacillus sp dan E.coli lalu diinkubasi pada suhu 370C selama 48 jam · Amati perbedaan kekeruhan pada tiap nilai pH
79
Bab 7 Menentukan Jumlah &Ukuran Mikroorganisme Pertumbuhan adalah penambahan secara teratur semua komponen sel suatu jasad. Pembelahan sel adalah hasil dari pembelahan sel. Pada jasad bersel tunggal (uniseluler), pembelahan atau perbanyakan sel merupakan pertambahan jumlah individu. Misalnya pembelahan sel pada bakteri akan menghasilkan pertambahan jumlah sel bakteri itu sendiri. Pada jasad bersel banyak (multiseluler), pembelahan sel tidak menghasilkan pertambahan jumlah individunya, tetapi hanya merupakan pembentukan jaringan atau bertambah besar jasadnya. Dalam membahas pertumbuhan mikrobia harus dibedakan antara pertumbuhan masing-masing individu sel dan pertumbuhan kelompok sel atau pertumbuhan populasi. A. Pertumbuhan Populasi Pertumbuhan dapat diamati dari meningkatnya jumlah sel atau massa sel (berat kering sel). Pada umumnya bakteri dapat memperbanyak diri dengan pembelahan biner, yaitu dari satu sel membelah menjadi 2 sel baru, maka pertumbuhan dapat diukur dari bertambahnya jumlah sel. Waktu yang diperlukan untuk membelah diri dari satu sel menjadi dua sel sempurna disebut waktu generasi. Waktu yang diperlukan oleh sejumlah sel atau massa sel menjadi dua kali jumlah/massa sel semula disebut doubling time atau waktu penggandaan. Waktu penggandaan tidak sama antara berbagai mikrobia, dari beberapa menit, beberapa jam sampai beberapa hari tergantung kecepatan pertumbuhannya. Kecepatan pertumbuhan merupakan perubahan jumlah atau massa sel per unit waktu. B. Penghitungan Waktu Generasi Dari hasil pembelahan sel secara biner: 1 sel menjadi 2 sel 2 sel menjadi 4 sel 21 menjadi 22 atau 2x2 4 sel menjadi 8 sel 22 menjadi 23 atau 2x2x2
80
Dari hal tersebut dapat dirumuskan menjadi: N = N0 x 2n N: jumlah sel akhir, N0: jumlah sel awal, n: jumlah generasi 𝑊𝑎𝑘𝑡𝑢 𝑔𝑒𝑛𝑒𝑟𝑎𝑠𝑖
𝑡 𝑛
t: waktu pertumbuhan eksponensial, n: jumlah generasi Dalam bentuk logaritma, rumus N = N0 x 2n menjadi: log N = log N0 + n log 2 log N – log N0 = n log 2 𝑛 𝑁
𝑁0
⬚
Contoh: N = 108 , N0 = 5x107 , t = 2 Dengan rumus dalam bentuk logaritma: (
)
Jadi waktu generasinya adalah
Waktu generasi juga dapat dihitung dari slope garis dalam plot semilogaritma kurvapertumbuhan eksponensial, yaitu dengan rumus, slope = 0,301/ waktu generasi. Darigrafik pertumbuhan tersebut diketahui bahwa slope = 0,15, sehingga juga diperolehwaktu generasi = 2 jam C. Pengukuran Pertumbuhan Pertumbuhan diukur dari perubahan jumlah sel atau berat kering massa sel.Jumlah sel dapat dihitung dari jumlah sel total yang tidak membedakan jumlah sel hidupatau mati, dan jumlah sel hidup (viable count). Jumlah total sel mikrobia dapatditetapkan secara langsung dengan pengamatan mikroskopis, dalam bentuk sampelkering yang diletakkan di permukaan gelas benda (slide) dan 81
dalam sampel cairan yangdiamati menggunakan metode counting chamber, misalnya dengan alat Petroff-HausserBacteria Counter (PHBC) untuk menghitung bakteri atau dengan alat haemocytometeruntuk menghitung khamir, spora, atau sel-sel yang ukurannya relatif lebih besar daribakteri. Jumlah sel hidup dapat ditetapkan dengan metode plate count atau colony count,dengan cara ditaburkan pada medium agar sehingga satu sel hidup akan tumbuhmembentuk satu koloni, jadi jumlah koloni dianggap setara dengan jumlah sel. Cara iniada dua macam, yaitu metode taburan permukaan (spread plate method) dan metodetaburan (pour plate method). Cara lain untuk menghitung jumlah sel hidup adalahdengan filter membran dan MPN (Most Probable Number) yang menggunakan mediumcair. Sampel mikrobia yang dihitung biasanya dibuat seri pengenceran.Pertumbuhan sel dapat diukur dari massa sel dan secara tidak langsung denganmengukur turbiditas cairan
medium
tumbuh. Massa sel
dapat
dipisahkan
dari
cairanmediumnya menggunakan alat sentrifus (pemusing) sehingga dapat diukur volumemassa selnya atau diukur berat keringnya (dikeringkan dahulu dengan pemanasan padasuhu 90-1100C semalam). Umumnya berat kering bakteri adalah 10-20 % dari beratbasahnya. Turbiditas dapat diukur menggunakan alat photometer (penerusan cahaya),semakin pekat atau semakin banyak populasi mikrobia maka cahaya yang diteruskansemakin
sedikit.
Turbiditas
juga
dapat
diukur
menggunakan
spektrofotometer (opticaldensity/ OD), yang sebelumnya dibuat kurva standart berdasarkan pengukuran jumlahsel baik secara total maupun yang hidup saja atau berdasarkan berat kering sel. Unitphotometer atau OD proporsional dengan massa sel dan juga jumlah sel, sehingga caraini dapat digunakan untuk memperkirakan jumlah atau massa sel secara tidak langsung. D. Menentukan Ukuran Mikroorganisme Mikroba berukuran sangat kecil dan untuk mengetahuinya digunakan mikrometer. Mikrometer merupakan kaca berskala dan dikenal 2 jenis micrometer yaitu mikrometer okuler dan mikrometer objektif. Mikrometer okuler 82
dipasang pada lensa okuler mikroskop, sedangkan micrometer objektif berbentuk slide yang ditempatkan pada meja preparat mikroskop. Jarak antar garis skala pada mikrometer okuler tergantung pada perbesaran lensa objektif yang digunakan yang menentukan lapang pandang mikroskop. Jarak ini dapat ditentukan dengan mengkalibrasi antara mikrometer okuler dan objektif. Mikrometer objektif memiliki skala yang telah diketahui, menjadi tolak ukur untuk menentukan ukuran skala micrometer okuler. 1 skala micrometer objektif = 0,01 mm / 10 µm. Kalibrasi dilakukan dengan menghimpitkan skala mikrometer objektif dan okuler pada perbesaran yang diinginkan. Skala ke nol (garis pertama) kedua mikrometer disimpulkan menjadi 1 garis kemudian dilihat pada skala ke berapa kedua jenis mikrometer tersebut bertemu/berhimpit kembali. Dari hasil tersebut dapat diketahui satu satuan panjang pada skala mikrometer okuler itu berdasarkan beberapa jumlah skala kecil mikrometer objektif yang berada di antara garis yang berhimpit tadi.
Misal : jika skala ke 0 mikrometer okuler berhimpit dengan skala ke 0 mikrometer objektif lalu skala ke 13 mikrometer okuler berhimpit dengan skala ke 2 mikrometer objektif maka beberapa 1 skala okuler.
83
Cara Kerja : Kalibrasi : · Letakkan mikrometer objektif pada meja benda dan pasang mikrometer okuler pada tabung lensa okuler. ·Tentukan perbesaran yang digunakan, (misalnya 40 X 10) kemudian cari gambar perbesaran dari skala mikrometer objektif. ·Setelah fokus didapat, kemudian selanjutnya himpitkan skala ke nol mikrometer objektif dan okuler. ·Cari dengan teliti skala ke berapa antara mikrometer objektif dan okuler yang berhimpit lagi. ·Hitung besarnya skala okuler dengan rumus di atas.
cara kalibrasi cara mengukur mikroba
Penentuan ukuran mikroba
-Lepaskan mikrometer objektif dari meja benda. -Ganti dengan preparat ulas yang telah disiapkan -Cari fokus dari preparat tersebut dengan perbesaran yang sama. -Hitung berapa panjang sel dengan menghitung skala mikrometer okuler. -Jika diperlukan hitung lebar sel dengan cara yang sama. Tabung lensa okuler dapat diputar dan dicari posisi yang pas. -Hitung panjang dan lebar sel sebenarnya :
84
Hitung panjang dan lebar sel sebenarnya : x skala okuler X hasil kalibrasi y skala okuler X hasil kalibrasi misal : 5 X 1,54 = 7,7 µm 2 X 1,54 = 3,08 µm
Menentukan jumlah mikroorganisme (enumerasi) A. penghitungan jumlah bakteri hidup (tidak langsung) a.1. Plate Count (hitungan cawan) Plate count / viable count didasarkan pada asumsi bahwa setiap sel mikroorganisme hidup dalam suspensi akan tumbuh menjadi satu koloni setelah ditumbuhkan dalam media pertumbuhan dan lingkungan yang sesuai. Setelah diinkubasi, jumlah koloni yang tumbuh dihitung dan merupakan perkiraan atau dugaan dari jumlah mikroorganisme dalam suspensi tersebut. Koloni yang tumbuh tidak selalu berasal dari satu sel mikroorganisme karena beberapa mikroorganisme tertentu cenderung membentuk kelompok atau berantai. Berdasarkan hal tersebut digunakan istilah Coloni Forming Units (CFU’s) per ml. koloni yang tumbuh berasal dari suspensi yang diperoleh menggunakan pengenceran bertingkat dari sebuah sampel yang ingin diketahui jumlah bakterinya. Syarat koloni yang ditentukan untuk dihitung adalah sebagai berikut “ - Satu koloni dihitung 1 koloni. - Dua koloni yang bertumpuk dihitung 1 koloni. - Beberapa koloni yang berhubungan dihitung 1 koloni. - Dua koloni yang berhimpitan dan masih dapat dibedakan dihitung 2 koloni. - Koloni yang terlalu besar (lebih besar dari setengah luas cawan) tidah dihitung. - Koloni yang besarnya kurang dari setengah luas cawan dihitung 1 koloni.
85
Cara menghitung sel relatif / CFU’s per ml CFU’s / ml = jumlah koloni X faktor pengenceran Misal : penanaman dilakukan dari tabung pengenceran 10 -6 dengan metode Spread Plate dan Pour Plate. Spread plate : koloni = 50 = 50 x 106 CFU’s / 0,1 ml Fp = 1/10 -6 = 50 000 000 CFU’s / 0,1 ml SP = 0,1 ml = 500 000 000 CFU’s / ml = 5x108 CFU’s / ml Pour plate : koloni = 50 = 50 x 106 CFU’s / 1 ml Fp = 1/10 -6 = 50 000 000 CFU’s / 0,1 ml SP = 1 ml = 5x107 CFU’s / ml Penghitungan koloni pada cawan sebaiknya dibuat transek atau dibagi-bagi jika koloni yang tumbuh terlalu banyak. Transek dibuat dengan spidol/marker di bagian bawah cawan petri. Pola transek dapat dibuat bervariasi, tergantung kebutuhan. Penghitungan akan lebih mudah bila memakai Colony Counter. SYARAT-SYARAT PERHITUNGAN JUMLAH BAKTERI MENURUT AOAC (Association Of Official Analytical Chemistry) EDISI 14 Tahun 1984: a. Hitung jumlah koloni, kalikan jumlah koloni (atau rata-rata jumlah , jika dilakukan ulangan dalam pengenceran yang sama) dengan kebalikan dari pengencerannya. Catat pengenceran yang digunakan dan jumlah koloni yang terhitung atau diduga pada tiap petri. Untuk mencegah kesalahan ketelitian dan akurasi, catat hanya dua digit pertama saja. Digit kedua dapat ditingkatkan jika digit ketiga di atas 5. Gunakan nol untuk digit setelah digit kedua. Laporkan jumlah atau dugaan jumlah sebagai cfu/g atau cfu/mL
86
b. Jika jumlah pada ulangan petri atau pengenceran berurutan dirata-rata, hanya yang memenuhi syarat yang dirata-rata. Contoh: Pengenceran 1:100 jumlah koloni 224 dan 180 Pengenceran 1:1000 jumlah koloni 28 dan sp (spreader) Pengenceran 1:100 dirata-rata, hasilnya 202. Pengenceran 1:1000 yang diambil hanya 28 karena sp tidak memenuhi syarat.
280 1,4 202 280 202 241 rata rata 2 rasio/ perbanding an
jumlah mikroba = rata-rata x = 241 x
1 Fp
1 = 24.100 1.10 3
Karena digit ketiga kurang dari 5, maka jumlah mikroba adalah 24.000 cfu/g
ATURAN LENGKAP UNTUK PERHITUNGAN JUMLAH KOLONI 1.
Jumlah koloni 25-250 Seleksi petri dengan jumlah koloni antara 25 sampai 250, tidak termasuk sreader. Hitung semua koloni termasuk yang kecil, catat pengenceran yang digunakan lalu hitung jumlah mikrobanya. Pengenceran Jumlah mikroba (cfu/g atau cfu/mL) 1:100 1:1000 234* 23 23.000 Sp 31* 31.000 305 42* 42.000 243* kl 24.000 Keterangan: *= jumlah koloni yang memenuhi syarat Sp= spreader Kl= kesalahan laboratoris
87
2.
Ulangan Pakai pengenceran yang jumlah koloninya memenuhi syarat, lalu dirata-rata kemudian dikali Fp (faktor pengenceran)hingga diperoleh jumlah mikrobanya Contoh: Pengenceran 1:100 1:1000
Jumlah mikroba (cfu/g atau cfu/mL)
175 208 191,5
rata rata
175* 208*
2 1 jml 191,5 19.000cfu / g 1.10 2
16 17
Jika hanya satu petri dari pasangan petri yang memenuhi syarat 25-250, hitung kedua petri, kecuali untuk spreader Contoh: Pengenceran 1:100 1:1000
Jumlah mikroba (cfu/g atau cfu/mL) rata rata
275 24
3.
24 35*
jml 29,5
24 32 29,5 2
1 30.000cfu / g 1.10 3
Pengenceran berurutan dengan jumlah koloni 25-250 Jika jumlah koloni antara 25-250, maka cari rasio antar pengenceran. Apabila rasionya kurang dari 2, maka jumlah mikroba diperoeh dari nilai rata-rata. Jika rasionya lebih besar atau sama dengan 2, maka digunakan data dari pengenceran terendah Contoh: Pengenceran No 1 2 3 4
5
1:100
1:1000
243* 140* 228* 138* 162* 228* 240*
34* 32* 28* 42* 30* 28* 23 88
1,4 2,3 1,2
Jumlah (cfu/g atau cfu/mL) 29.000 14.000 25.000
2,4
15.000
1,1
25.000
rasio
224* 28* 1,4 180* sp Contoh perhitungan: Contoh no 1. Contoh no 4. 340 420 300 rasio 1,4 2 243 2 2,4 2 rasio 340 243 138 162 jumlah 29.000 2 2 6
jumlah
4.
20
1 33.000cfu / g 1.10 2
0 2 0
< 100 (dug) cfu/g < 1700 (dug) cfu/g
Tidak ada koloni yang tumbuh (tidak ada senyawa penghambat) Laporkan jumlah pendugaan dengan kurang dari pada pengenceran paling rendah Contoh: Pengenceran Jumlah mikroba (cfu/g atau cfu/mL) 1:100 1:1000 0
7.
jml 325
Semua petri dengan jumlah koloni kurang dari 25 Catat jumlah koloni yang sebenarnya pada pengenceran paling rendah dan laporkan sebagai dugaan cfu/mL atau cfu/g Contoh: Pengenceran Jumlah mikroba (cfu/g atau cfu/mL) 1:100 1:1000 0 18 16
6.
2
1 15.000 1.10 2
Tidak ada petri dengan jumlah koloni antara 25-250 dan salah satu petri memiliki jumlah koloni lebih dari 250, maka pilih yang paling mendekati 250 dan tulis sebagai hasil dugaan (dug)cfu/mL Contoh: Pengenceran Jumlah mikroba (cfu/g atau cfu/mL) 1:100 1:1000 325
5.
138 162 Fp 150
24.000
0
< 100 (dug) cfu/g
Jumlah koloni lebih dari 250 Hitung koloni dalam bagian petri berdasar distribusi yang mewakili.
89
8.
Jika dalam hitungan ada <10 koloni/ cm2, pilih dalam 12 cm2dengan cara 6 luasan horizontal berurutan dan 6 luasan sudut kanan berurutan Jika dalam hitungan ada <10 koloni/ cm2, hitung koloni dalam 4 luasan yang mewakili (seperti di atas) kalikan dengan rata-rata jumlah koloni per cm2 dengan luas petri (pada umumnya sekitar 56 cm2). spreader
tipe pertama / rantai koloni ciri: koloni tidak dapat dipisahkan secara tepat karena ada disintegrasi gumpalan bakteri ketika inokulum ditebarkan dalam media tanam. Jika satu atau lebih rantai jelas berasal dari sumber terpisah, hitung masingmasing sebagai 1 koloni. Jangan hitung tiap-tiap koloni individu dalam rantai sebagai koloni terpisah.
tipe kedua ciri: perkembangan koloni meluas dalam film air antara agar dan dasar petri, terjadi karena ada akumulasi kelembaban pada tiap sebaran asli spreader ini dapat mewakili pertumbuhan koloni individu jika pengenceran terdistribusi secara merata dalam medium tipe ketiga ciri: terbentuk dalam film air pada permukaan agar, sama seperti tipe kedua, spreader ini terjadi karena ada akumulasi kelembaban pada tiap sebaran asli spreader ini juga dapat mewakili pertumbuhan koloni individu jika pengenceran terdistribusi secara merata dalam medium
a.1.3 Prosedur perhitungan jumlah bakteri dengan metode Plate Count. Lakukan preparasi suspensi kepada sampel terlebih dahulu (swab, maserasi dan rinse) (jika perlu). Masukkan sampel ke tabung berisi 9 ml akuades untuk pengenceran pertama, selanjutnya diencerkan sampai tingkat pengenceran (misalnya sampai 10-8) tertentu. Dari 3 pengenceran terakhir diplating (ditanam) ke media NA (Nutrien Agar) atau PCA (Plate Count Agar) sebanyak dua kali tiap pengenceran (duplo). Plating dapat secara Spread Plate atau Pour Plate. Jika secara Spread Plate, dapat digunakan batang L atau glass beads. Inkubasi pada suhu 30º C selama 1-2 x 24 jam. Setelah tumbuh, koloni dihitung dengan persyaratan yang telah diuraikan di depan.
90
a.2 Most Probable Number (MPN) Pendekatan lain untuk enumerasi bakteri hidup adalah dengan metode MPN. MPN didasarkan pada metode statistik (teori kemungkinan). Metode MPN ini umumnya digunakan untuk menghitung jumlah bakteri pada air khususnya untuk mendeteksi adanya bakteri koliform yang merupakan kontaminan utama sumber air minum. Ciri-ciri utamanya yaitu bakteri gram negatif, batang pendek, tidak membentuk spora, memfermentasi laktosa menjadi asam dan gas yang dideteksi dalam waktu 24 jam inkubasi pada 37º C. Sampel ditumbuhkan pada seri tabung sebanyak 3 atau 5 buah tabung untuk setiap kelompok. Apabila dipakai 3 tabung maka disebut seri 3, dan jika dipakai 5 tabung maka disebut 5 seri. Media pada tabung adalah Lactose Broth yang diberi indikator perubahan pH dan ditambah tabung durham. Pemberian sampel pada tiap seri tabung berbeda-beda. Untuk sampel sebanyak 10 ml ditumbuhkan pada media LBDS (Lactose Broth Double Stregth) yang memiliki komposisi Beef extract (3 gr), peptone (5 gr), lactose (10 gr) dan Bromthymol Blue (0,2 %) per liternya. Untuk sampel 1 ml dan 0,1 ml dimasukkan pada media LBSS (Lactose Broth Single Stregth) yang berkomposisi sama tapi hanya kadar laktosa setengah dari LBDS yaitu 5 gr. Berdasar sifat coliform, maka bakteri ini dapat memfermentasikan laktosa menjadi asam dan gas yang dideteksi oleh berubahnya warna dan gas dalam tabung durham. Nilai MPN ditentukan dengan kombinasi jumlah tabung positif (asam dan gas) tiap serinya setelah diinkubasi.
Cara kerja : Sediakan 3 tabung berisi LBDS (9 ml tiap tabung) dan 6 tabung berisi LBSS (9 ml tiap tabung) lengkap dengan tabung durham. Atur kesembilan tabung menjadi 3 seri (seperti di gambar). Kocok botol yang berisi air sampel. Pindahkan suspensi air sample sebanyak 10 ml ke masing-masing tabung seri pertama (3 tabung LBDS), secara aseptis. Pindahkan suspensi air sampel sebanyak 1 ml ke masing-masing tabung seri kedua (3 tabung LBSS), secara aseptis. Pindahkan suspensi air sampel sebanyak 1 ml ke masing-masing tabung seri ketiga (3 tabung LBSS), secara aseptis. Inkubasi semua tabung pada suhu 37º C selama 48 jam. 91
Lihat tabung gas positif (asam dan gas ; harus ada keduanya), lalu hitung tabung positif untuk tiap seri. Tulis kombinasi tabung positif tiap seri (misal : 3 2 1). Kombinasi angka tersebut lalu dicocokkan dengan tabel MPN untuk seri 3 sehingga diperoleh jumlah mikroba sebenarnya.
Misal : didapatkan kombinasi jumlah tabung positif : 321 maka jumlah bakteri coliform adalah 150 sel/100 ml.
A. Penghitungan jumlah bakteri secara keseluruhan (langsung) Penghitungan secara langsung dapat dilakukan secara mikroskopis yaitu dengan menghitung jumlah bakteri dalam satuan isi yang sangat kecil. Alat yang digunakan adalah Petroff-Hauser Chamber atau Haemocytometer. Jumlah cairan yang terdapat antara coverglass dan alat ini mempunyai volume tertentu sehingga satuan isi yang terdapat dalam satu bujur sangkar juga tertentu. Ruang hitung terdiri dari 9 kotak besar dengan luas 1 mm². Satu kotak besar di tengah, dibagi menjadi 25 kotak sedang dengan panjang 0,2 mm. Satu kotak sedang dibagi lagi menjadi 16 kotak kecil. Dengan demikian satu kotak besar tersebut berisi 400 kotak kecil. Tebal dari ruang hitung ini 92
adalah 0,1 mm. Sel nakteri yang tersuspensi akan memenuhi volume ruang hitung tersebut sehingga jumlah bakteri per satuan volume dapat diketahui.
Luas kotak sedang : =pxl = 0,2 x 0,2 = 0,04 mm2 jadi misalnya diperoleh: Volume kotak sedang : 20 sel dalam satu kotak sedang = 0,04 mm2 x 0,1 mm maka jumlah sel keseluruhan : = 0,004 mm3 = 20 x (1/4) x 106 93
Karena 1 ml = 1cm2 = 5 x 106 sel/ml Maka : = 0,004 mm3 = 0,000004 cm3 = 4x10-6 ml Sel/ml = jumlah sel/4x10-6 ml Sel/mL= (jumlah sel/4) x 106 sel/mL= jumlah sel x (¼) x 106 sel/mL= jumlah sel x 2,5 x 105 Kotak sedang : Jumlah sel/ml = jumlah sel x 2,5 x 105 Dengan perhitungan yang sama maka diperoleh rumus untuk kotak kecil : Jumlah sel/ml = jumlah sel x 4 x 106 Cara kerja (digunakan kotak sedang) : Bersihkan Petroff-Hauser Counting Chamber atau Haemocytometer dengan alkohol 70 % lalu keringkan dengan tissue. Letakkan cover glass di atas alat hitung. Tambahkan ± 50 µl suspensi sel yeast (kira-kira 1 tetes) dengan cara meneteskan pada parit kaca pada alat hitung. Suspensi sel akan menyebar karena daya kapilaritas. Biarkan sejenak sehingga sel diam di tempat (tidak terkena aliran air dari efek kapilaritas). Letakkan alat hitung pada meja benda kemudian cari fokusnya pada perbesaran 40x10. Lakukan perhitungan secara kasar apakah diperlukan pengenceran atau tidak Jika dalam satu kotak sedang terdapat sel-sel yang banyak dan bertumpuk maka perhitungan akan tidak akurat dan diperlukan pengenceran dengan perbandingan 1:5 atau 1:10. Hitung sampel, paling tidak sebanyak 5 kotak sedang (lebih banyak lebih baik). Hasil perhitungan dirata-rata kemudian hasil rataan dimasukkan rumus untuk kotak sedang. Jika dilakukan pengenceran maka jumlah sel/ml dikalikan faktor pengenceran.
94
Bab 8 Uji Reaksi Enzimatik Enzim adalah katalisator organik (biokatalisator) yang dihasilkan oleh sel. Enzimberfungsi seperti katalisator anorganik, yaitu untuk mempercepat reaksi kimia. Setelahreaksi berlangsung, enzim tidak mengalami perubahan jumlah, sehingga jumlah enzimsebelum dan setelah reaksi adalah tetap. Enzim mempunyai selektivitas dan spesifitasyang tinggi terhadap reaktan yang direaksikan dan jenis reaksi yang dikatalisasi. Struktur Enzim Enzim tersusun atas dua bagian yaitu bagian protein (apoenzim) dan bagian nonprotein gugus prostetik). Gabungan antara aponzim dan koenzim disebut holoenzim. Pada umumnya enzim tersusun dari protein. Protein penyusun enzim dapatberupa protein sederhana atau protein yang terikat pada gugusan nonprotein. Banyakenzim yang hanya terdiri protein saja, misal tripsin. Dialisis enzim dapat memisahkan bagian-bagian protein, yaitu bagian proteinyang disebut apoenzim dan bagian nonprotein yang berupa koenzim, gugus prostetisdan kofaktor ion logam. Masing-masing bagian tersebut apabila terpisah menjadi tidakaktif. Apoenzim apabila bergabung dengan bagian nonprotein disebut holoenzim yangbersifat aktif sebagai biokatalisator.Koenzim dan gugus prostetik berfungsi sama. Koenzim adalah bagian yangterikat secara lemah pada apoenzim (protein). Gugus prostetik adalah bagian yangterikat dengan kuat pada apoenzim. Koenzim berfungsi menentukan jenis reaksi kimiayang dikatalisis enzim. Ion logam merupakan komponen yang sangat penting,diperlukan untuk memantapkan struktur protein dengan adanya interaksi antar muatan. Cara Kerja Enzim Enzim meningkatkan kecepatan reaksi dengan cara menurunkan energi aktivasi.Energi aktivasi adalah energi yang diperlukan untuk mengaktifkan suatu reaktansehingga dapat bereaksi untuk membentuk senyawa lain. Energi potensial hasil reaksimenjadi lebih rendah dari pada pereaksi, sehingga kesetimbangan reaksi menuju kehasil reaksi. Adanya enzim menyebabkan energi aktivasi menjadi lebih rendah, tetapienzim tidak mempengaruhi letak kesetimbangan reaksi.Saat berlangsungnya reaksi enzimatik terjadi ikatan sementara antara enzimdengan substratnya (reaktan). Ikatan sementara ini bersifat labil dan hanya untuk waktuyang singkat saja. Selanjutnya ikatan enzim-substrat akan pecah menjadi
95
enzim danhasil akhir. Enzim yang terlepas kembali setelah reaksi dapat berfungsi lagi sebagaibiokatalisator untuk reaksi yang sama. Reaksi enzim dapat dituliskan sebagai berikut; E enzim
+
S
ES
E+P
substrat
kompleks enzim substrat
enzim + produk
PENGGOLONGAN ENZIM Enzim dapat digolongkan berdasarkan tempat bekerjanya, substrat yangdikatalisis, daya katalisisnya, dan cara terbentuknya. Umumnya pemberian nama enzimdidasarkan atas nama substrat yang dikatalisis atau daya katalisisnya denganpenambahan kata –ase. Misal proteinase adalah enzim yang dapat mengkatalisispemecahan protein. 1. Penggolongan enzim berdasarkan tempat bekerjanya a. Endoenzim Endoenzim disebut juga enzim intraseluler, yaitu enzim yang bekerjanya didalam sel. Umumnya merupakan enzim yang digunakan untuk proses sintesis di dalamsel dan untuk pembentukan energi (ATP) yang berguna untuk proses kehidupan sel,misal dalam proses respirasi. b. Eksoenzim Eksoenzim disebut juga enzim ekstraseluler, yaitu enzim yang bekerjanya di luarsel. Umumnya berfungsi untuk “mencernakan” substrat secara hidrolisis, untuk dijadikan molekul yang lebih sederhana dengan BM lebih rendah sehingga dapat masuk elewati membran sel. Energi yang dibebaskan pada reaksi pemecahan substrat di luar sel tidak digunakan dalam proses kehidupan sel. 2. Penggolongan enzim berdasarkan daya katalisis a. Oksidoreduktase Enzim ini mengkatalisis reaksi oksidasi-reduksi, yang merupakan pemindahanelektron, hidrogen atau oksigen. Sebagai contoh adalah enzim elektron transferoksidase dan hidrogen peroksidase (katalase). Ada beberapa macam enzim electron transfer oksidase, yaitu enzim oksidase, oksigenase, hidroksilase dan dehidrogenase. b. Transferase Transferase mengkatalisis pemindahan gugusan molekul dari suatu molekul kemolekul yang lain. Sebagai contoh adalah beberapa enzim sebagai berikut: - Transaminase adalah transferase yang memindahkan gugusan amina. - Transfosforilase adalah transferase yang memindahkan gugusan fosfat. - Transasilase adalah transferase yang memindahkan gugusan asil.
96
c. Hidrolase Enzim ini mengkatalisis reaksi-reaksi hidrolisis, dengan contoh enzim adalah: - Karboksilesterase adalah hidrolase yang menghidrolisis gugusan ester karboksil. - Lipase adalah hidrolase yang menghidrolisis lemak (ester lipida). - Peptidase adalah hidrolase yang menghidrolisis protein dan polipeptida. d. Liase Enzim ini berfungsi untuk mengkatalisis pengambilan atau penambahan gugusan dari suatu molekul tanpa melalui proses hidrolisis, sebagai contoh adalah: - L malat hidroliase (fumarase) yaitu enzim yang mengkatalisis reaksi pengambilan air dari malat sehingga dihasilkan fumarat. - Dekarboksiliase (dekarboksilase) yaitu enzim yang mengkatalisis reaksi pengambilan gugus karboksil. e. Isomerase Isomerase meliputi enzim-enzim yang mengkatalisis reaksi isomerisasi, yaitu: - Rasemase, merubah l-alanin D-alanin - Epimerase, merubah D-ribulosa-5-fosfat D-xylulosa-5-fosfat - Cis-trans isomerase, merubah transmetinal cisrentolal - Intramolekul ketol isomerase, merubah D-gliseraldehid-3-fosfat dihidroksi aseton fosfat - Intramolekul transferase atau mutase, merubah metilmalonil-CoA suksinilCoA f. Ligase Enzim ini mengkatalisis reaksi penggabungan 2 molekul dengan dibebaskannyamolekul pirofosfat dari nukleosida trifosfat g. Enzim lain dengan tatanama berbeda Ada beberapa enzim yang penamaannya tidak menurut cara di atas, misalnya enzim pepsin, triosin, dan sebagainya serta enzim yang termasuk enzim permease. Permease adalah enzim yang berperan dalam menentukan sifat selektif permiabel dari membran sel. 3. Penggolongan enzim berdasar cara terbentuknya a. Enzim konstitutif Di dalam sel terdapat enzim yang merupakan bagian dari susunan sel normal,sehingga enzim tersebut selalu ada umumnya dalam jumlah tetap pada sel hidup.Walaupun demikian ada enzim yang jumlahnya dipengaruhi kadar substratnya, misalnyaenzim amilase. Sedangkan enzim-enzim yang berperan dalam proses respirasijumlahnya tidak dipengaruhi oleh kadar substratnya.
97
b. Enzim adaptif Perubahan lingkungan mikroba dapat menginduksi terbentuknya enzim tertentu.Induksi menyebabkan kecepatan sintesis suatu enzim dapat dirangsang sampaibeberapa ribu kali. Enzim adaptif adalah enzim yang pembentukannya dirangsang oleh adanya substrat. Sebagai contoh adalah enzim beta galaktosidase yang dihasilkan oleh bakteri E.coli yang ditumbuhkan di dalam medium yang mengandung laktosa. Mula-mulaE. coli tidak dapat menggunakan laktosa sehingga awalnya tidak nampak adanya pertumbuhan (fase lag/fase adaptasi panjang) setelah beberapa waktu barumenampakkan pertumbuhan. Selama fase lag tersebut E. coli membentuk enzim beta galaktosidase yang digunakan untuk merombak laktosa. FAKTOR-FAKTOR YANG MEMPENGARUHI REAKSI ENZIMATIK Protein adalah bagian utama enzim yang dihasilkan sel, maka semua hal yang dapat mempengaruhi protein dan sel akan berpengaruh terhadap reaksi enzimatik. 1. Substrat (reaktan) Kecepatan reaksi enzimatik umumnya dipengaruhi kadar substrat. Penambahankadar substrat sampai jumlah tertentu dengan jumlah enzim yang tetap, akanmempercepat reaksi enzimatik sampai mencapai maksimum. Penambahan substratselanjutnya tidak akan menambah kecepatan reaksi.Kecepatan reaksi enzimatik juga dipengaruhi kadar enzim, jumlah enzim yangterikat substrat (ES) dan konstanta Michaelis (Km). Km menggambarkan mesetimbangandisosiasi kompleks ES menjadi enzim dan substrat. Nilai Km kecil berarti enzimmempunyai afinitas tinggi terhadap substrat maka kompleks ES sangat mantap,sehingga kesetimbangan reaksi kearah kompleks ES. Apabila nilai Km besar berartienzim mempunyai afinitas rendah terhadap substrat, sehingga kesetimbangan reaksikearah E + S. 2. Suhu Seperti reaksi kimia pada umumnya, maka reaksi enzimatik dipengaruhi olehsuhu. Kenaikan suhu sampai optimum akan diikuti pula oleh kenaikan kecepatan reaksienzimatik. Kepekaan enzim terhadap suhu pada keadaan suhu melebihi optimumdisebabkan terjadinya perubahan fisikokimia protein penyusun enzim. Umumnya enzimmengalami kerusakan (denaturasi) pada suhu diatas 50oC. Walaupun demikian adabeberapa enzim yang tahan terhadap suhu tinggi, misalnya taka-diastase dan tripsin. 3. Kemasaman (pH) pH dapat mempengaruhi aktivitas enzim. Daya katalisis enzim menjadi rendahpada pH rendah maupun tinggi, karena terjadinya denaturasi protein enzim. Enzimmempunyai gugus aktif yang bermuatan positif (+) dan negatif (-). Aktivitas enzim akanoptimum kalau terdapat keseimbangan antara kedua muatannya. Pada keadaan masammuatannya cenderung positif, dan pada keadaan basis muatannya cenderung negative sehinggaaktivitas enzimnya 98
menjadi berkurang atau bahkan menjadi tidak aktif. pHoptimum untuk masingmasing enzim tidak selalu sama. Sebagai contoh amilase jamurmempunyai pH optimum 5,0, arginase mempunyai pH optimum 10. 4. Penghambat enzim (inhibitor) Inhibitor enzim adalah zat atau senyawa yang dapat menghambat enzim dengan beberapa cara penghambatan sebagai berikut: a. Penghambat bersaing (kompetitif) Penghambatan disebabkan oleh senyawa tertentu yang mempunyai strukturmirip dengan substrat saat reaksi enzimatik akan terjadi. Misalnya asam malonat dapatmenghambat enzim dehidrogenase suksinat pada pembentukan asam fumarat darisuksinat. Struktur asam suksinat mirip dengan asam malonat. Dalam reaksi ini asammalonat bersaing dengan asam suksinat (substrat) untuk dapat bergabung denganbagian aktif protein enzim dehidrogenase. Penghambatan oleh inhibitor dapat dikurangidengan menambah jumlah substrat sampai berlebihan. Daya penghambatannyadipengaruhi oleh kadar penghambat, kadar substrat dan aktivitas relatif antarapenghambat dan substrat. b. Penghambat tidak bersaing (non-kompetitif) Zat-zat kimia tertentu mempunyai afinitas yang tinggi terhadap ion logampenyusun enzim. Senyawa-senyawa seperti sianida, sulfida, natrium azida, dan karbonmonooksida adalah senyawa penghambat untuk enzim yang mengandung Fe, yaitudengan terjadinya reaksi antara senyawasenyawa tersebut dengan ion Fe yangmenyebabkan enzim menjadi tidak aktif. Merkuri (Hg) dan perak (Ag) merupakanpenghambat enzim yang mengandung gugusan sulfhidril (-SH). Pada penghambatan nonkompetitif tidak terjadi persaingan antara zatpenghambat dengan substrat. Misalnya enzim sitokrom oksidase dihambat oleh CO(karbon monooksida) dengan mengikat Fe yang merupakan gugusan aktif enzimtersebut. Penghambatan nonkompetitif tidak dapat dikurangi dengan penambahanjumlah substrat, oleh karena daya penghambatannya dipengaruhi oleh kadarpenghambat dan afinitas penghambat terhadap enzim. c. Penghambat umpan balik (feed back inhibitor) Penghambatan umpan balik disebabkan oleh hasil akhir suatu rangkaian reaksienzimatik yang menghambat aktifitas enzim pada reaksi pertama. Hasil akhir reaksi jugamempengaruhi pembentukan enzim. d. Penghambat represor Represor adalah hasil akhir suatu rangkaian reaksi enzimatik yang dapatmempengaruhi atau mengatur pembentukan enzim-enzim pada reaksi sebelumnya. e. Penghambat alosterik Penghambat alosterik adalah penghambat yang dapat mempengaruhi enzimalosterik. Enzim alosterik adalah enzim yang mempunyai dua bagian
99
aktif, yaitu bagianaktif yang menangkap substrat dan bagian yang menangkap penghambat. Apabila adasenyawa yang dapat memasuki bagian yang menangkap penghambat maka enzimmenjadi tidak aktif, senyawa penghambat tersebut merupakan penghambat alosterik.Struktur senyawa penghambat alosterik tidak mirip dengan struktur substrat. Pengikatanpenghambat alosterik pada enzim menyebabkan enzim tidak aktif, sehingga substrattidak dapat dikatalisis dan tidak menghasilkan produk. Apabila enzim menangkapsubstrat maka penghambat tidak dapat terikat pada enzim, sehingga enzim dapat aktifmereaksikan substrat menjadi produk. 5. Aktivator (penggiat) atau kofaktor Aktivator atau kofaktor adalah suatu zat yang dapat mengaktifkan enzim yangsemula belum aktif. Enzim yang belum aktif disebut pre-enzim atau zymogen (simogen).Kofaktor dapat berbentuk ion-ion dari unsur H, Fe, Cu, Mg, Mo, Zn, Co, atau berupakoenzim, vitamin, dan enzim lain. 7. Penginduksi (induktor) Induktor adalah suatu substrat yang dapat merangsang pembentukan enzim.Sebagai contoh adalah laktosa dapat menginduksi pembentukan enzim beta galaktosidase.
Aktivitas enzimatis mikroorganisme : a. Uji aktivitas eksoenzim : Ø Uji amilolitik Ø Uji lipolitik Ø Uji proteolitik b. Uji aktivitas endoenzim : Ø Uji oksidase Ø Uji katalase Ø Uji Triple Sugar Iron Agar Uji Amilolitik Amilum adalah senyawa yang memiliki berat molekul tinggi, terdiri atas polimer glukosa yang bercabang-cabang yang diikat dengan ikatan glikosidik. Degradasi amilum membutuhkan enzim amilase yang akan memecah/menghidrolisis menjadi polisakarida yang lebih pendek (dextrin), dan selanjutnya menjadi maltosa. Hidrolisis akhir maltosa menghasilkan glukosa terlarut yang dapat ditransport masuk ke dalam sel. Indikator yang dipakai pada
100
uji amilolitik adalah iodine. Amilum akan bereaksi dengan iodine membentuk warna biru hitam yang terlihat pada media. Prosedur di bawah ini menunjukkan aktivitas amilase. NA yang tersuspensi pati digunakan sebagai media. Indikator yang dipakai adalah iodine. Amilum akan bereaksi dengan iodine membentuk komplex warna biru hitam yang terlihat pada media. Warna biru hitam terjadi jika iodine masuk ke dalam bagian kosong pada amilum yang berbentuk spiral.
Cara Kerja : · Inokulasi Nutrient Agar yang mengandung pati (2 g/l) dengan E.coli dan Bacillus sp. secara streak. · Inkubasi selama 48 jam pada suhu 37oC · Setelah selesai inkubasi, tetesi cawan dengan lugol’siodine secukupnya sehingga seluruh permukaan media terkena. · Hidrolisis zat pati terlihat sebagai zona jernih di sekeliling koloni, sedangkan hasil negatif ditunjukkan warna sekitar koloni tetap biru hitam.
101
Uji Lipolitik Lipid misalnya trigliserida merupakan sumber energi bagi sejumlah mikroorganisma. Untuk mendapatkan energi dari lipid, mikroba menghasilkan enzim lipase dan esterase yang memecah ikatan ester menghasilkan gliserol dan asam lemak. Terdapat berbagai macam prosedur untuk mengetahui aktivitas lipase diantaranya adalah dengan menggunakan media TrybutirinAgar, RodhamineAgar dan SpiritBlueAgar. Pada prinsipnya metode-metode di atas menggunakan indikator yang mampu mendeteksi keberadaan asam lemak yang terbentuk akibat hidrolisis lemak. Cara Kerja : · Inokulasikan Bacillus sp. dan E. coli pada mediaTributyrin Agar dengan indikator neutral red · Inkubasi pada suhu 37oC selama 48 jam. · Reaksi positif ditandai oleh bercak-bercak kuning disekeliling koloni, sedangkan reaksi negatif ditandai oleh bercak-bercak yang tetap berwarna merah.
Uji proteolitik Uji proteolitik ditujukan untuk mengetahui kemampuan mikroorganisme menghasilkan enzim protease. Pada praktikum ini protein yang digunakan dalam bentuk kasein susu. Hidrolisis kasein secara bertahap akan menghasilkan monomernya berupa asam amino. Proses ini dinamakan peptonisasi atau proteolisis
102
Cara Kerja : · Inokulasikan Bacillus sp. Dan E. coli pada Skim Milk Agar (SMA) · Inkubasi pada suhu 37oC selama 48 jam. · Aktivitas proteolitik ditunjukkan oleh terbentuknya zone jernih di sekeliling koloni. Uji Oksidase
Enzim oksidase memegang peranan penting dalam transport elektron selama respirasi aerobik. Sitokrom oksidase mengkatalisis oksidasi dan reduksi sitokrom oleh molekul oksigen. Enzim oksidase dihasilkan oleh bakteri aerob, fakultatif anaerob, dan mikroaerofilik. Mikroorganisme ini menggunakan oksigen, sebagai akseptor elektron terakhir selama penguraian karbohidrat untuk menghsilkan energi. Kemampuan bakteri memproduksi sitokrom oksidase dapat diketahui dari reaksi yang ditimbulkan setelah pemberian reagen oksidase pada koloni bakteri. Enzim ini merupakan bagian dari kompleks enzim yang berperan dalam proses fosforilasi oksidatif. Reagen yang digunakan adalah tetramethyl-D-phenylene diamine dihydrocloride. Reagen akan mendonorkan elektron terhadap enzim ini sehingga akan teroksidasi membentuk senyawa yang berwarna biru kehitaman. Positif tertunda (warna biru muncul antara 10-60 detik setelah ditetesi) menandakan bahwa bakteri uji memiliki sedikit enzim. Tidak adanya perubahan warna mengindikasikan bahwa uji yang dilakukan negatif.
103
Cara Kerja : · Koloni bakteri diambil satu tetes (sebaiknya dari biakan cair) secara aseptis dan diinokulasikan pada Objectglass. · Diatas object glass diberi kertas merang yang sehingga tetesan tersebar pada kertas. · Tetesi dengan reagen, lalu lihat perubahan yang terjadi · Jika warna berubah menjadi biru marun maka hasil uji positif, sedangkan bila tidak terjadi perubahan maka hasil uji negatif. Hasil uji positif tertunda jika warna biru muncul antara 10-60 detik setelah ditetesi.
Uji Katalase Selama respirasi aerobik (proses fosforilasi oksidatif), mikroorganisme menghasilkan hidrogen peroksida, bahkan ada yang menghasilkan superoksida yang sangat beracun. Senyawa ini dalam jumlah besar akan menyebabkan kematian pada mikroorganisme. Senyawa ini dihasilkan oleh mikroorganisme aerobik, fakultatif aerob maupun mikroaerofilik yang menggunakan jalur respirasi aerobik.
Superoksida dismutase adalah enzim yang bertanggung jawab untuk penguraian khususnya superoksida pada organisme aerob yang bersifat 104
katalase negatif. Produksi katalase bisa diidentifikasi dengan menanmbahkan reagen H2O2 pada suspensi bakteri. Jika dihasilkan gelembung gas, berarti bakteri tersebut mampu memproduksi enzim katalase. Jika tidak dihasilkan gelembung gas berarti uji katalase dinyatakan negatif. Cara Kerja : · Koloni bakteri diambil satu ose secara aseptis dan diinokulasikan pada Objectglass. · Dengan menggunakan pipet tetes, 3% H2O2 diteteskan pada Objectglass secukupnya. · Amati adanya gelembung untuk hasil positif dan tidak ada gelembung untuk hasil negatif (hati-hati membedakan antara gelembung yang muncul dari sel dengan kumpulan sel yang mengambang akibat ditambahi reagen).
Uji Triple Sugar Iron Agar TSIA adalah uji yang dirancang untuk membedakan beberapa jenis bakteri yang termasuk kelompok Enterobacteriaceae, yang bersifat gram negatif dan memfermentasikan glukosa membentuk asam sehingga dapat dibedakan dengan bakteri gram negatif intestinal lain. Perbedaan ini didasarkan pada pola fermentasi karbohidrat dan produksi H2S pada tabung reaksi. Untuk mengamati fermentasi karbohidrat, media TSIA mengandung laktosa dan sukrosa dengan konsentrasi 1%, dan mengandung glukosa dengan konsentrasi yang lebih rendah yaitu 0,1%. Konsentrasi ini akan berpengaruh terhadap penggunaan karbohidrat dan keadaan asam yang terbentuk. Indikator pH (Phenol Red) ditambahkan untuk menunjukkan adanya perubahan pH akibat fermentasi karbohidrat. Perubahan warna menjadi kuning menandakan asam, sedangkan warna menjadi lebih merah menendakan media menjadi basa. Warna media mula-mula adalah merahorange. Selain itu ditambahkan FeSO4 untuk mendeteksi adanya gas H2S.
105
Cara kerja : · Inokulasikan biakan pada media TSIA dengan cara inokulasi tusuk kemudian dilanjutkan dengan diulaskan lurus tegak pada agar miring (lihat gambar). · Inkubasi pada 37oC selama 24-48 jam. · Interpretasikan hasil dengan melihat keterangan dibawah ini.
= slant dan butt merah (alkali) atau tidak terjadi perubahan warna&tidak terjadi fermentasi karbohidrat, sedangkan pepton yang ada digunakan untuk sumber energi dalam keadaan aerob atau anaerob sehingga meningkatkan pH karena produksi amonia meningkat sebagai hasil samping metabolisme protein. Jika kemerahan lebih pekat pada slant maka terjadi degradasi aerobik peptone, sedangkan warna merah pekat tampak di semua media maka interpretasinya adalah degradasi peptone secara aerob maupun anaerob. = slant merah (alkali) sedangkan butt kuning (asam) dengan atau tanpa produksi gas &hanya terjadi fermentasi glukosa, sedangkan fermentasi laktosa dan sukrosa tidak terjadi. Sel lebih memilih untuk mendegradasi glukosa terlebih dahulu karena glukosa adalah monosakarida yang dapat langsung massuk ke dalam jalur metabolisme (glikolisis). Media mengandung glukosa yang sangat sedikit (lebih sedikit dibanding laktosa dan sukrosa) sehingga jumlah asam pada permukaan (slant) hilang secara cepat menjadi basa, karena pada mulanya bagian slant telah menjadi kuning tapi dalam waktu lebih dari 24 jam sel akan kehabisan glukosa dan memilih untuk memanfaatkan protein sehingga media menjadi merah.
= slant dan butt kuning (asam) dengan atau tidak adanya gas à telah terjadi fermentasi glukosa, laktosa dan atau sukrosa karena laktosa dan sukrosa memiliki konsentrasi yang lebih tinggi sehingga dapat dimanfaatkan untuk substrat fermentasi lanjutan (jika glukosa habis) menghasilkan asam yang ditandai warna kuning setelah 24 jam.
106
= butt berwarna kehitaman&adanya H2S yang bereaksi dengan senyawa besi FeSO4 pada media menghasilkan FeS yang berwarna kehitamhitaman. H2S ini merupakan hasil dari metabolisme protein
media pecah atau terangkat&timbul gas sebagai hasil samping fermentasi
107
Bab 9 Analisa Mikroba &Dalam Air Air adalah materi esensial di dalam kehidupan. Tidak satu pun mahluk hidup di dunia ini yang tidak memerlukan dan tidak mengandung air. Sel hidup, baik tumbuhan maupun hewan, sebagian besar tersusun oleh air, seperti di dalam sel tumbuhan terkandung lebih dari 75% atau di dalam sel hewan terkandung lebih dari 67%. Dari sejumlah 40 juta mil-kubik air yang berada di permukaan dan di dalam tanah, ternyata tidak lebih dari 0,5% (0,2 juta mil-kubik) yang secara langsung dapat digunakan untuk kepentingan manusia. Karena 97% dari sumber air tersebut terdiri dari air laut, 2,5% berbentuk salju abadi yang baru dalam kedaan mencair dapat digunakan. Pengadaan air bersih untuk kepentingan rumah tangga seperti untuk air minum, air mandi, dan sebagainya harus memenuhi persyaratan yang sudah ditentukan peraturan internasional (WHO dan APHA) ataupun peraturan nasional dan setempat. Dalam hal ini kualitas air bersih di Indonesia harus memenuhi persyaratan yang tertuang di dalam Peraturan Menteri Kesehatan RI No.173/Men.Kes/Per/VIII/77 dimana setiap komponen yang diperkenankan berada di dalamnya harus sesuai. Kualitas air tersebut menyangkut : a) Kualitas fisik yang meliputi kekeruhan, temperatur, warna, bau dan rasa. Kekeruhan air dapat ditimbulkan oleh adanya bahan-bahan organik dan anorganik yang terkandung di dalam air seperti lumpur dan bahan-bahan yang berasal dari buangan. Dari segi estetika, kekeruhan di dalam air dihubungkan dengan kemungkinan pencemaran oleh air buangan. b) Kualitas kimia yang berhubungan dengan ion-ion senyawa atau pun logam yang membahayakan, di samping residu dari senyawa lainnya yang bersifat 108
racun, seperti antara lain residu pestisida. Dengan adanya senyawa-senyawa ini kemungkinan besar bau, rasa dan warna air akan berubah, seperti yang umum disebabkan oleh adanya perubahan pH air. Pada saat ini kelompok logam berat seperti Hg, Ag, Pb, Cu, Zn, tidak diharapkan kehadirannya di dalam air. c) Kualitas biologis, berhubungan dengan kehadiran mikroba patogen (penyebab penyakit, terutama penyakit perut), pencemar (terutama bakteri coli) dan penghasil toksin. Air tawar bersih yang layak minum, kian langka di perkotaan. Sungaisungai yang menjadi sumbernya sudah tercemar berbagai macam limbah, mulai dari buangan sampah organik, rumah tangga hingga limbah beracun dari industri. Air tanah sudah tidak aman dijadikan bahan air minum karena telah terkontaminasi rembesan dari tangki septic maupun air permukaan. Banyak jenis bakteri atau fungi di dalam badan air berlaku sebagai jasad ”dekomposer”, artinya jasad tersebut mempunyai kemampuan untuk mengurai atau merombak senyawa yang berada dalam badan air. Sehingga kehadirannya dimanfaatkan dalam pengolahan buangan di dalam air secara biologis. Kehadiran senyawa hasil rombakan bakteri atau fungi dimanfaatkan oleh jasad pemakai/ konsumen. Tanpa adanya jasad pemakai kemungkinan besar akumulasi hasil uraian tersebut dapat mengakibatkan keracunan terhadap jasad lain, khususnya ikan. Pada umumnya mikroalgae mempunyai klorofil, sehingga dapat melakukan fotosintesis dengan menghasilkan oksigen. Di dalam air, kegiatan fotosintesis akan menambah jumlah oksigen, sehingga nilai kelarutan oksigen akan naik/ ber-tambah, ini yang diperlukan oleh kehidupan di dalam air. Yang paling dikuatirkan, bila di dalam badan air terdapat mikroba penyebab penyakit, seperti : Salmonella penyebab penyakit tifus/ paratifus, Shigella penyebab penyakit disentri basiler, Vibrio penyebab penyakit kolera, Entamoeba penyebab disentri amuba. Di dalam air juga ditemukan mikroba penghasil toksin seperti : Clostridium yang hidup anaerobik,
109
yang hidup
aerobik misalnya : Pseudomonas, Salmonella, Staphyloccus, serta beberapa jenis mikroalgae seperti Anabaena dan Microcystis. Sering juga didapatkan warna air cepat berubah bila disimpan, padahal air tersebut berasal dari air pompa, misal di daerah permukiman baru yang tadinya persawahan. Ini disebabkan oleh adanya bakteri besi misal Crenothrix yang mempunyai kemampuan untuk mengoksidasi senyawa ferro menjadi ferri. Di permukiman baru yang asalnya persawahan, kalau air pompa disimpan menjadi berbau (bau busuk). Ini disebabkan oleh adanya bakteri belerang misal Thiobacillus yang mempunyai kemampuan mereduksi senyawa sulfat menjadi H2S. Badan dan warna air dapat berubah menjadi berwarna hijau, biru-hijau atau warna-warna lain yang sesuai dengan warna yang dimiliki oleh mikroalgae. Bahkan suatu proses yang sering terjadi pada danau atau kolam yang besar yang seluruh permukaan airnya ditumbuhi oleh algae yang sangat banyak dinamakan blooming. Biasanya jenis mikroalgae yang berperan di dalamnya adalah Anabaena flosaquae dan Microcystis aerugynosa. Ada pernyataan bahwa air jernih belum tentu bersih. Ini dihubungkan dengan keadaan bahwa air, sejak keluar dari mata air, sumur, ternyata sudah mengandung mikroba, khususnya bakteri atau mikroalgae. Pada air yang kotor atau sudah tercemar, misal air sungai, air kolam, air danau dan sumbersumber lainnya, disamping akan didapati mikroba seperti pada air jernih, juga kelompok mikroba lainnya yang tergolong penyebab penyakit, penghasil toksin, penyebab blooming, penyebab korosi, penyebab deteriorasi, penyebab pencemaran ini adalah bakteri coli. Dalam bidang mikrobiologi pangan dikenal istilah bakteri indikator sanitasi. Dalam hal ini, pengertian pangan adalahpangan seperti yang tercantum pada Undang-Undang Pangan Nomor 7 tahun 1996 yang mencakup makanan dan minuman (termasuk air minum). Bakteri indikator sanitasi adalah bakteri yang keberadaannya dalam pangan menunjukkan bahwa air atau makanan tersebut pernah tercemar oleh feses manusia. Bakteri-bakteri indikator sanitasi umumnya adalah bakteri yang lazim terdapat dan hidup
110
pada usus manusia. Jadi, adanya bakteri tersebut pada air atau makanan menunjukkan bahwa dalam satu atau lebih tahap pengolahan air atau makanan pernah mengalami kontak dengan feses yang berasal dari usus manusia dan oleh karenanya mungkin mengandung bakteri patogen lain yang berbahaya. Koliform merupakan suatu grup bakteri yang digunakan sebagai indicator adanya polusi kotoran dan kondisi yang tidak baik terhadap air, makanan, susu dan produk-produk susu. Koliform sebagai suatu kelompok dicirikan sebagai bakteri berbentuk batang, gram negatif, tidak membentuk spora, aerobik dan anaerobic fakultatif yang memfermentasi laktosa dengan menghasilkan asam dan gas dalam waktu 48 jam pada suhu 35oC. Adanya bakteri koliform di dalam makanan/ minuman menunjukkan kemungkinan adanya mikroba yang bersifat entero patogenik dan atau toksigenik yang berbahaya bagi kesehatan. Bakteri koliform dapat dibedakan menjadi 2 grup yaitu : (1) koliform fekal, misalnya Escherichia coli (2) koliform non fekal, misalnya Enterobacter aerogenes. Escherichia coli merupakan bakteri yang berasal dari kotoran hewan atau manusia, sedangkan Enterobacter aerogenes biasanya ditemukan pada hewan atau tanam-tanaman yang telah mati. Jadi, adanya Escherichia coli dalam air minum menunjukkan bahwa air minum itu pernah terkontaminasi feses manusia dan mungkin dapat mengandung patogen usus. Oleh karena itu, standar air minum mensyaratkan Escherichia coli harus nol dalam 100 ml. Untuk mengetahui jumlah koliform di dalam contoh digunakan metode Most Probable Number ( MPN ). Pemeriksaan kehadiran bakteri coli dari air dilakukan berdasarkan penggunaan medium kaldu laktosa yang ditempatkan di dalam tabung reaksi berisi tabung durham (tabung kecil yang letaknya terbalik, digunakan untuk menangkap gas yang terjadi akibat fermentasi laktosa menjadi asam dan gas). Tergantung kepada kepentingan, ada yang menggunakan sistem 3-3-3 (3 tabung untuk10 ml, 3 tabung untuk 1,0 ml, 3 tabung untuk 0,1 ml) atau 5-5-5. Kehadiran bakteri coli besar pengaruhnya
111
terhadap kehidupan manusia, terbukti dengan kualitas air minum, secara bakteriologis tingkatannya ditentukan oleh kehadiran bakteri tersebut (tabel 1).
Uji Kualitatif Koliform Uji kualitatif koliform secara lengkap terdiri dari 3 tahap yaitu (1) Uji penduga (presumptive test), (2) Uji penguat (confirmed test) dan Uji pelengkap (completed test). Uji penduga juga merupakan uji kuantitatif koliform menggunakan metode MPN. 1. Uji penduga (presumptive test) Merupakan tes pendahuluan tentang ada tidaknya kehadiran bakteri koliform berdasarkan terbentuknya asam dan gas disebabkan karena fermentasi laktosa oleh bakteri golongan koli. Terbentuknya asam dilihat dari kekeruhan pada media laktosa, dan gas yang dihasilkan dapat dilihat dalam tabung Durham berupa gelembung udara. Tabung dinyatakan positif jika terbentuk gas sebanyak 10% atau lebih dari volume di dalam tabung Durham. Banyaknya kandungan bakteri Escherichia coli dapat dilihat dengan menghitung tabung yang menunjukkan reaksi positif terbentuk asam dan gas dan dibandingkan dengan tabel MPN. Metode MPN dilakukan untuk menghitung jumlah mikroba di dalam contoh yang berbentuk cair. Bila inkubasi 1 x 24 jam hasilnya negatif, maka dilanjutkan dengan inkubasi 2 x 24 jam pada suhu 350C. Jika dalam waktu 2 x 24 jam tidak terbentuk gas
112
dalam tabung Durham, dihitung sebagai hasil negatif. Jumlah tabung yang positif dihitung pada masing-masing seri. MPN penduga dapat dihitung dengan melihat tabel MPN. 2. Uji penguat (confirmed test) Hasil uji dugaan dilanjutkan dengan uji ketetapan. Dari tabung yang positif terbentuk asam dan gas terutama pada masa inkubasi 1x 24 jam, suspensi ditanamkan pada media Eosin Methylen Biru Agar ( EMBA ) secara aseptik dengan menggunakan jarum inokulasi. Koloni bakteri Escherichia coli tumbuh berwarna merah kehijauan dengan kilat metalik atau koloni berwarna merah muda dengan lendir untuk kelompok koliform lainnya. 3. Uji pelengkap (completed test) Pengujian
selanjutnya
dilanjutkan
dengan
uji
kelengkapan
untuk
menentukan bakteri Escherichia coli. Dari koloni yang berwarna pada uji ketetapan diinokulasikan ke dalam medium kaldu laktosa dan medium agar miring Nutrient Agar ( NA ), dengan jarum inokulasi secara aseptik. Diinkubasi pada suhu 370C selama 1 x 24 jam. Bila hasilnya positif terbentuk asam dan gas pada kaldu laktosa, maka sampel positif mengandung bakteri Escherichia coli. Dari media agar miring NA dibuat pewarnaan Gram dimana bakteri Escherichia coli menunjukkan Gram negatif berbentuk batang pendek. Untuk membedakan bakteri golongan koli dari bakteri golongan colifekal (berasal dari tinja hewan berdarah panas), pekerjaan dibuat Duplo, dimana satu seri diinkubasi pada suhu 370C (untuk golongan koli ) dan satu seri diinkubasi pada suhu 420C (untuk golongan koli fekal). Bakteri golongan koli tidak dapat tumbuh dengan baik pada suhu 420C, sedangkan golongan koli fekal dapat tumbuh dengan baik pada suhu 420C. Standar Nasional Indonesia (SNI) mensyaratkan tidak adanya coliform dalam100 ml air minum. Akan tetapi United States Enviromental Protection Agency (USEPA) lebih longgar persyaratan uji coliformnya mengingat coliform belum tentu menunjukkan adanya kontaminasi feses manusia,
113
apalagi adanya patogen. USEPA mensyaratkan presence/absence test untuk coliform pada air minum, dimana dari 40 sampel air minum yang diambil paling banyak 5% boleh mengandung coliform. Apabila sampel yang diambil lebih kecil dari 40, maka hanya satu sampel yang boleh positif mengandung coliform. Meskipun demikian, USEPA mensyaratkan pengujian indikator sanitasi lain seperti protozoa Giardia lamblia dan bakteri Legionella. Pada air bukan untuk minum umumnya terdapat perbedaan persyaratan coliform dan Escherichia coli. Air untuk kolam renang (primary contact water) misalnya mensyaratkan kandungan coliform <2,4 x103, tetapi syarat Escherichia coli tentunya lebih ketat, yaitu < 1 x 103 dalam 100 ml. 4. Uji identifikasi Dengan melakukan reaksi IMVIC (Indole, Methyl red, Voges-Proskauer tes, penggunaan Citrat).
114
Bab 10 Analisa Mikroba Dalam Makanan Menurut UU RI No.7 tahun 1996, yang dimaksud pangan adalah segala sesuatu yang berasal dari sumber hayati dan air, baik yang diolah maupun tidak diolah, yang diperuntukkan sebagai makananatau minuman bagi konsumsi manusia termasuk bahan tambahan pangan, bahan baku pangan, dan bahan lain yang digunakan dalam proses penyiapan, pengolahan dan atau pembuatan makanan atau minuman. Mengingat definisi pangan mempunyai cakupan yang luas, maka upaya untuk mencegah pangan dari kemungkinan tercemar baik dari cemaran biologis, kimia, dan benda lain yang yang dapatmengganggu, merugikan dan membahayakan kesehatan manusia (UU RI tahun 1996), merupakan suatu keharusan.
PENYAKIT AKIBAT PANGAN Selain harus bergizi dan menarik, pangan juga harus bebas dari bahan-bahan berbahaya yang dapat berupa cemaran kimia, mikroba dan bahan lainnya. Mikroba dapat mencemari pangan melalui air, debu, udara, tanah, alat-alat pengolah (selama proses produksi atau penyiapan) juga sekresi dari usus manusia atau hewan. Penyakit akibat pangan (food borne diseases) yang terjadi segera setelah mengkonsumsi pangan, umumnya disebut dengan keracunan. Pangan dapat menjadi beracun karena telah terkontaminasi oleh bakteri patogen yang kemudian dapat tumbuh dan berkembang biak selama penyimpanan, sehingga mampu memproduksi toksin yang dapat membahayakan manusia. Selain itu, ada juga makanan yang secara alami sudah bersifat racun seperti beberapa jamur/ tumbuhan dan hewan. Umumnya bakteri yang terkait dengan keracunan makanan diantaranya adalah Salmonella, Shigella, Campylobacter, Listeria monocytogenes, Yersinia enterocolityca, Staphylococcus aureus, Clostridium perfringens, Clostridium botulinum, Bacillus cereus, Vibriocholerae. Vibrio parahaemolyticus, E.coli enteropatogenik dan Enterobacter sakazaki.
115
Keracunan pangan oleh bakteri dapat berupa intoksifikasi atauinfeksi. Intoksifikasi disebabkan oleh adanya toksin bakteri yang terbentuk didalam makanan pada saat bakteri bermultiplikasi, sedangkan keracunan pangan berupa infeksi, disebabkan oleh masuknya bakteri ke dalam tubuh melalui makanan yang terkontaminasi dan tubuh memberikan reaksi terhadap bakteri tersebut. Ada dua jenis intoksifikasi makanan yang disebabkan oleh bakteri yaitu botulism, karena adanya toksin dalam makanan yang dihasilkan oleh Clostridium botulinum dan intoksifikasi lain yaitu stafilokokkal, yang disebabkan oleh enterotoksin dari Staphylococcus aureus. Sedangkan keracunan pangan oleh bakteri yang merupakan infeksi, dikelompokkan menjadi dua. Kelompok pertama berasal dari makanan yang berfungsi sebagai pembawa bakteri, misalnya disentri demam tifoid, kolera, brusellosis dan lain-lain. Kelompok kedua berasal dari makanan yang berfungsi sebagai media pertumbuhan bakteri, sehingga bakteri dapat berkembang biak, diantaranya bakteri Salmonella, Clostridium perfringens, Bacillus cereus, dan Escherichia coli entero patogenik. Untuk mengetahui bahwa pangan sudah tercemar, dapat dilihat secara fisik dari tekstur makanan tersebut. Namun banyak makanan terutama yang sudah melewati suatu proses pengolahan, tetap mempunya itekstur yang masih baik tetapi mengandung suatu cemaran seperti bakteri patogen, yang disebabkan oleh penanganan yang tidak memadai.
MIKROBA PENYEBAB KERUSAKAN & KERACUNAN MAKANAN Jenis mikroba yang terdapat dalam makanan meliputi bakteri, kapang/ jamur dan ragi serta virus yang dapat menyebabkan perubahan-perubahan yang tidak diinginkan seperti penampilan, tekstur, rasa dan bau dari makanan. Pengelompokan mikroba dapat berdasarkan atas aktifitas mikroba (proteolitik, lipofilik, dsb) ataupun atas pertumbuhannya (psikrofilik, mesofilik, halofilik, dsb). Banyak faktor yang mempengaruhi jumlah serta jenis mikroba yang terdapat dalam makanan, diantaranya adalah sifat makanan itu sendiri (pH, kelembaban, nilai gizi), keadaan lingkungan dari mana makanan tersebut diperoleh, serta kondisi pengolahan atau pun penyimpanan. Jumlah mikroba yang terlalu tinggi dapat mengubah karakter organoleptik, mengakibatkan perubahan nutrisi / nilai gizi atau bahkan merusak makanan tersebut. Bahkan bila terdapat mikroba patogen, besar kemungkinan akan berbahaya bagi yang mengkonsumsinya. Dalam pengujian cemaran mikroba digunakan mikroba indikator, karena selain mudah dideteksi juga dapat memberikan gambaran tentang kondisi higienis dari
116
produk yang diuji. Bersamaan dengan mikroba indikator dilakukan juga pengujian terhadap bakteri patogen. Mikroba indikator Mikroba indikator adalah golongan atau spesies bakteri yang kehadirannya dalam makanan dalam jumlah di atas batas (limit) tertentu, merupakan pertanda bahwa makanan telah terpapar dengan kondisi-kondisi yang memungkinkan berkembang biaknya mikroba patogen. Mikroba indikator digunakan untuk menilai keamanan dan mutu mikrobiologi makanan. Jumlah bakteri aerob mesofil, bakteri anaerob mesofil dan bakteri psikrofil dapat merupakan indikator bagi status/mutu mikrobiologi makanan. Jumlah yang tinggi dari bakteri-bakteri tersebut seringkali sebagai petunjuk bahan baku yang tercemar, sanitasi yang tidak memadai, kondisi (waktu dan atau suhu) yang tidak terkontrol selama proses produksi
atau
selama
penyimpanan
ataupun
kombinasi
dari
berbagai
kondisi
tersebut.Bakteri aerob mesofil dianggap sebagai mikroba indikator, meskipun sebenarnya kurang akurat dibandingkan dengan indikator lainnya. Bakteri anaerob mesofil merupakan indikator dari kondisi yang dapat menyebabkan adanya pertumbuhan mikroba anaerob penyebab keracunan makanan seperti C. perfringens dan C.botulinum. Golongan bakteri coliform, Coliform fekal, Escherichia coli dan Enterobacter sakazakii merupakan bakteri bentuk batang, bersifat aerob dan anaerob fakultatif. Golongan coliform mempunyai spesies dengan habitat dalam saluran pencernaan dan non saluran pencernaan seperti tanah dan air. Yang termasuk golongan coliform adalah Escherichia coli, dan spesies dari Citrobacter, Enterobacter, Klebsiella dan Serratia. Bakteri selain dari E.coli dapat hidup dalam tanah atau air lebih lama dari pada E.coli, karena itu adanya bakteri coliform dalam makanan tidak selalu menunjukkan telah terjadi kontaminasi yang berasal dari feses. Keberadaannya lebih merupakan indikasi dari kondisi prosessing atau sanitasi yang tidak memadai dan keberadannya dalam jumlah tinggi dalam makanan olahan menunjukkan adanya kemungkinan pertumbuhan dari Salmonella, Shigella dan Staphylococcus. Escherichia coli dan Coliform fekal, biasanya E.coli, merupakan indikator dari kontaminan dengan sumber/ bahan fekal. Habitat alami dari E . coli adalah saluran pencernaan bawah hewan dan manusia. Sedangkan Coliform fekal merupakan metode pemeriksaan untuk menunjukkan adanya E.coli atau spesies yangs angat dekat dengan E.coli secara cepat tanpa harus mengisolasi biakan dan melakukan test IMVIC. Sebagian
117
besar terdiri dari E.coli tipe I dantipe II yang merupakan petunjuk penting dari kontaminan asal dari bahan fekal. E.coli dan coliform, yang termasuk golongan Enterobacteriaceae adalah Salmonella, Shigella dan Enterobacter sakazaki selain golongan Enterococci yaitu Streptococcus faecalis dan S.faecium merupakan flora normal dari saluran pencernaan manusia dan hewan. Golongan ini tidak banyak digunakan sebagai indikator kontaminasi fekal tetapi lebih dikaitkan dengan sanitasi produksi yang buruk oleh karena daya tahan yang tinggi dari mikroba terhadap kekeringan, suhu tinggi dan pendinginan serta pengaruh detergen atau disinfektan. Dengan sifat yang tahan terhadap pendinginan maka bakteri ini dapat digunakan sebagai indikator untuk makanan beku dan makanan yang sudah dipanaskan. Staphylococci terutama Staphylococcus aureus keberadaannya dalam makanan bisa bersumber dari kulit, mulut atau rongga hidung pengolah pangan. Bila ditemukan dalam jumlah tinggi merupakan indikator dari kondisi sanitasi yang tidak memadai. Mikroba patogen Meliputi bakteri, jamur/ kapangdan ragi/ yeast, bakteri pathogen termasuk jenis penyebab toksiinfeksi makanan diantaranya Salmonella, Shigella, Brucella. Umumnya ada beberapa jenis golongan bakteri terpenting yang dapat menyebabkan kerusakan makanan dan keracunan yaitu Acetobacter, Achromobacter, Alcaligenes, Bacillus, Bacteroides, Clostridium,
Corynebacterium,
Enterococci,
Enterobacter,
Erwinia,
Escherichia,
Flavobacterium, Kurthia, Lactobacillus, Leuconostoc, Micrococcus, Paracolobactrum, Proteus, Pseudomonas, Salmonella, Sarcina, Serratia, Shigella, Staphylococcus dan Streptomyces. METODOLOGI Dalam rangka pengawasan mutu secara mikrobiologis, dilakukan pengujian laboratorium untuk mengisolasi dan mengidentifikasi cemaran bakteri patogen yang mungkin ada dan untuk beberapa jenis mikroba dapat pula dilakukan penghitungan jumlah koloni yang disebut juga dengan enumerasi. Sampel Jumlah sampel yang diuji harus cukup representatif, mewakili lot yang akan diperiksa. Kadang-kadang pengambilan sampel untuk pengujian bakteri pathogen harus lebih ketat dimana menurut ICMSF (The International Commission on Microbiological
118
Specification for Foods) dan Harrigan, replikasi uji (n) dilakukan sesuai dengan jumlah yang representatif, tergantung pada jenis mikroba dan produk. Sampel makanan yang diterimaharus segera diuji begitu tiba di laboratorium. Sampel yang didinginkan dan mudah rusak harus dianalisa paling lambat 36 jam sesudah pengambilan sampel. Sampel beku harus disimpan dalam freezer sampai tiba waktunya untuk diuji, tetapi bila sampel diterima dalam keadaan dingin, jangan disimpan di dalam freezer. Beberapa bakteri seperti vibrio banyak yang akan mati pada suhu sangat rendah (pembekuan). Untuk sampel yang tidak mudah rusak seperti makanan kaleng, dapat disimpan pada suhu ruang. Namun demikian, sampel tidak boleh disimpan terlalu lama karena ada mikroba yang dapat mati selama penyimpanan. Sampel yang akan dikirim ke laboratorium harus diupayakan tidak tercemar dengan bahan atau mikroba lain terhadap sampel. Selama dalam pengiriman ke laboratorium maka sifat sampel harus dijamin tidak mengalami perubahan sejak sampel diambil, dikemas dan dikirim ke laboratorium. Bila sampel berada dalam keadaan beku, harus terlebih dahulu dilelehkan dan pelelehan sedapat mungkin dilemari pendingin atau pada suhu kurang dari 450C selama paling lama 15 menit. Bila menggunakan suhu tinggi sebaiknya sampel diaduk secara teratur. Untuk sampel beku yang mudah meleleh seperti es krim, maka dapat diuji tanpa dilelehkan terlebih dahulu. Untuk sampel padat seperti daging mentah, harus terlebih dahulu dicincang sebelum dihomogenkan. Bila hanya ada satu sampel ditujukan untuk berbagai pengujian, maka sampel untuk uji mikrobiologi dicuplik terlebih dahulu sebelum pengujian lainnya dilakukan. Khusus untuk pengujian C.botulinum dilarang untuk mencicipi ketika akan membuat pemerian sampel, maka pada catatan data sampel tidak dicantumkan pemerian dari rasa. Metode Pengujian sampel makanan akan selalu mengacu kepada persyaratan makanan yang sudah ditetapkan. Parameter uji mikrobiologi pada makanan yang dipersyaratkan secara umum terdiri dari :
119
a. b. c. d. e. f. g. h. i. j. k. l. m.
Uji Angka Lempeng Total Uji Angka Kapang khamir Uji Angka Bakteri termofilik Uji Angka Bakteri pembentuk spora Uji Angka bakteri an-aerob Uji Angka Staphylococcus aureus Uji Angka Clostridium perfringens Uji Angka Enterococcus Uji Angka Bacillus cereus Uji Angka Enterobacteriaceae Uji MPN Coliform Uji MPN Fekal Coliform Uji MPN Escherichia coli
n. o. p. q. r. s. t. u. v. w. x. y.
Uji Angka Escherichia coli Identifikasi Escherichia coli Identifikasi Staphylococcus aureus Identifikasi Salmonella Identifikasi Shigella Identifikasi Bacillus cereus Identifikasi Streptococcus faecalis Identifikasi Vibrio cholerae Identifikasi Vibrio parahaemolyticus Identifikasi Clostridium perfringens Identifikasi Listeria monocytogenes Identifikasi Campylobacter jejuni
Ada beberapa parameter yang tidak termasuk dalam persyaratan di atas, seperti identifikasi Pseudomonas aeruginosa dalam air minum tetapi sering juga menjadi syarat tambahan yang diinginkan oleh produsen air minum untuk diuji. Begitu pula pengujian khusus Clostridium botulinum untuk makanan kaleng. Pengujian mikrobiologi untuk makanan tidak dilakukan untuk semua parameteruji di atas tetapi akan mengacu pada persyaratan dari tiap produk tersebut misalnya persyaratan Naget ayam ( SNI 01-66832002)meliputi : 1. Angka Lempeng Total 2. MPN Coliform 3. MPN E.coli 4. Identifikasi Salmonella 5. Angka Staphylococcus aureus Metode yang digunakan untuk pengujian mikrobiologi sangat ditentukan oleh persyaratan yang diacu, umumnya pengujian dilakukan secara kualitatif dengan metode pengkayaan (enrichment) yaitu isolasi dan identifikasi mikroba dan interpretasi hasil (negatif pergram/ml atau negatif per 25 gram atau per 100 gram/ml). Pengujian secara kuantitatif (enumerasi) dengan penghitungan jumlah mikroba dan interpretasi hasil berupa koloni per ml/g atau koloni per 100 ml. Identifikasi mikroba pathogen dapat dilakukan dengan cara konvensional maupun denganpengujian cepat (rapid test). Metode kuantitatif (Enumerasi) Metode kuantitatif digunakan untuk mengetahui jumlah mikroba yang ada pada suatu sampel, umumnya dikenal dengan Angka Lempeng Total (ALT) atau total plate count (TPC) dan Angka Paling Mungkin atau Most Probable Number (MPN). Uji Angka Lempeng Total (ALT) dan lebih tepatnya ALT aerob mesofil atau anaerob mesofil menggunakan media padat dengan hasil akhir berupa koloni yang dapat diamati secara visual dan dihitung,
120
interpretasi hasil berupa angka dalam koloni (cfu)per ml/g atau koloni/100ml. Cara yang digunakan antara lain dengan cara tuang, cara tetes dan cara sebar. Angka Paling Mungkin (MPN) menggunakan media cair dengan tiga replikasi dan hasil akhir berupa kekeruhan atau perubahan warna dan atau pembentukan gas yang juga dapat diamati secara visual, dan interpretasi hasil dengan merujuk kepada Tabel MPN. Dikenal 2 cara yaitu metode 3 tabung dan metode 5 tabung. Metode kuantitatif dilakukandengan beberapa tahap yaitu : Homogenisasi sampel sebagai tahap pendahuluan dalam pengujian yang berguna untuk membebaskan sel bakteri yang mungkin terlindung partikel sampel dan untuk memperoleh distribusi bakteri sebaik mungkin. Homogenisasi dapat dilakukan menggunakan alat seperti stainless steel blender atau stomaker. Sedang sampel bentuk cair tidak perlumenggunakan alat, cukup langsung dicampur dengan pengencer dan dikocok sampai homogen. Tahap pengenceran menggunakan larutan pengencer yang berfungsi untuk menggiatkan kembali sel-sel bakteri yang mungkin kehilangan vitalitasnya karena kondisi di dalam sampel yang kurang menguntungkan. Pengenceraan suspensi sampel dilakukan untuk mendapatkan koloni yang tumbuh secara terpisah dan dapat dihitung dengan mudah, hal ini akan sangat membantu terutama untuk sampel dengan cemaran yang sangat tinggi. Umumnya pengencer yang digunakan adalah peptone water 0,1%, buffer fosfat atau larutan ringers (4 kali kuat), dan peptone 0,1% plus NaCL0,85% (ISO 6887:1983) Tahap pencampuran dengan media (padat/ cair) Media padat yang digunaka numumnya adalah Plate Count Agar (PCA) atau Nutrient Agar (NA) sedangkan untuk inokulasi suspensi homogenat sampel ke dalam media, tergantung dengan metode yang telah dipilih dan kesesuaian dengan sifat sampel dan mikroba yang mungkin ada dalam sampel. Pada keadaan tertentu, media perlu ditambah dengan bahan lain seperti glukosa untuk Enterococcus, atau serum untuk Mycoplasma dan egg yolk untuk bakteri tertentu misalnya yang tidak tahan panas terutama untuk pencampuran dengan media dengan suhu kira-kira 450C, dilakukan dengan metode sebar atau tetes dan suhu inkubasi rendah (misal. bakteri Psychrotroph dan Psychrophiles) Tahap inkubasi danpengamatan Inkubasi dilakukan pada suhu dan lama yang sesuai dan kondisi dibuat sedemikian rupa disesuaikan dengan sifat mikroba (kondisi aerob atau anaerob) : 0 -100C untuk bakteri Psikrotrof dan Psikrofil 121
20-320C untuk bakteri Saprophtic mesophiles 35-370C (atau 450C) untuk bakteri parasites mesofil 55-630C atau lebih tinggi untuk bakteri Termofilik 30-320C (ISO 4833:1991) Interpretasi hasil Metode Kualitatif (Pengkayaan) Pada metode kualitatif dilakukan perbanyakan (enrichment/ pengkayaan) terlebih dahulu dari sel mikroba yang umumnya dalam jumlah yang sangat sedikit dan bahkan kadang-kadang dalam kondisi lemah. Ada beberapa tahap yang dilakukan yaitu tahap pengkayaan (enrichment), tahap isolasi pada media selektif, tahap identifikasi dengan reaksi biokimia, dan dilanjutkan dengan analisa antigenik atau serologi atau immunologi dan bila diperlukan dapat juga dilakukan identifikasi DNA bakteri dengan metode PCR (Polymerase Chain Reaction) Tahap pengkayaan Umumnya digunakan media cair yang berguna untuk memberi kesempatan supaya bakteri dapat tumbuh pada media pengkaya, karena bakteri lain juga dapat tumbuh, maka dapat ditambahkan inhibitor untuk mencegah atau menghambat pertumbuhan bakteri lain dan dilanjutkan dengan menumbuhkan kembali bakteri dalam media selektif atau differensial. Pada keadaan tertentu dimana bakteri sangat lemah perlu dilakukan terlebih dahulu tahap pra-pengkayaan (pre-enrichment) misalnya pada uji Salmonella ataupun Enterobacter sakazaki, dimana media ini mengandung cukup gizi yang non selektif. Tahap ini dimaksudkan untuk “menyembuhkan/ menguatkan” sel bakteri yang sangat lemah atau sakit disebabkan oleh proses pengolahan makanan. Umumnya pada tahap pra-pengkayaan digunakan media Lactose Broth atau Buffered Pepton Water, walaupun kadang-kadang media ini belum tentu sesuai untuk semua jenis sampel. Pada makanan kering seperti yeast dan susu bubuk, sampel hanya memerlukan rekonstitusi dalam air suling yang mengandung Brilliant Green. Sedangkan untuk sampel yang sangat berlemak seperti hasil olahan jeroan maka ke dalam media pra-pengkaya ditambahkan Tergitol 7 sehingga memudahkan dispersi lemak pada media. Tahap isolasi Setiap koloni atau galur mikroba yang akan diidentifikasi harus benar-benar murni dan untuk mendapatkan biakan murni digunakan media selektif yang memungkinkan untuk
122
isolasi koloni mikroba tersangka berdasarkan pada karakter biokimia dari mikroba yang akan mempengaruhi sifat pertumbuhan bakteri pada suatu media spesifik. Identitas mikroba dapat dilihat dari pembentukan koloni yang spesifik pada media. Saat ini, perkembangan metode pengujian cepat (rapid test) dengan menggunakan media selektif sudah makin berkembang dimana pada media sudah ditambahkan suatu indikator/ bahan kimia tertentu yang dapat menandai adanya hasil reaksi enzimatis sehingga terbetuk warna atau fluoresensi sehingga media tersebut lebih spesifik lagi (misalnya media kromokult dan fluorokult). Contohnya media fluorogenik untuk deteksi E.coli dan kromogenik untuk deteksi E.sakazakii yang sangat spesifik. Hal ini berdasarkan pada enzim yang berasal dari bakteri tersebut misalnya E . coli(-D-galaktosidase) dengan penambahan fluorogenic substrat 4methylum bellliferyl—Dglucoronide akan suatu ikatan kompleks yang akan menghasilkan fluoresensi bila dilihat dibawah cahaya ultraviolet dan E.sakazakii (D-glukosidase)dengan substrat 5-Bromo-4-choloro-3-indolyl—D-glucopyranoside) akan menghasilkan koloni dengan warna hijau torquise. Beberapa media selektif yang digunakan untuk pengujian mikroba dan koloni spesifik dapat dilihat pada table berikut MIKROBA
MEDIA SELEKTIF EMB agar
Escherichia coli ENDO agar XLD agar
Salmonella sp.
BGA
Shigella sp
Mac Conkey agar
Campylobacter
mCCDA BP agar
Staphylococcus aureus
MSA
Bacillus cereus
MYP agar
Clostridium perfinges
TSC agar
Vibrio cholerae
TCBS agar
123
PENGAMATAN KOLONI Koloni warna kehijauan dengan bintik hitam ditengah koloni dan kilap logam Koloni warna merah dengan kilap logam Koloni translucent dengan bintik hitam ditengahnya dan dikelilingi zona transparan berwarna kemerahan Koloni dari tidak berwarna, merah muda hingga merah. Dari translucent hingga keruh (opaque) dengan lingkaran merah muda hingga merah Koloni warnamerah muda terang, translucent dengan atau tanpa pinggir koloni bergerigi atau kasar Koloni basah, berwarna abu-abu Koloni warna hitam mengkilat, dikelilingi daerah keruh (opaque) Koloni cembung, warna kuning & warna media berubah menjadi jernih Koloni merah muda dikelilingi daerah keruh Koloni berwarna hitam dengan daerah keruh berukuran 2-4 mm di sekeliling koloni Koloni besar (2-3 mm), halus, kuning, datar (agak pipih), bagian tengah keruh
Vibrio parahaemolyticus Listeria monocytogenes Enterococcus faecalis Enterobacter sakazakii
TCBS agar + NaCl 3% ALOA agar PALCAM agar
dan disekelilingnya translucent Koloni bulat berdiameter 2-3 mm dengan pusat warna hijau atau biru Koloni biru hijau, dikelilingi halo (lingkaran) keruh Koloni berwarna abu-abu hijau dikelilingi halo (lingkaran)
Enterococci agar
Koloni kecil berwarna hijau kebiruan
Chromocult E.sakazaki
Koloni warna hijau atau biru-hijau
Pewarnaan Gram Selain isolasi dan identifikasi dilakukan juga pewarnaan Gram langsung terhadap koloni, baik Gram positif maupun Gram negatif. Tahap konfirmasi Dilakukan dengan berbagai metode diantaranya :
Konfirmasi dengan reaksi biokimia menggunakan media tertentu, karena setiap bakteri mempunyai karakter biokimia spesifik. Prinsip dasarnya adalah enzim yang diproduksi mikroba akan mengdegradasi misalnya. karbohidrat, lipid, Kasein, dalam hal ini hasil metabolit dapat dilihat secara visual dengan adanya tambahan suatu indicator. Saat ini uji biokimia sudah banyak dibuat secara komersil dalam bentuk miniatur berupa kit dan hasil uji dapat dilihat secara visual dan interpretasi secara manual atau dapat menggunakan suatu program (komputer) dan alat yang sesuai seperti ELISA reader
Konfirmasi analisa antigenik menggunakan antisera atau immunologi berdasarkan adanya reaksi antigen dengan antibodi (misalnya. EnzymeLinked Immunosorbent Assay/ ELISA) Karena antibody hanya bereaksi dengan antigen yang sesuai, maka sifat ini juga digunakan untuk pengembangan teknik diagnostik. Hasil pengujian dapat diketahui/ dilihat secara visual seperti adanya aglutinasi atau presipitasi atau terbentruknya warna yang dapat dilihat secara visual atau menggunakan alat ELISA READER atau terbentuknya fluoresen yang dapat dilihat menggunakan bantuan mikroskop fluoressein.
Tahap selanjutnya merupakan identifikasi lebih sempurna yaitu dengan identifikasi menggunakan analis dengan DNA probe ataupun metode PCR (Polymerase Chain Reaction).
124
Bab 11 Daya Kerja Anti Mikroba Proses pengendalian jumlah mikroba artinya adalah berbagai metode fisik dan kimia yang digunakan untuk menghancurkan atau mengurangi jumlah mikroba pada suatu area tertentu. Mikroba mempunyai sensitivitas yang berbeda-beda terhadap suatu dsinfektan, misalnya ada protozoa, virus dan bakteri yang sangat resisten (tahan) terhadap zat-zat kimia tertentu. Berikut ini adalah nama-nama mikroba yang resisten: A. Resistensi tinggi, misalnya bakteri-bakteri endospora B. resistensi
sedang,
misalnya,
Pseudomonas
sp.,
Mycobacterium
tuberculosis, Staphylococcus aureus, kista protozoa. C. resistensi rendah, misalnya sel-sel vegetative, spora fungi, khamir, protozoa trofozoit. Zat antimikroba adalah senyawa yang dapat membunuh atau menghambat pertumbuhan mikroorganisme. Zat antimikroba dapat bersifat membunuh mikroorganisme (microbicidal) atau menghambat pertumbuhan mikroorganisme (microbiostatic). Disinfektan yaitu suatu senyawa kimia yang dapat menekan pertumbuhan mikroorganisme pada permukaan benda mati seperti meja, lantai dan pisau bedah. Adapun antiseptik adalah senyawa kimia yang digunakan untuk menekan pertumbuhan mikroorganisme pada jaringan tubuh, misalnya kulit. Efisiensi dan efektivitas disinfektan dipengaruhi oleh beberapa faktor yaitu: Konsentrasi atau dosis zat anti mikroba Cara kerja zat anti mikroba Sifat alami mikroba di populasinya Waktu terpapar 125
Jenis dan jumlah mikroba Keberadaan pelarut, bahan organik atau inhibitor (zat penghambat) Kondisi lingkungan: temperatur, pH dan jenis tempat hidup
Desinfeksi adalah suatu proses untuk menghancurkan pathogen vegetative selain endospora, sanitasi artinya segala jenis teknik pembersihan yang secara mekanik menghilangkan mikroba, sedangkan degermasi artinya adalah proses untuk menurunkan jumlah mikroba. Terkadang, istilah sanitasi, desinfeksi dn steriliasi dianggap mempunyai arti yang sama, padahal sebenarnya masing-masing istilah tersebut menunjukan tingkat aktivitasnya. Sanitizeradalah suatu zat kimia yang mampu menurunkan jumlah mikroba hingga ke level aman, yaitu pengurangan sebanyak 3-5 log (99,9 % hingga 99,999%) dari populasi bakteri penyebab penyakit atau dari sejumlah sampel tertentu dalam waktu kurang dari 30 detik. Suatu desinfektan harus bisa membunuh bakteri pathogen setidaknya 99,999 % dalam waktu 5-10 menit, dan desinfektan ini harus mampu membunuh lebih banyak bakteri pathogen dibandingkan dengan sanitizer. Tapi desinfektan ini tidak direkomendasikan untuk digunakan pada kulit manusia, tapi digunakan untuk permukaan benda atau untuk air. Bahan kimia lain bernama sterilant digunakan untuk benar-benar memusnahkan mikroba, termasuk spora yang biasanya resisten. Glutaraldehid and formaldehid adalah contoh bahan kimia yang bisa digunakan untuk mensterilisasi suatu benda atau ruangan. Aldehid tertentu diketahui mempunyai sifat karsinogenik (bisa menyebabkan kanker) sehingga penggunaannya dibatasi. Antibiotik adalah bahan yang dihasilkan oleh mikroorganisme atau sintetis yang dalam jumlah kecil mampu menekan menghambat atau membunuh mikroorganisme lainnya. Antibiotik memiliki spektrum aktivitas antibiosis yang beragam.Antibiotik dikelompokkan berdasarkan gugus aktifnya,
misal
antibiotik macrolide,
126
antimikroba
peptida.
Adapun
penamaannya
biasanya
berdasarkan
gugus
kimiawinya
atau
pun
mikroorganisme produsernya. Cara kerja bahan kimia anti mikroba Mekanisme kerja antibiotik antara lain : a. Menghambat dsintesis dinding sel b. Merusak permeabilitas membran sel. c. Menghambat sintesis RNA (proses transkripsi) d. Menghambat sintesis protein (proses translasi). e. Menghambat replikasi DNA. Prosedur difusi-kertas cakram-agar yang distandardisasikan (metode Kirby-Bauer) merupakan cara untuk menentukan sensitivitas antibiotik untuk bakteri. Sensitivitas suatu bakteri terhadap antibiotik ditentukan oleh diameter zona hambat yang terbentuk. Semakin besar diameternya maka semakin terhambat pertumbuhannya, sehingga diperlukan standar acuan untuk menentukan apakah bakteri itu resisten atau peka terhadap suatu antibiotik. Faktor yang mempengaruhi metode Kirby-Bauer : a. Konsentrasi mikroba uji b. Konsentrasi antibiotik yang terdapat dalam cakram c. Jenis antibiotik. d. pH medium. Kematian mikroba bisa terjadi akibat hilangnya kemampuan untuk bereproduksi secara permanen bahkan jika berada di kondisi pertumbuhan maksimum sekalipun. Bahan-bahan kimia anti mikroba bekerja dengan berbagai mekanisme biokimia, seperti penghancuran membrane sel, dinding sel, protein dalam sel, DNA atau RNA sel, penghambatan atau penonaktivan proses-proses penting yang menunjang kehidupan mikroba tersebut. Misalnya zat pengoksidasi seperti ozon atau klorin yang biasa digunakan dalam pengolahan air, mematikan bakteri dengan cara menghancurkan membrane sel bakteri tersebut. Klorin murni sudah digunakan dalam pengolahan atau sterilisasi air sejak ratusan tahun lalu. Zat pengoksidasi ini 127
sangat efektif mematikan berbagai jenis bakteri, tapi kurang efektif untuk menghancurkan spora. Klorin ini adalah jenis desinfektan yang murah, kerjanya cepat dan efektif, tapi biasanya menghasilkan residu (zat sisa).
Bahan-bahan kimia yang biasa digunakan sebagai zat anti bakteri: 1. Halogen a. Klorin (Cl2), hipoklorit (dalam kaporit/ zat pemutih), kloramin Mendenaturasi protein dengan cara memutus ikatan disulfide dalam sel dan bisa digunkan untuk membunuh spora. b. Iodin (I2), iodofor (betadin) Mendenaturasi protein, dapat membunuh spora, digunakan secara medis sebagai desinfektan, obat, zat degermasi pada gigi dan sebagai salep. 2. Fenol Mengganggu membrane sel dan protein pengendap, berperan sebagai bakterisidal (anti bakteri), fungisidal (anti jamur), virusidal (anti virus) tapi tidak sebagai sporisidal. Contoh bahan: lisol dan triclosan (bahan antibakteri dalam sabun)
3. Klorheksidin Mendenaturasi molekul surfaktan & protein dengan spektrum anti mikroba yang luas, bukan sporisidal, digunakan pada kulit seperti dalam scrub dan pembersih kulit lainnya.
128
4. Alkohol Etil, isopropyl dalam larutan 50-90%, bekerja dengan melarutkan membrane lipid dan mengkoagulasi protein dari sel bakteri vegetatif dan jamur, bukan merupakan sporisidal. 5. Hidrogen peroksida Terdiri dari larutan lemah (3%) hingga kuat (25%), memproduksi radikal bebas hidroksil yang sangat reaktif dan dapat merusak protein dan DNA juga mendekomposisinya (menguraikannya) menjadi gas oksigen yang bersifat racun bagi mikroba anaerob, larutan yang kuat dapat digunakan untuk sporisidal. 6. Detergent & sabun Ammonia kuartener yang digunakan sebagai surfaktan yang mengganggu permeabilitas membrane pada bakteri dan fungi/ jamur tertentu, bukan termasuk sporisidal, sabun secara mekanik akan menghilangkan debu dan minyak yang mengandung mikroba dari permukaan kulit. Struktur sabun:
129
7. Logam berat Larutan perak dan raksa (merkuri) dalam konsentrasi kecil membunuh sel vegetative dengan menonaktifkan protein., bekerja secara oligodinamik, bukan termasuk sporisidal. Logam-logam berat seperti Hg, Cu, Ag dan Pb bersifat racun terhadap sel meskipun hanya dalam kadar rendah. Logam mengalami ionisasi dan ionion tersebut bereaksi dengan bagian sulfihidril pada protein sel sehingga menyebabkan denaturasi. Daya hambat atau mematikan dari logam dengan konsentrasi yang rendah disebut daya oligodinamik. 8. Aldehid Glutaraldehid dan formaldehid memusnahkan mikroba dengan merubah protein dan DNA menjadi gugus alkil (alkilasi), larutan glutaraldehid 2% (Cidex) digunakan sebagai sterilant untuk peralatan yang sensitif terhadap panas. Formaldehid/ formalin digunakan sebagai desinfektan, pengawet dan penggunaanya dibatasi karena beracun. 9. Gas dan aerosol Etilen oksida, propilen oksida, betapropiolakton dan oksida klor digunakan sebagai zat peng-alkilasi dan sporisidal yang kuat. Contoh penggunaan:
130
Prosedur Kerja Pengujian zat disinfektan dengan kertas cakram 1. Inokulasikan E. coli dan Bacillus sp. pada NA cawan sengan streak kontinyu. 2. Kertas cakram steril dicelupkan ke dalam larutan disinfektan berikut: a. alkohol 70% (cawan 1) b. LysoI 5% (cawan 2) c. Betadin (cawan 3) d. hipoklorit 5% (cawan 4) 3. Setelah diangkat, sisa tetes larutan yang berlebihan pada kertas cakram diulaskan pada dinding wadah karena dikhawatirkan larutan akan meluas di permukaan agar jika larutan terlalu banyak. 4. Kertas cakram diletakkan dipermukaan agar dengan pinset. Tekan dengan pinset supaya kertas cakram benar-benar menempel pada agar. 5. Inkubasi selama 48 jam pada 37 0C. 6. Zona hambat yang terbentuk diukur diameternya, bandingkan daya kerja berbagai disinfektan.
Prosedur kerja pengujian daya oligodinamik: 1. Inokulasikan E.coli dan Bacillus sp. pada cawan NA dengan streak kontinyu 2. Letakan koin tembaga dan seng ke dalam cawan dengan pinset 3. Inkubasi 370C selama 48 jam
131
4. Hitung zona hambat yang terbentuk dengan mengukur diameter daerah yang jernih atau tidak ada pertumbuhan
Prosedur kerja pengujian antibiotic dengan metode Kirby-Bauer: 1. Celupkan cotton bud (cotton swab) dalam biakan bakteri kemudian tekan kapas ke sisi tabung agar airnyamenetes 2. Ulaskan pada seluruh permukaan cawan Mueller-Hinton Agar secara merata 3. Biarkan cawan selama 5 menit 4. Kertas cakram dicelupkan dalam larutan antibiotik dengan konsentrasi tertentu. 5. Angkat, biarkan sejenak agar tiris, selanjutnya letakkan kertas cakram pada permukaan agar. 6. Kertas cakram ditekan menggunakan pinset supaya menempel sempurna di permukaan agar. 7. Inkubasi pada suhu 37 0C selama 24-48 jam. 8. Ukur diameter zona hambat (mm) kemudian bandingkan dengan tabel sensitivitas antibiotik.
132
Tabel sensitivitas antibiotik (diameter zona hambat dalam mm) Nama Antibiotik Tetrasiklin ciprofloksacin enoxacin erythromycin Penicillin staphylococci Oxacilin staphylococci tocramycin ceftriaxone kanamycin clindamycin Fiperacillin Gram negatif Ampicillin Gram negative enteric Staphylococci
Tahan
Medium
= 14 =15 =14 =13
15-18 16-20 15-17 14-22
-28
Peka =19 =21 =18 =23 -29
-10 =12 =13 =13 -14
11-12 13-14 14-20 14-17 15-20
-13 =15 =21 =18 -21
-17
18-20
-21
=13 -28
14-16
=17 -29
Cara menginterpretasikan/ mengartikan hasil pengujian : Ukur diameter zona hambat (zona jernih) Misal didapatkan zona hambat suatu bakteri berdiameter 26 mm untuk Eryhtromycin. Maka interpretasinya adalah bakteri tersebut peka terhadap antibiotik Eryhtromycin.
133
Bab 13 Monitoring Kesterilan Masalah kesterilan merupakan bahasan yang sangat penting dalam menjaga kondisi aseptis yang dicapai dalam suatu aktivitas dalam bidang mikrobiologi. Bakeri dan fungi adalah kontaminan yang paling sering ditemukan. Spora fungi sangat ringan dan banyak terdapat di lingkungan sehingga mudah mengkontaminasi ruangan maupun biakan. Oleh karena itu perlu adanya upaya yang efektif dan berkesinambungan untuk menjaga kesterilan alat, bahan, maupun ruangan kerja. Suatu ruangan yang berukuran besar lebih efektif disterilkan dengan sinar ultra violet. Waktu sterilisasinya bervariasi tergantung pada ukuran ruangan dan hanya bisa dilakukan jika tidak ada aktivitas yang sedang dilakukan di dalam ruangan tersebut karena radiasi ultra violet bisa berbahaya bagi mata. Ruangan tersebut bisa juga disterilisasi dengan cara mencucinya sebanyak 1-2 kali sebulan menggunakan spirosit antifungi. Ruangan yang kecil juga dapat disterilkan dengan sinar UV atau menggunakan bakterisida dan atau fungisida. Sedangkan laminar air flow bisa disterilkan dengan mengelap permukaannya menggunakan etil alcohol 95% 15 menit sebelum memulai bekerja di dalamnya. Ruangan kultur sebelumnya harus dibersihkan dengan detergen kemudian dengan hati-hati dilap dengan larutan sodium hipoklorit 2% atau etil alcohol 95%. Semua lantai dan dinding harus dicuci secara rutin seminggu sekali dengan larutan yang sejenis. Desinfektan komersial seperti Lysol, Zephiram dan Roccal dilarutkan sebagaimana petunjuk pemakaiannya kemudian digunakan untuk mendesinfeksi permukaan meja kerja atau ruangan kultur. Keberhasilan monitoring kesterilan sangat tergantung pada teknik yang dipakai oleh petugas dalam kultur aseptis. Kita harus selalu waspada terhadap
134
berbagai sumber yang bisa menyebabkan terjadinya kontaminasi seperti dari debu, rambut, tangan dan pakaian. Sehingga tangan harus selalu dicuci, lengan baju sedikit dilipat, rambut diikat, dll. Mencuci tangan dengan etil alcohol 95% adalah salah satu cara pencegahan kontaminasi yang paling mudah dilakukan. Berbicara atau bersin selama bekerja juga dapat menyebabkan kontaminasi. Menjaga kesterilan memang sulit dilakukan karena bakteri dan spora fungi ada di udara, di permukaan tubuh dan di dalam tubuh kita. Jika anda melihat cahaya matahari yang masuk melalui jendela, anda dapat melihat partikel-partikel debu yang melayang-layang di udara.
Ternyata, ada
ratusan bakteri yang menempel pada masing-masing partikel debu tersebut. Suatu unit laminar air flow didesain untuk menyingkirkan partikel debu tersebut dari udara. Udara dari dalam ruangan disedot melalui bagian atas laminar air flow kemudian didorong melewati filter HEPA (High Energy Particle Air) dengan kecepatan 90 kaki/menit melewati wilayah kerja. Udara yang telah disaring dengan HEPA itu tidak mengandung partikel yang ukurannya lebih besar dari 0,3 mikrometer, sehingga udaranya bisa dikatakan steril. Aliran udara didalamnya juga mencegah masuknya spora fungi dan bakteri. semua alat yang akan masuk ke dalam alat ini harus disterilisasi terlebih dahulu atau disemprot dengan etanol atau etil alcohol. Berikut ini adalah beberapa hal yang harus diperhatikan dalam menjaga kesterilan ruangan: 1. Ruangan harus di-pel secara rutin R
R
2. Semua permukaan harus dicuci dengan 10% Clorox , Lysol , atau larutan desinfektan yang lain 3. Semua pintu dan jendela harus ditutup 4. Air conditioner (AC) dan kipas harus dimatikan 5. Jika memungkinkan, masing-masing orang mempunyai wilayah kerja sendiri sehingga bisa lebih terkontrol keterilannya 6. Masing-masing mempunyai botol semprot yang berisi etanol 70% atau isopropanol (jangan gunakan metanol). Semprot semua alat yang akan masuk ke wilayah steril 135
7. Rambut harus ditutup dan rambut yang panjang harus diikat. Tangan harus dicuci, bukan digosok (menggosok tangan bisa menyebabkan kulit menjadi kering dan bisa menyebabkan terbentuknya serpihan-serpihan kulit yang mengandung bakteri) kemudian disemprot dengan alcohol atau usapkan gel isopropyl alcohol. Lebih baik lagi jika memakai sarung tangan dan masker. 8. Jangan berbicara selama mengerjakan prosedur kerja steril. Jangan melewatkan benda yang tidak steril ke wilayah kerja yang steril. Bergerak dengan hati-hati dan tidak terburu-buru tapi lakukan dengan cepat dan cermat. 9. Periksa biakan yang dibuat setiap 3-5 hari. Jika terdapat daerah yang berlendir berarti ada kontaminasi dari bakteri dan jika ada daerah yang keruh berarti ada kontaminasi fungi. Jangan buka wadah yang sudah terkontaminasi, karena kontaminannya mungkin mikroba pathogen atau yang dapat menyebabkan penyakit. Satu-satunya cara aman untuk menanganinya adalah dengan mengautoklafnya selama 15 menit. Wadah plastic yang terkontaminasi detempatkan pada kantong khusus untuk mengautoklaf sebelum isinya dibuang.
Prinsip yang utama ketika akan membuang limbah mikrobiologi adalah dilakukannya dekontaminasi. Dekontaminasi ini termasuk sterilisasi (pemusnahan total dari semua mikroorganisme, termasuk spora bakteri) dan desinfeksi (penghancuran atau penghilangan mikroba jenis tertentu). Merupakan tanggung jawab semua orang yang bekerja di laboratorium mikrobiologi untuk memastikan penggunaan secara efektif semua produk untuk mendekontaminasi alat, bahan dan sampel, lantai dan ruangan serta jika ada tumpahan bahan yang dapat menyebabkan infeksi.
136
DAFTAR PUSTAKA
Adhi, I Ketut D, S.Kom. 2008. Bakteri: ciri-ciri, struktur, perkembangbiakan, bentuk dan manfaatnya. http://gurungeblog.wordpress.com. Diakses tanggal 20 juni 2010 Badan POM RI. 2008. Pengujian Mikrobiologi Pangan. Info POM vol. 9 no. 2 Maret 2008. Centre for Emergency Preparedness and Response. 2004. Laboratory Biosafety Guidline. 3rd edition. Minister of Health. Canada E. Pradhika. 2008. Menentukan Jumlah dan Ukuran Mikroba. http: //ekmonsaurus.blogspot.com. diakses tanggal 2 Juni 2009 --------------. 2008. Media Pertumbuhan. http: //ekmon-saurus.blogspot.com. diakses tanggal 2 Juni 2009 --------------. 2008. Isolasi Mikroorganisme. http: //ekmon-saurus.blogspot.com. diakses tanggal 2 Juni 2009 --------------. 2008. Sterilisasi. http: //ekmon-saurus.blogspot.com. diakses tanggal 2 Juni 2009 --------------. 2008. Morfologi Mikroba. http: //ekmon-saurus.blogspot.com. diakses tanggal 2 Juni 2009 --------------. 2008. Aktivitas Enzimatis Mikroorganisme. saurus.blogspot.com. diakses tanggal 2 Juni 2009
http:
//ekmon-
--------------. 2008. Daya Kerja Anti Mikroba dan Oligodinamik. http: //ekmonsaurus.blogspot.com. diakses tanggal 2 Juni 2009 Pelczar, Michael J, Jr. dan E.C.S. Chan. 2007. Dasar-Dasar Mikrobiologi. UI Press. Jakarta Pramono, Hendro. 2007. Catatan Kuliah Mikrobiologi Dasar. www.unsoed.ac.id. Diakses tanggal 20 juni 2010 Setiawan, W. 2005. Penghitungan Jumlah Mikroba Secara Langsung Menggunakan Haemocytometer. http://blog.unila.ac.id/wasetiawan. Diakses tanggal 10 juni 2010
137
Standar Nasional Indonesia. 2006. Air Minum dalam Kemasan. SNI 01-3553-2006. Badan Standarisasi Nasional. ----------------. 2008. Metode Pengujian Cemaran Mikroba dalam Daging, Telur dan Susu, serta Hasil Olahannya. SNI 2987: 2008 Sumarsih, Sri. 2003. Diktat Kuliah Mikrobiologi Dasar. Fakultas Pertanian UPN “Veteran”. Jogjakarta Widianti, Ni Luh P dan Ni Putu Ristiati. 2004. Analisis Kualitatif Bakteri Koliform pada Depo Air Minum Isi Ulang di Kota Singaraja Bali. Jurnal Ekologi Kesehatan Vol. 3 no. 1. Wibowo, Marlia Singgih. 2000. Cara Pengawetan dan Penyimpanan Biakan Fungi. Insatitut Teknologi Bandung
138
