Nghiên Cứu Thành Phần Hóa Học Và Khảo Sát Hoạt Tính Sinh Học Cây Bần Chua (Sonneratia Caseolaris (L.) Engl.)

VIỆN HÀN LÂM KH&CN VIỆT NAM

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO

VIỆN SINH THÁI VÀ TÀI NGUYÊN SINH VẬT

ĐẠI HỌC THÁI NGUYÊN

PHẠM THỊ MAI HƯƠNG

NGHIÊN CỨU THÀNH PHẦN HÓA HỌC VÀ KHẢO SÁT HOẠT TÍNH SINH HỌC CÂY BẦN CHUA (SONNERATIA CASEOLARIS (L.) ENGL.)

LUẬN VĂN THẠC SĨ SINH HỌC

Hướng dẫn khoa học. TS. NGUYỄN VĂN THANH

Hà Nội – 2014

VIỆN HÀN LÂM KH&CN VIỆT NAM

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO

VIỆN SINH THÁI VÀ TÀI NGUYÊN SINH VẬT

ĐẠI HỌC THÁI NGUYÊN

NGHIÊN CỨU THÀNH PHẦN HÓA HỌC VÀ KHẢO SÁT HOẠT TÍNH SINH HỌC CÂY BẦN CHUA (SONNERATIA CASEOLARIS (L.) ENGL.)

LUẬN VĂN THẠC SĨ SINH HỌC Học viên.

Phạm Thị Mai Hương

Cao học.

Khóa 16

Chuyên ngành.

Sinh học thực nghiệm

Mã số.

60420114

Hướng dẫn khoa học. TS. Nguyễn Văn Thanh

Hà Nội – 2014

Lời cảm ơn Luận văn được hoàn thành tại Viện Hoá Sinh biển, Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam. Tôi xin chân thành cảm ơn TS Nguyễn Văn Thanh, người thầy đã tận tình hướng dẫn, hết lòng chỉ bảo và tạo mọi điều kiện giúp đỡ tôi trong thời gian làm luận văn. Tôi cũng xin chân thành cảm ơn GS. VS Châu Văn Minh, TS Nguyễn Hoài Nam, TS Nguyễn Xuân Cường và tập thể cán bộ phòng Dược liệu biển, Viện Hóa Sinh biển đã tạo điều kiện, giúp đỡ tôi trong quá trình thực hiện luận văn. Tôi xin gửi lời cảm ơn chân thành tới các anh chị phòng Hoạt chất sinh học, Viện Hóa học các hợp chất thiên nhiên; và các anh chị phòng Hóa Sinh ứng dụng, Viện Hóa học đã giúp đỡ và tạo điều kiện cho tôi hoàn thành các nghiên cứu về hoạt tính sinh học và thử nghiệm dược lý. Tôi xin chân thành cảm ơn tới Lãnh đạo Viện Sinh thái và Tài nguyên sinh vật, trường Đại học Thái Nguyên đã tạo điều kiện cho tôi được học tập và nghiên cứu. Tôi xin chân thành cảm ơn gia đình và bạn bè đã động viên tôi trong suốt quá trình học tập nghiên cứu. Luận văn này được hỗ trợ kinh phí và thực hiện trong khuôn khổ của Dự án điều tra cơ bản: “Điều tra các chất có hoạt tính sinh học từ nguồn thực vật rừng ngập mặn tại khu vực vườn Quốc gia Xuân Thủy tỉnh Nam Định”, mã số: VAST.ĐTCB 02/13-14 do TS Nguyễn Văn Thanh làm chủ nhiệm. Tác giả luận văn


Lời cam đoan Tôi xin cam đoan đây là công trình nghiên cứu của riêng tôi được thực hiện dưới sự hướng dẫn của TS. Nguyễn Văn Thanh. Các số liệu, kết quả nêu trong Luận văn là trung thực và chưa từng được ai công bố trong bất kỳ công trình nào khác. Tôi xin cam đoan rằng mọi sự giúp đỡ cho việc thực hiện Luận văn này đã được cảm ơn và các thông tin trích dẫn trong Luận văn đã được chỉ rõ nguồn gốc. Học viên thực hiện Luận văn


Luận văn thạc sĩ sinh học khóa 16


Danh sách các chữ viết tắt CC

Sắc kí cột (column chromatography)

DMSO

Dimethyl sulfoxide

DPPH

1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl

NMR

Phổ cộng hưởng từ hạt nhân (Nuclear Magnetic Resonance)

RNM

Rừng ngập mặn

S.caseolaris

Sooneratia caseolaris

TLC

Sắc kí lớp mỏng (thin layer chromatomatography)

VSVKĐ

Vi sinh vật kiểm định

i



Mục lục Danh sách các chữ viết tắt ........................................................................................... i Mục lục ....................................................................................................................... ii Danh mục các hình ......................................................................................................v MỞ ĐẦU .....................................................................................................................1 CHƯƠNG 1. TỔNG QUAN .......................................................................................3 1.1.

ĐẶC ĐIỂM PHÂN LOẠI SONNERATIA CASEOLARIS (L.) ENGL ..........3

1.1.1.

Khái quát chung về họ Bần – Sonneratiaceae ........................................3

1.1.2.

Một số đặc điểm của các loài thuộc họ Bần tại Việt Nam......................3

1.1.2.a Chi Phay Duabanga..................................................................................4 1.1.2.b Chi Bần Sonneratia ..................................................................................4 1.1.3. 1.2.

Khái quát về loài Sonneratia caseolaris (L.) Engl. ................................5

THÀNH PHẦN HÓA HỌC ..........................................................................9

1.2.1. Các công trình nghiên cứu trên thế giới. ....................................................9 1.2.2. Các công trình nghiên cứu trong nước. ....................................................15 1.3.

Hoạt tính sinh học ........................................................................................16

CHƯƠNG 2. ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU ........................25 2.1. MẪU THỰC VẬT. .........................................................................................25 2.2. PHƯƠNG PHÁP PHÂN LẬP CÁC HỢP CHẤT..........................................25 2.2.1. Sắc ký lớp mỏng (TLC) ...........................................................................25 2.2.2. Sắc ký lớp mỏng điều chế ........................................................................26 2.2.3. Sắc ký cột (CC) ........................................................................................26 2.3. PHƯƠNG PHÁP XÁC ĐỊNH CẤU TRÚC HOÁ HỌC CÁC HỢP CHẤT .26 2.3.1. Điểm nóng chảy (Mp) ..............................................................................26 2.3.2. Phổ cộng hưởng từ nhân (NMR) ..............................................................26 2.4. PHƯƠNG PHÁP THỬ HOẠT TÍNH SINH HỌC ........................................26 2.4.1. Hoạt tính kháng vi sinh vật kiểm định .....................................................26

ii



2.4.1.a. Vật liệu ..................................................................................................26 2.4.1.b. Phương pháp .........................................................................................27 2.4.2. Hoạt tính gây độc tế bào ...........................................................................28 2.4.2.a. Thiết bị nghiên cứu ................................................................................28 2.4.2.b. Các dòng tế bào .....................................................................................28 2.4.2.c. Phương pháp .........................................................................................28 CHƯƠNG 3. THỰC NGHIỆM VÀ KẾT QUẢ .......................................................30 3.1. THU MẪU THỰC VẬT VÀ XỬ LÝ MẪU ..................................................30 ...............................................................................................................................30 3.2. PHÂN LẬP CÁC HỢP CHẤT .......................................................................31 3.3. CẤU TRÚC CÁC HỢP CHẤT PHÂN LẬP..................................................33 3.3.1. Hợp chất BCW1 .......................................................................................33 3.2.2. Hợp chất BCW2 .......................................................................................37 3.2.3. Hợp chất BCW3 .......................................................................................41 3.3.4. Hợp chất BCW4 .......................................................................................47 3.3.5. Hợp chất BCW7 .......................................................................................52 3.3.6. Hợp chất BCW5 .......................................................................................56 3.3.7. Hợp chất BCW6 .......................................................................................60 3.3.8. Hợp chất BCW9 .......................................................................................64 3.4. KẾT QUẢ THỬ NGHIỆM HOẠT TÍNH KHÁNG VI SINH VẬT VÀ GÂY ĐỘC TẾ BÀO CỦA ..............................................................................................71 3.4.1. Kết quả thử nghiệm hoạt tính kháng vi sinh vật kiểm định của một số hợp chất cây Bần chua. ..............................................................................................71 3.4.2 Kết quả thử nghiệm hoạt tính gây độc tế bào của một số hợp chất phân lập từ cây Bần chua ..................................................................................................72 KẾT LUẬN ...............................................................................................................73 Tài liệu tham khảo .....................................................................................................74 Phụ lục ......................................................................................................................... I

iii



Danh lục các bảng Bảng 1. kiểm tra thành phần hoá học định tính của các dịch chiết khác nhau trong cây Bần chua ....................................................................................................................14 Bảng 2. kết quả thử nghiệm hóa học khác nhau trên chiết xuất ethanol của lá S. caseolaris ..................................................................................................................15 Bảng 3. ảnh hưởng của dịch chiết S.caseolaris trên acid acetic gây ra đau đớn ở chuột ...................................................................................................................................17 Bảng 4. ức chế phần trăm và ức chế IC50 của dịch chiết thô của Bần chua và acid ascorbic trong DPPH triệt để.....................................................................................18 Bảng 5. hoạt động giảm đau của phần khác nhau của thân và lá S.caseolaris đối với acid acetic gây ra đau đớn ở chuột. ...........................................................................19 Bảng 6. đánh giá thống kê .........................................................................................19 Bảng 7. ảnh hưởng dịch chiết ethyl acetate gốc S.caseolaris và dịch chiết chloroform lá S.caseolaris trên thời gian tiềm ẩn của dầu thầu dầu gây ra tiêu chảy chuột........20 Bảng 8. ảnh hưởng của dịch chiết ethyl acetate từ gốc S.caseolaris và dịch chiết chloroform phần nhỏ của lá S.caseolaris trên cơ sở trung bình số lượng phân của chuột do thầu dầu gây ra tiêu chảy. ...........................................................................20 Bảng 9. kết quả đánh giá hoạt tính của các loài thực vật kiểm định .........................22 Bảng 10. dữ liệu phổ NMR của hợp chất BCW1 .....................................................35 Bảng 11. dữ liệu phổ NMR của hợp chất BCW2 .....................................................40 Bảng 12. dữ liệu phổ NMR của hợp chất BCW3 .....................................................45 Bảng 13. dữ liệu phổ NMR của hợp chất BCW4 .....................................................50 Bảng 14. dữ liệu phổ NMR của hợp chất BCW7 .....................................................54 Bảng 15. dữ liệu phổ NMR của hợp chất BCW5 .....................................................58 Bảng 16. dữ liệu phổ NMR của hợp chất BCW6 .....................................................63 Bảng 17. dữ liệu phổ NMR của hợp chất BCW9 .....................................................67 Bảng 19. kết quả thử nghiệm hoạt tính gây độc tế bào của các chất ........................72

iv



Danh mục các hình Hình 1. biểu đồ hoạt tính chống oxy hóa của Bần chua và ascorbic acid .................18 Hình 2. biểu đồ cặn chiết và các chất phân lập được từ Bần chua (50mg/ml nồng độ) đối với ức chế hoạt động α-glucosidase của chuột. Dữ liệu đại diện cho có nghĩa là ±SD của mẫu ba lần. .................................................................................................23 Hình 3. Sonneratia caseolaris (L.) Engl. - Bần chua ................................................25 Hình 4. sơ đồ chiết phân đoạn dịch chiết methanol của cây Bần chua .....................30 Hình 5. sơ đồ phân lập các hợp chất từ phân đoạn BCW3 .......................................31 Hình 6. phổ 1H-NMR của BCW1 .............................................................................33 Hình 7. phổ 13C-NMR của BCW1 ..........................................................................34 Hình 8. phổ HSQC của BCW1 .................................................................................35 Hình 9. cấu trúc của BCW1 ......................................................................................35 Hình 10. một số tương tác HMBC quan trọng của BCW1 .......................................36 Hình 11. phổ HMBC của BCW1 ..............................................................................37 Hình 12. phổ 1H-NMR của BCW2 ..........................................................................38 Hình 13. phổ 13C-NMR của BCW2 ........................................................................38 Hình 14. phổ HSQC của BCW2 ...............................................................................39 Hình 15. cấu trúc của BCW2 ....................................................................................39 Hình 16. một số tương tác HMBC quan trọng của BCW2 .......................................41 Hình 17. phổ HMBC của BCW2 ..............................................................................41 Hình 18. cấu trúc của BCW3 ....................................................................................42 Hình 19. phổ 1H-NMR của BCW3 ..........................................................................42 Hình 20. phổ 13C-NMR của BCW3 ........................................................................43 Hình 21. phổ HSQC của BCW3 ...............................................................................44 Hình 22. phổ HMBC của BCW3 ..............................................................................44 Hình 23. một số tương tác HMBC quan trọng của BCW3 .......................................45 Hình 24. phổ 1H-NMR của BCW4 ...........................................................................47 Hình 25. cấu trúc của BCW4 ....................................................................................48 Hình 26. phổ 13C-NMR của BCW4 ..........................................................................48

v



Hình 27. phổ HSQC của BCW4 ...............................................................................49 Hình 28. một số tương tác HMBC quan trọng của BCW4 .......................................50 Hình 29. phổ HMBC của BCW4 ..............................................................................51 Hình 30. phổ 1H-NMR của BCW7 ...........................................................................52 Hình 32. cấu trúc của BCW7 ....................................................................................53 Hình 33. phổ 13C-NMR của BCW7 ..........................................................................53 Hình 34. phổ HSQC của BCW7 ...............................................................................54 Hình 35. phổ HMBC của BCW7 ..............................................................................55 Hình 36. một số tương tác HMBC quan trọng của BCW7 .......................................56 Hình 37. cấu trúc của BCW5 ....................................................................................56 Hình 38. phổ 13C-NMR của BCW5 ..........................................................................56 Hình 39. phổ 1H-NMR của BCW5 ...........................................................................57 Hình 40. phổ HSQC của BCW5 ...............................................................................58 Hình 41. một số tương tác HMBC quan trọng của BCW5 .......................................59 Hình 42. phổ HMBC của BCW5 ..............................................................................60 Hình 43. cấu trúc của BCW6 ....................................................................................60 Hình 44. phổ 1H-NMR của BCW6 ..........................................................................61 Hình 44. phổ 13C-NMR của BCW6 ........................................................................62 Hình 45. phổ HSQC của BCW6 ...............................................................................62 Hình 46. phổ HMBC của BCW6 ..............................................................................63 Hình 47. một số tương tác HMBC quan trọng của BCW6 .......................................64 Hình 48. cấu trúc của BCW9 ....................................................................................64 Hình 49. phổ 1H-NMR của BCW9 ...........................................................................65 Hình 50. phổ 13C-NMR của BCW9 ..........................................................................66 Hình 51. phổ HSQC của BCW9 ...............................................................................67 Hình 52. phổ HMBC của BCW9 ..............................................................................68 Hình 53. một số tương tác HMBC quan trọng của BCW9 .......................................69

vi



MỞ ĐẦU Từ thuở xa xưa, con người đã biết sử dụng thực vật làm nguồn sống, sử dụng cỏ cây làm thuốc chữa bệnh, bảo vệ sức khỏe. Sự phát triển của xã hội đã đưa cho loài người đã có những bước tiến dài trong lịch sử, cùng với đó là sự tiến bộ vượt bậc của khoa học đã đem lại cho những phương thức chữa bệnh tuyệt vời, rất nhiều loài thuốc được sản xuất bằng con đường tổng hợp hóa học được nghiên cứu và tạo thành; song theo nhiều tài liệu thì có tới hơn 50% các loại thuốc đang được sử dụng là có nguồn gốc từ thực vật. Việt Nam nằm trong vành đai khí hậu cận nhiệt đới gió mùa, được thiên nhiên ưu ái ban tặng món quà quý giá về nguồn thực vật phong phú và đa dạng về loài và số lượng. Bên cạnh đó, Việt Nam còn có một đường bờ biển dài hơn 3.000 km từ Bắc vào Nam, điều này hình thành nên một dãy các rừng ngập mặn (RNM) có độ đa dạng sinh học cao với nhiều loài thực vật được sử dụng làm nguồn nguyên liệu trong công nghiệp dược đem lại nguồn lợi to lớn cho quốc gia. RNM được coi là tài nguyên quý trên trái đất, trong đó, nhiều thực vật ngập mặn là nguồn dược liệu trong các bài thuốc dân gian tại nhiều quốc gia khu vực châu Á-Thái Bình Dương. Vườn quốc gia (VQG) Xuân Thủy (20010'N-20015'N; 106020'E-106032'E) [56] tiêu biểu cho hệ sinh thái đất ngập nước cửa sông ven biển đồng bằng châu thổ sông Hồng. Theo Báo cáo “Quy hoạch quản lý bảo vệ và phát triển Vườn quốc gia Xuân Thuỷ, giai đoạn 2004-2020” VQG Xuân Thủy là nơi sinh sống của 116 loài, 99 chi thuộc 42 họ thực vật. Nhiều loài thực vật đã và đang được cộng đồng khu vực vùng đệm VQG Xuân Thủy sử dụng làm thuốc chữa bệnh theo kinh nghiệm dân gian nhưng chưa được kiểm định về mặt khoa học. Trong thảm thực vật RNM Bần chua (Sonneratia caseolaris) là một trong số loài thực vật ngập mặn tiêu biểu gắn bó với đời sống của người dân từ bữa ăn đến bài thuốc chữa bệnh và cả ca dao dân ca. Từ đó, chúng tôi quyết định chọn đề tài “Nghiên cứu thành phần hóa học và khảo sát hoạt tính sinh học của cây Bần chua (Sonneratia caseolaris (L.) Engl.) góp phần làm sáng tỏ thêm giá trị của loài cây này

1



trong khoa học nhằm nghiên cứu tiềm năng ứng dụng của thực vật sinh trưởng ở các khu vực RNM. Luận văn này tập trung nghiên cứu về thành phần hóc học của cây Bần chua và hoạt tính sinh học của chúng nhằm tạo cơ sở cho những nghiên cứu tiếp theo trong lĩnh vực tìm kiếm các phương thuốc mới cũng như giải thích được tác dụng chữa bệnh của các cây thuốc cổ truyền. NỘI DUNG CỦA LUẬN VĂN GỒM 1. Thu mẫu và xử lý mẫu và phân lập một số hợp chất hóa học từ cây Bần chua (Sonneratia caseolaris (L.) Engl.) 2. Xác định cấu trúc hóa học của các hợp chất đã phân lập được. 3. Đánh giá hoạt tính kháng vi sinh vật kiểm định và hoạt tính gây độc tế bào của một số hợp chất đã phân lập được.

2



CHƯƠNG 1. TỔNG QUAN 1.1. ĐẶC ĐIỂM PHÂN LOẠI SONNERATIA CASEOLARIS (L.) ENGL 1.1.1. Khái quát chung về họ Bần – Sonneratiaceae Sonneratiaceae Eng & Gilg, 1924-Họ Bần: dạng thân gỗ hoặc bụi, lá đơn, mọc đối; rất gần với Lythraceae khác nó chủ yếu bởi xu hướng tạo thành bầu hạ. Ngoài ra ở đây còn có lá kèm thoái hóa, nhị thường nhiều thành nhiều hàng và đính vào đỉnh của ống hoa, bao phấn hình thận, bộ nhụy gồm 4-20 lá noãn hợp thành bầu thượng, nhưng do đính vào gốc của ống hoa mà thành ra có dạng như bầu hạ. Hiện nay còn 2/7 chi, ở nhiệt đới Châu Á, Châu Phi, Châu Đại Dương và Australia; ở Việt Nam có cả 2 chi Duabanga và Sonneratia [41]. 1.1.2. Một số đặc điểm của các loài thuộc họ Bần tại Việt Nam 1.1.2.a Chi Phay Duabanga Ở Việt Nam hiện nay xác định và phân loại được một loài Phay, Bần Bằng lăng Duabanga grandifora (DC) Walp. Mô tả: cây gỗ lớn, cao 20-35 m; đường kính thân 80-90 cm, thân thẳng, gốc có bạnh nhỏ; vỏ nhẵn, màu xám hồng nhánh ngang, đầu cành rũ xuống, có tầng, lá non vuông. Lá to, mọc đối, không lông, đáy hình tim, đầu mũi tù, dài 12-17 cm, rộng 6-12 cm; cuống dài 1cm. Tụ tán 3 hoa to, lá đài 6, cánh hoa 6, trắng hay vàng; tiểu nhụy nhiều; bầu trung hình nón, có 6-8 ô, mỗi ô chứa nhiều noãn. Quả nang gần hình cầu, khi chín màu nâu đen, nút thành 4-8 mảnh; hạt nhỏ, nhiều. 2n=48 [47]. Sinh thái: mọc ở các rừng triền, núi ẩm 10-1300m [47]; mọc ở chân núi, dọc khe suối, ven các khe ẩm. Ưu đất sâu mát hoặc đất có lẫn đá. Cây sinh trưởng nhanh, tái sinh hạt tốt. Ra hoa tháng 2-6, có quả từ tháng 4 trở đi. Phân bố: Lai Châu, Sơn La, Cao Bằng, Vĩnh Phúc, Nghệ An, Quảng Trị, Thừa Thiên Huế, Kon Tum, Gia Lai, Lâm Đồng, Tp Hồ Chí Minh, An Giang. Còn có ở Ấn Độ, Mianma, Trung Quốc, Lào, Campuchia, Thái Lan, Malaysia. Công dụng: đồng bào dân tộc ở Nghệ An dùng chữa bí tiểu, nước tiểu đục. Ở Malaysia ăn quả non có vị chua [61]. Gỗ dùng trong xây dựng, đóng đồ gỗ thông thường. Cây có dáng đẹp, có thể trồng làm bóng mát, làm cảnh [41].

3



1.1.2.b Chi Bần Sonneratia Chi Bần chua (danh pháp khoa học. Sonneratia) là một chi của thực vật có hoa trong họ Bần chua (Sonneratiaceae). Tên khoa học khác của chi này còn là Blatti do James Edward Smith đặt, nhưng Sonneratia có độ ưu tiên cao hơn. Tên gọi chung của chúng trong tiếng Việt là Bần chua. Chúng là các loài cây thân gỗ sinh sống trong các cánh rừng tràm đước ven biển. Chi Sonneratia chứa khoảng 14-16 loài, trong đó loài quan trọng là cây Bần chua (Sonneratia caseolaris (L.) Engl.) và cây Bần chua ổi (Sonneratia alba). Hiện nay ở Việt Nam đã phân loại được 5 loài: Sonneratia alba J.Sm (Bần trắng, Bần đắng, Bần chát) Mô tả: cây gỗ cao 10-15m (25m), với nhiều rễ thở, dài 15-20 cm, rộng 3-4 cm ở gốc.Lá có phiến xoan ngược, cứng, dai, phiến tròn, có khe lõm, gốc hình nêm, dày, mập dài 5-10 cm, rộng 3-7 cm; gân bên rất mảnh, cuống lá dài 3-8 mm, hơi dẹp. Cụm hoa ở ngọn, hoa đơn độc hay hình xim 3 hoa. Đài hoa có đế dạng đấu cao 1,5-2,5 cm; có 6-8 thùy hình trứng, lục ở phía ngoài và đỏ ở phía trong. Cánh hoa dạng sợi, dài 13-20 mm, rộng 0,5-1 mm. ngắn hơn nhị và rụng sớm khi hoa còn nở. Nhị nhiều xếp thành nhiều dãy đính ở mép trong của đấu của đài, chỉ nhị dài 30-40 mm, màu đỏ ở gốc và trắng ở ngọn. Bầu dính với đài và dẹp ở đỉnh, có 14-18 ô. Quả hình con quay, cao 3-4 cm, rộng 4-5 cm, dính nửa dưới với ống đài mà các thùy cong về phía sau [61]. Sinh thái: gặp trong các RMN ven biển, chịu mặn khỏe hơn các loài Bần khác. Ra hoa quả gần như quanh năm, chủ yếu tháng 3-4 [61]. Phân bố: Khánh Hòa, Bà Rịa-Vũng Tàu, Tp Hồ Chí Minh, Bến Tre. Còn có ở nhiều nước Đông Nam Á, Châu Đại Dương, Micronedi [61]. Công dụng: ở Nuven Caledoni, lá sau khi giã ra thêm ít muối trộn thành thuốc chữa bầm tím và chống bí tiểu tiện [61]. Sonneratia apetala Buch,-Ham in Syme (Bần vô cánh) Mô tả: cây gỗ lớn, cao 12 m. Lá có phiến không lông, dày, bầu dục thon, to 810 x 2,5-3,5 m, gân phụ 14-17 cặp; cuống 5-7 mm. Hoa tương đối nhỏ, rộng 2,5-3 m, lá đài 4 (6), không lông, cao 1,5 cm; không có cánh hoa; tiểu nhụy nhiều, cao 1,5 cm;

4



vòi nhụy phù ở đầu thành nuốm rộng 5-7 mm. Trái tròn, hơi bẹp, đầu không lõm, quả bì không dày; hột nhiều, nhỏ, n= 9,12 [47]. Sinh thái: mọc ở rừng sác hay cửa sông. Sonneratia griffthii Kurz (Bần đắng, bần ổi) Mô tả: cây gỗ lớn, cao 30-45m, đường kính đến 1m, có vỏ bong như vỏ ổi; rễ thở nhiều. Lá có phiến xoan tròn, chóp tròn nhưng thường hơi lõm, gốc hẹp dần lại trên cuống, dày, không lông; gân bên 10-15 đôi, lồi mặt trên. Hoa to, lá đài 6-8, cao, có gờ ở lưng; không có cánh hoa; nhị nhiều; bầu dẹp, đầu nhụy hình đầu. Quả rộng 4-5 cm, trên đài trải ra hình sao, hạt nhỏ nhiều [61]. Sinh thái: Mọc trong RNM ven biển. Phân bố: Nam Việt Nam, Ấn Độ, Mianma. Công dụng: Ở Ấn Độ dân gian dùng rễ giã nát hơ nóng đắp lên trên da trị bệnh nấm tóc [61]. Sonneratia ovata Back. (Bần ổi, bần hôi, bần trứng) Mô tả: cây gỗ cao 4-5m (10m). Vỏ bong như vỏ ổi. Nhánh non có 4 cạnh. Lá hình trái xoan gần tròn, tròn và gần như có hình tim ở gần gốc, chóp tròn hay có khía tai bèo, dài 4-8 cm; rộng 3-7 cm; gân bên 12-14 đôi, rất mảnh, nhìn rõ ở cả 2 mặt; cuống lá dài 4-6 cm. Cụm hoa ở ngọn, thành xim 3 hoa. Nụ xoan, tròn ở 2 đầu. Đài có ống, có cạnh dài men theo cuống; thùy 6, hình tam giác, dài 8-10 mm, rộng 6-8 mm, có vách trong đỏ. Không có cánh hoa. Nhị nhiều, có chỉ nhị dài 4-5 cm. Bầu có 13-15 ô, noãn nhiều. Quả mọng gần hình cầu, đường kính 3-4 cm, cao 2-3 cm, các thùy của đài gắn liền với quả làm thành phao nổi trên quả rụng [61]. Sinh thái: gặp trong RMN ven biển nhưng không nhiều. Dọc các bờ sông có phù sa ngập mặn, hay nước ngọt một phần trong năm, cây mọc phổ biến hơn. Ra hoa tháng 3-4, quả tháng 6-7.[61] Phân bố: ở Đồng Nai (Biên Hòa), Tp Hồ Chí Minh, Cà Mau, dọc sông Cửu Long. Còn có ở Campuchia, Thái Lan, Indonexia, New Gieni.[61] Công dụng: quả có vị chua thơm, thường được người dân nấu canh chua. Lá cũng dùng để trị bầm tím, chống bí tiểu tiện [61]. 1.1.3. Khái quát về loài Sonneratia caseolaris (L.) Engl.

5



Cây Bần chua có tên khoa học là Sonneratia caseolaris (L.) Engl. thuộc họ Bần Sonneratiaceae. Sinh thái. Cây Bần chua là loài cây rừng ngập mặn nhiệt đới ưa sáng mọc tại rừng sác, cửa sông có chút nước lợ, nằm dọc theo bờ biển bùn có độ mặn thấp, thường nằm ở mặt sau của khu vực, giữa các vùng Dừa nước và khu Đước [48]. Sự phong phú của quần thể này tùy theo mức nước lợ và chế độ thủy triều. Bần chua là cây tiên phong để phát triển rừng ngập măn ven biển và các bải bồi ven sông [29], Bần chua phát triển kém ở những vùng có nước ngọt quanh năm; được phát tán rộng khắp Châu Á, Châu Phi và Châu Đại dương.Hiện nay các nước có nhiều cây Bần chua mọc hoang và được trồng như. Châu Phi, Sri-Lanka, Mianma, Thái Lan, Việt Nam, Campuchia, Philippin, Indonesia, Timor, Đảo Hải Nam (Trung Quôc), Đông Bắc Australia và một số nước ở Châu Đại dương như Niughnia, New Guinea, Solomon Islands, New Hebrides…[34]. Khi chín quả rụng và trôi nổi theo nước thủy triều, hạt sống lâu và phát tán mạnh trên các bãi bồi. Bần chua có thể trồng bằng cách gieo hạt hoặc trồng cây con mọc tự nhiên. Ra hoa vào tháng 3-4 sau mùa khô, trước mùa mưa. Hoa nở về đêm nhờ dơi thụ phấn. Bần chua là cây chắn sông, bảo hộ đất ở vùng ven biển. Ở Việt Nam cây Bần chua mọc hoang và được trồng ở rừng ngập mặn ven biển từ Bắc vào Nam nơi có nhiều bùn và bãi bồi. Ở Miền Bắc cây Bần chua mọc thành rừng gần như thuần loại ven bờ biển và vùng cửa sông như ở Hải Phòng, Nghệ An, Hà Tĩnh. Ở Miền Nam cây Bần chua là thành phần chính yếu của các rừng ngập mặn tự nhiên ven biển và chúng mọc dày đặc ven sông rạch ở Đồng bằng sông Cửu Long, các vùng ven biển miền Trung. Mô tả chung -Thân. Bần chua thuộc loài thân gỗ đại mộc, cao 10-15 m, có khi cao tới 25 m nhưng có khi là cây bụi, chỉ cao 5-6 m, có nhiều cành [47]. Cành non màu đỏ, 4 cạnh, không có lông, có đốt phình to. Gỗ xốp, bở, vỏ thân chứa nhiều tanin. - Rễ. Rễ gốc to, khỏe, mọc sâu trong đất bùn. Từ rễ mọc ra nhiều rễ thở thành từng nhóm quanh gốc [47] .

6



- Lá. Lá đơn, mọc đối, phiến lá dày, giòn,hơi mọng nước, hình bầu dục hoặc trái xoan ngược hay trái xoan thuôn, thon hẹp thành cuống ở góc, cụt hay tròn ở chóp, dai, dài 5-10cm,hình nêm; cuống và một phần gân chính màu đỏ, gân giữa nổi rõ ở cả 2 mặt, cuống dài 0,5-1,5 cm [47], [61]. - Hoa. Cụm hoa ở đầu cành, có 2-3 hoa, rộng 5 cm, có cuống hoa ngắn. Đài hợp ở gốc, có ống dài 7-12 mm có 6 thùy dày và dai, mặt ngoài màu lục, mặt trong màu tím hồng. Cánh tràng 6, màu trắng đục, hình dải, dài 17-25 mm, rộng 1-2 mm, thuôn về hai đầu [61]. Nhị, chỉ nhị hình sợi, dài 3,5-4 mm, bao phấn hình thận. Bầu hình cầu dẹt, vòi dài, đầu hơi tròn, vòi nhụy đài, đầu nhụy hơi tròn. - Quả. Quả mọng hơi nạc, khi còn non cứng, dòn, khi chín quả mọng, thịt quả mềm, ruột chứa nhiều hạt. Quả có đường kính 5-

Mẫu. Bần chua Sonneratia caseolaris(L.) Engl. Địa điểm thu hái. VQĐ Xuân Thủy, Nam Định

10 cm, cao 2-3 cm, gốc có thùy đài xòe ra

Thời gian. tháng 7 năm 2013

[61].

Người giám định. TS. Nguyễn Thế Cường Viện Sinh thái và Tài nguyên sinh vật, VAST

- Hạt. Hạt nhiều, dẹt, dài từ 6-7 mm, n = 11; 12 [47]. a- Các bộ phận của cây Bần chua được dùng làm thức ăn. - Lá non và búp hoa cây Bần chua được dùng làm rau sống. Nhiều nước trong vùng Đông Nam Á dùng lá, búp non của cây Bần chua để làm rau ăn sống, búp hoa dùng làm gỏi. - Quả Bần chua non và quả Bần chua già được dùng làm rau. Quả Bần chua chát và Bần chua chín được thái mỏng để dùng làm rau ghém, dùng riêng hoặc trộn với các loại rau khác. Đặc biệt là ăn với mắm cá sặc, mắm cá linh, mắm ruốc… - Quả Bần chua chín được dùng để ăn chơi. Do quả Bần chua có vị chua đầm nên trẻ con và cả người lớn rất thích.

7



- Quả Bần chua chín được làm nước chấm. Quả Bần chua chín dầm nát trong nước mắm, thêm gia vị như bột ngọt, ớt, đường… . - Quả Bần chua chín được làm chất chua để nấu canh chua, nấu lẩu chua. Dùng quả Bần chua chín trụng trong nước sôi, lọc bỏ hạt, sẽ có chất chua để nấu canh chua, lẩu chua từ quả Bần chua, ăn rất hấp dẫn. - Quả Bần chua chín được lên men làm giấm Bần chua. Ở Philippines nông dân ven biển dùng quả Bần chua chí để lên men ủ thành một loại giấm chua từ quả Bần chua (Crabapple vinegar) để dùng nấu ăn trong gia đình (theo Philippine medicinal plants). - Quả Bần chua chín được chế thành chất phụ gia thực phẩm. Trong quả Bần chua có chứa chất hóa học dạng thạch trong suốt dùng làm chất kết dính (theo Philippine medicinal plants). b- Các bộ phận của cây Bần chua được dùng làm thuốc. Theo Đông y. Quả Bần chua có vị chua của pho mát, tính mát; có tác dụng tiêu viêm, giảm đau. Lá có vị chát, có tác dụng cầm máu. Ở Ấn Độ, người ta dùng dịch quả lên men làm thuốc ngăn chặn chứng xuất huyết; dùng lá giã ra, thêm muối, làm thuốc đắp tốt các vết thương đụng giập và vết thương nhẹ [46]. Ở Malaysia, người ta giã lá lẫn với cơm làm thuốc đắp chữa bí tiểu tiện [46]. Ở Miến Điện, người dân dùng trái Bần chua nghiền nát thành thuốc dán hay bột nhão đắp lên gọi là thuốc dán Đông Phương, trộn với muối, đắp lên những vết cắt và những vết bầm tím (ứ máu) [46]. Ở Mã Lai, dùng Bần chua chín để trị những ký sinh trùng trong ruột, giun, sán. Ăn Bần chua chín để trị ho và dùng lá Bần chua non nghiền nát để trị các bệnh thiếu máu giảm tiểu cầu và bệnh đậu mùa [46]. Nước ép Bần chua lên men đã có thể dùng để cầm máu. Đồng thời hoa Bần chua giã nát, vắt nước điều trị bệnh tiểu ra máu. Ở Philippines đã được ghi nhận là lá và quả Bần chua non giã nhuyễn có tính cầm máu, trị bong gân, chỗ sưng và ăn quả hay lá Bần chua trừ được giun, sán.

8



Y học cổ truyền Thái Lan chỉ ra rằng những quả chín một nửa được sử dụng để làm giảm ho, các loại trái cây chín được sử dụng như thuốc giun và nước trái cây lên men dùng chữa xuất huyết. Cây Bần chua cũng được sử dụng như một chất làm se và khử trùng ở Bangladesh [21]. c-Các công dụng khác. Cây Bần chua còn có những công dụng khác như rễ thở (bất) dùng làm nút chai. Gỗ Bần chua chỉ dùng đóng đồ nhỏ, làm củi đun, làm bột giấy. Bột giấy chế biết từ gỗ Bần chua thích hợp trong việc chế biến loại giấy kraft. Các nghiên cứu sinh khối rừng ngập mặn ở Philippines cho biết sản lượng khai thác trắng cây Bần chua qua luân kỳ 10 năm được 157 tấn chất khô/ha, trong đó gỗ Bần chua chiếm 74,4 tấn/ha và sản lượng bột giấy thu hồi trên 30 tấn/ha. Nghiên cứu RNM ở Thái Lan cho biết thu hoạch gổ Bần chua từ cành tái sinh hàng năm có thể đạt 20 tấn gỗ/ha/năm và tỷ lệ bột giấy thu được trên 50%. Trên nguyên liệu rễ Bần chua hai tác giả La Vũ Thuỳ Linh và Trương Ngọc Đức (trường Đại học Tôn Đức Thắng) đã nghiên cứu sản xuất thành công than hoạt tính từ rễ Bần chua có thể thay thế các loại than hoạt tính trên thị trường trong xử lý nước, xử lý môi trường, hấp phụ khử mùi và máu [27]. Cây Bần chua có thể hấp thụ, tích lũy, phân phối và lưu thông kim loại nặng như Cu, Pb, Zn, Cr và Ni đối với RNM [65]. 1.2. THÀNH PHẦN HÓA HỌC Thành phần hóa học của loài S.caseolaris được các nhà khoa học khá quan tâm nghiên cứu trong các công trình khoa học. 1.2.1. Các công trình nghiên cứu trên thế giới. Thành phần hoá học của cây S.caseolaris được các nhà khoa học trên thế giới khá quan tâm. Từ những năm 1983 theo kết quả nghiên cứu của các tác giả Duke [16] và Fengxian Meifang & Liu (1994) Bần chua có chứa 11% pectin.

9



Cấu tạo pectin Tiếp đó, kết quả nghiên cứu của tác giả Hogg R W năm 1984 cho thấy S.caseolaris chủ yếu có chứa acid béo, hydrocacbon, steroid, pectin, và đường [25]. Năm 2006, theo hướng sử dụng S.caseolaris trong các bài thuốc dân gian nhóm các tác giả Nhật Bản đã kiểm tra chiết xuất của S.caseolaris về hoạt tính chống oxy hoá bằng sử dụng 1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl (DPPH) trên sắc kí bản mỏng thì tách được hai flavonoids là luteolin và luteolin 7 - O - bglucoside. Cả hai hợp chất được tìm thấy để sở hữu hoạt tính chất chống oxy hoá [50].

Luteolin

Luteolin 7-rutinoside

Đến năm 2009 Wu Shi-Biao (Trung Quốc) tách được 9 hợp chất từ lá Bần chua, trong đó 2 hợp chất nor-lignans (1, 2) và 2 dẫn xuất 6H-benzo[b,d]pyran-6-one (3, 4) được phần lập lần đầu tiên từ chi Sonneratia có thể coi là các các chất “chỉ dấu” (taxonomic markers) cho việc phân loại chi này. Kết quả đánh giá hoạt tính gây độc tế bào trên dòng tế bàou thần kinh đệmchuột C-6 cho thấy các chất 1, 2, và 6 thể hiện khả năng gây độc tế bào ở mức độ trung bình với IC50 tương ứng là 19.02,20.21và31.77µg/ml (đối chứng dương 5-ﬂuorouracil có IC50 = 5.84 µg/ml).[62].

10



1. (-)-(R)-nyasol

2. (-)-(R)-4’-Omethylnyasol

4. 3-hydroxy-6Hbenzo[b,d]pyran-6-one

5. oleanolic acid

7. luteolin

8. luteolin 7-O-β -glucoside

3. 3,8-Dihydroxy-6Hbenzo[b,d]pyran-6-one

6. maslinic acid

9. benzyl-O-β-Dglucopyranoside

Cũng trong năm 2009, nhóm tác giả Tian Minqing và cs đã công bố 24 hợp chất phân lập từ cây Bần chua trong đó có tám steroid (1-8), chín triterpenoids (9-16, 24), ba flavonoid (20-22), các dẫn xuất và bốn benzenecarboxylic (17-19, 23). 6′-OAcetyl-β-daucosterol (1), β-Sitosterol (2), Stigmasterol (3), β-Sitosterol palmitate (4), Stigmast-5-en-3β-O-(6-O-hexadecanoyl-β-D-glucopyranoside (5), Daucosterol (6), Cholesterol (7), Cholest-5-en-3β,7α-diol (8), Betulin (9), Lupeol (10), Lup-20(29)en-3β,24-diol (11), 3β-O-(E)-Cumaroyl-alphitolinsaeure (12), 3β-O-Acetyl-oleanolic acid (13), Oleanolic acid (14), 3β,13β-Dihydroxy-urs-11-en-28-oic acid-13-lactone (15), Ursolic acid (16), Bis(2-ethylhexyl)benzene-1,2-dicarboxylate (17), 3,3′-Di-Omethyl ether ellagic acid (18), 3,3′,4-O-Tri-O-methyl ether ellagic acid (19), (+)Dihydrokaempferol (20), 3′,4′,5,7-Tetrahydroxyflavone (21), Quercetin-3-O-β-L-

11



arabinopyranoside (22), Methyl gallate (23), 3β-Hydroxy-20(29)-lupen-24-oic acid (24). Trong số 24 hợp chất này, các hợp chất 1, 4-20 và 22-24 được phân lập lần đầu tiên từ loài S. caseolaris. Các thử nghiệm in vitro gây độc tế bào trên dòng tế bào gan người SMMC-7721 cho thấy hợp chất 21 (3',4',5,7-tetrahydroxyflavone)thể hiện hoạt tính tốt với IC50= 2,8 µg/ml, còn các hợp chất acid oleanolic (14), 3,3'-di-Omethyl etheracid ellagic (18), và 3,3',4-O-tri-O-methyl ether acid ellagic (19) có hoạt tính yếu. Hoạt tính kháng khuẩn của các hợp chất trên cũng được thử nghiệm trên các chủng Candida albicans và Staphylococcus aureus, tuy nhiên không có hợp chất nàothể hiện hoạt tính đáng kể [55].

12



Một vài nghiên cứu về thành phần hóa học khác như. nghiên cứu của nhóm tác giả người Ấn Độ năm 2010 sử dụng một lượng nhỏ các dịch chiết khác nhau với các thuốc thử khác nhau để kiểm tra sự hiện diện của các thành phần các chất có trong các dịch chiết này. Kết quả được cho trong bảng 1 trong đó dấu (+) cho kết quả sự hiện diện của hợp chất cần kiểm tra còn dấu (-) thì không thấy [30].

13



Bảng 1. kiểm tra thành phần hoá học định tính của các dịch chiết khác nhau trong cây Bần chua

Nghiên cứu của tác giả Manulu năm 2011 co kết quả 100 gram thịt quả Bần chua có chứa vitamin A ở 221,97 IU; 5,04 mg vitamin B1; 7,65 mg vitamin B2 và vitamin C 56,74 mg [36].

Vitamin A

Vitamin B1

14


Vitamin B2


Vitamin C

Năm 2012, theo kết quả xét nghiệm hóa học khác nhau trên chiết xuất ethanol của lá S.caseolaris của tác giả Md. Sariful và cộng sự cho thấy sự hiện diện của đường khử, saponin, tannin và flavonoids [38] (Bảng 2). Bảng 2. kết quả thử nghiệm hóa học khác nhau trên chiết xuất ethanol của lá S. caseolaris

1.2.2. Các công trình nghiên cứu trong nước. Các nghiên cứu về thành phần hóa học cây Bần chua tại Việt Nam còn ít và chưa thật sự mang lại kết quả khoa học cao. Năm 2012, hai tác giả Lê Thanh Phước và Từ Minh Tỏ nghiên cứu trên vỏ rễ Bần chua thu được 2 hợp chất là PHUOC-TO-01 là betulinaldehydevà hợp chất PHUOC-TO-02 được nhận danh là lupeol [33].

15


Lupeol


Betulinaldehyde

Betulinaldehyde là một triterpen được tìm thấy trong các loài thực vật, có khả năng kháng một số loại vi trùng như. Basillus subtilis, Escherichia coli, Pseudomonas (M. Shoeb et al., 2005), gây độc đối với tế bào trên màng bụng của chuột (Manuel Jesus Chan-Bacab et al., 2001). Ngoài ra nó là hợp chất quan trọng để tổng hợp betulinic acid và các dẫn xuất của betulin một trong những hợp chất có thể dùng để điều trị các bệnh khó chữa trị như. ung thư, HIV(Human Immuno-deficiency Virus) (Perumal Yogeeswari et al., 2005). Năm 2014, Trong luận văn đại học của tác giả Đinh Thị Thuý Duy về “Nghiên cứu thành phần hoá học trong cao petroleum ether từ lá cây Bần chua (Sonnerratia caseolaris (L.) Engl.)” tác giả cũng công bố các hợp chất PHUOC-VY-01 là Lupeol còn 2 hợp chất PHUOC-VY-02, PHUOC-VY-03 chưa xác định cấu trúc [16]. 1.3. Hoạt tính sinh học Các loài Sonneratia nói chung và cây Bần chua (Sonneratia caseolaris) đều là các cây thuốc quý, chứa nhiều hợp chất có hoạt tính sinh học đáng quan tâm. Hoạt tính gây độc tế bào. Trong một nghiên cứu chỉ ra hợp chất (-)-R-nyasol, (-)-R-4-O-methylnyasol và maslinic acid trong cây Bần chua chịu trách nhiệm về hoạt động gây độc tế bào [10]. Hoạt tính chống oxy hóa và khả năng giảm đau. Năm 2003, nghiên cứu của Nuntavan Bunyapraphatsara và cộng sự cho kết quả trong 52 mẫu của 32 loài thử nghiệm, đài hoa của S.caseolaris có hoạt tính chống

16



oxy hóa mạnh mẽ, tiếp theo là đến nhị của loài này. Thành phần của đài hoa và nhị hoa của Bần chua chứa peroxy chống lipit cao [42]. Năm 2012, tác giả Md. Sariful và cộng sự tiếp tục nghiên cứu kĩ khả năng chống oxy hoá của dịch chiết ethanol từ lá cây S.caseolaris cho thấy khả năng giảm đau và chống oxy hoá hiệu quả và chứng minh nó sử dụng trong phương thuốc dân gian. Kết quả cho thấy dịch chiết thô sản xuất 24,37 % giảm đau với liều 250 mg/kg trọng lượng cơ thể và 43,15 % giảm đau với liều lượng 500 mg/kg trọng lượng cơ thể trong khi thuốc tiêu chuẩn ức chế diclofenac Na 65.48 % với liều 25 mg/kg trọng lượng cơ thể [38]. Bảng 3. ảnh hưởng của dịch chiết ethanol từ lá S.caseolaris đối với khả năng giảm đau ở chuột.

Sử dụng DPPH trên TLC quan sát dưới tia cực tím phát hiện trong cả hai bước sóng 254 nm và 360 nm. Thành phần chất chống oxy hóa trong dịch chiết ethanol của S.caseolaris đã được xác định, chiết xuất gây ra sự gia tăng trong hoạt động DPPH gốc tự do oxy hoá (% ức chế) như tăng liều, cho thấy hoạt động chống oxy hóa tiềm năng IC50 là 68 ± 0,82 mg ml-1 (p <0,001), so với của acid ascorbic (IC50 13 ± 0,21 mg ml-1) (P <0.001) là một chất chống oxy hóa nổi tiếng (Bảng 4, Hình 1).

17



Bảng 4. so sánh phần trăm ức chế và IC50 của dịch chiết thô lá cây Bần chua với ascorbic acid

Hình 1. biểu đồ thể hiện hoạt tính chống oxy hóa của Bần chua và ascorbic acid Cũng theo hướng nghiên cứu hoạt tính chống oxy hóa của cây Bần chua, năm 2013, nhóm tác giả P. Wetwitayaklung và cộng sự đã nghiên cứu và tìm kiếm hoạt tính dược lý của các phân đoạn dịch chiết khác nhau từ các bộ phận của loài cây này. Kết quả cho thấy khả năng chống oxy hóa của dịch chiết methanol của đài bằng phương pháp ngâm và dịch chiết methanol của nhị hoa bằng phương pháp Soxhlet là vừa phải. Cho xét nghiệm chất chống oxy hoá giảm sắt, tất cả dịch chiết cho hoạt tính chất chống oxy hoá thấp. Dịch chiết nhụy và dịch chiết hạt bằng phương pháp ngâm chiết methanol cho thấy ức chế không cạnh tranh trên hoạt tính acetylcholinesterase. Trong khi, luteolin, luteolin glycoside và dịch chiết đài và dịch chiết hạt bằng cách đun sôi nước biểu hiện ức chế cạnh tranh từng phần trên hoạt tính acetylcholinesterase [43]. Trong một bài báo khác của tác giả Bishwajit Bokshi và cộng sự năm 2013, thử nghiệm sàng lọc hoạt tính giảm đau của Sonneratia caseolaris của dịch chiết thô ethanol của lá và thân cây Bần chua thu được có hoạt tính khác nhau [13]. Các tác giả

18



cũng sử dụng mô hình thí nghiệm dùng acetic acid gây đau đớn ở chuột (Whittle, 1964; Ahmed et al.,2004) [13]. Kết quả cho thấy chuột trong nhóm tiêu chuẩn có khả năng giảm đau 67% so với nhóm kiểm soát. Dịch chiết ethyl acetate của thân (EACS) và dịch chiết chloroform của lá (CFCL) cho thấy hoạt động giảm đau 33%, và 17% ở liều 250 mg/kg tương ứng 50% và 54% ở 500 mg/kg liều tương ứng (Bảng 5 và 6). Bảng 5. hoạt động giảm đau của phân đoạn chiết khác nhau của thân và lá S.caseolaris đối với acid acetic gây ra đau đớn ở chuột.

Bảng 6. đánh giá thống kê

Hoạt tính trị tiêu chảy. Cũng theo công bố của nhóm tác giả Bishwajit Bokshi và cộng sự cho thấy hoạt tính trị tiêu chảy của dịch chiết ethanol các phần khác nhau của cây Bần (Chatterjee, 1993) [13]. Kết quả cho thấy dịch chiết từ cây Bần chua gây ra sự gia tăng trong thời gian tiềm ẩn nghĩa là trì hoãn sự khởi đầu của quá trình bị tiêu chảy và giảm tần suất số lần đại tiện và số phân. Từ kết quả bảng 7 và 8 có thể được kết luận rằng dịch phân đoạn Ethyl Acetate của thân S.caseolaris có ý nghĩa nhất hoạt động trị tiêu chảy.

19



Bảng 7. ảnh hưởng dịch chiết ethyl acetate thân và dịch chiết chloroform lá từ cây Bần chua trên thời gian tiềm ẩn của dầu thầu dầu gây ra tiêu chảy ở chuột.

Bảng 8. ảnh hưởng dịch chiết ethyl acetate thân và dịch chiết chloroform lá từ cây Bần chua trên cơ sở trung bình số lượng phân của chuột do thầu dầu gây ra tiêu chảy.

Hoạt tính kháng khuẩn. Các nhà khoa học người Thái Lan năm 2012 khi nghiên cứu về khả năng kháng khuẩn của cây Bần chua đã sử dụng ba xét nghiệm dựa trên môi trường thạch khác nhau (SPPD, SWPD, PPD) với dịch chiết methanol từ hạt cây Bần chua và gallic acid đã được thử nghiệm. Kết quả cho thấy dịch chiết này có thể ức chế Staphylococcus aureus và Candida albicans nhưng không ức chế Escherichia coli trong khi acid gallic cho thấy hoạt động chống lại chỉ Staphylococcus aureus. Tất cả phương pháp cho thấy các kết quả của hoạt động kháng khuẩn không khác biệt. Sau đó các chất chiết xuất từ lá, rễ thở và các bộ phận khác nhau của hoa hoặc trái cây (nhị hoa, đài hoa, thịt trái cây và hạt giống) và gallic acid đã được thử nghiệm cho hoạt tính kháng khuẩn sử dụng môi trường SWPD đối với ba loài (Streptococcus mutans, Propionibacterium acnes và các vi khuẩn kỵ khí). Tất cả các chiết xuất thử nghiệm cho thấy hoạt tính kháng khuẩn chống chỉ P. acnes trong khi gallic acid có hoạt tính kháng khuẩn chống lại S. mutans, P. acnes và vi khuẩn kỵ khí [31].

20



Dịch chiết Bần chua có một số hợp chất thuộc các nhóm chất hóa học có hoạt tính cao như: flavonoid, steroid, phenol và tannin hydroquinone, có hoạt tính kháng khuẩn chống lại V. harveyi trong ống nghiệm [40]. Hydroquinone được phân lập từ S. caseolaris, cho thấy hoạt tính kháng khuẩn [39], [57], kháng nấm [57], chất chống oxy hóa [2], và có khả năng kích thích các tế bào nguyên bạch cầu hạt đại thực bào in vitro và in vivo [23]. Nghiên cứu của tác giả Arifudin và cộng sự đã chứng minh dịch chiết methanol và dịch chiết chloroform từ quả Bần chua có tác dụng chống vi khuẩn để kiểm soát Vibrio harveyi kết quả cho thấy tổng số tôm sống sót cao hơn đối chứng (100% so với 50%). Tổng số của V. harveyi từ tiêm tôm, trước hoặc sau khi thử nghiệm giảm 2,6 l x l04 CFU/g và 1,61 x 104 CFU/g, tương ứng với nồng độ ức chế tối thiểu MIC 3000 ppm [6],[7] . Nghiên cứu năm 2012 của các nhà khoa học người Philippines đã phát hiện trong dịch chiết của lá và cành cây Bần chua trong thức ăn tôm sú có glycosides, steroid, triterpenes, sterol và flavonoid được xác định bởi TLC. Dựa trên thí nghiệm chiết xuất cành cho kết quả hoạt tính kháng khuẩn cao hơn so với các chiết xuất từ lá. Hơn nữa, dịch chiết methanol từ cành cho hoạt tính kháng khuẩn cao nhất và do đó được sử dụng để thử nghiệm thêm. Tôm có chế độ ăn thêm chất chiết xuất từ Bần chua cho kết quả có giá trị cao hơn đáng kể so với đã làm các nhóm kiểm soát củatôm. Không có dấu hiệu ngộ độc hoặc bất kỳ tác dụng phụ thay đổi mô học trong tôm cho ăn khẩu phần thuốc ở 1000 mg ml. [44], [45]. Theo báo cáo gần đây năm 2013 của các tác giả nhóm nghiên cứu Trần Mỹ Linh về đánh giá hoạt tính ức chế vi khuẩn kiểm định đối với dịch chiết từ cành lá của Sonuneratia caseolaris, kết quả đánh giá hoạt tính với vi khuẩn Proteus mirabilis ATCC®29245™ và Proteus vulgaris ATCC®33420™* cho thấy Sonneratia caseolaris thể hiện hoạt tính ức chế mạnh [56].

21



Bảng 9. kết quả đánh giá hoạt tính của các loài thực vật kiểm định

Giá trị biểu hiện ở các cột. Bán kính vùng ức chế (BK). (-). không có biểu hiện ức chế, vi khuẩn phát triển bình thường. Đối chứng dương. Ampicilin 0,1 mg/ml với E. coli và P. mirabillis; Kanamycin 5 mg/ml với S. aureus và P. vulgaris. Các giá trị bán kính vùng ức chế sinh trưởng của vi sinh vật được tính trung bình của ba lần thí nghiệm lặp lại. Hoạt tính hạ đường huyết. Năm 2010 trong nghiên cứu của các tác giả người Ấn Độ đã phân lập và xác định được ba hợp chất từ dịch chiết methanol cây Bần chua có hoạt tính sinh học là oleanolic acid, β-sistosterol-β-Dglucopyranoside và luteolin. Trong đó hợp chất oleanolic acid trong thí nghiệm với α-glucosidase ruột chuột cho thấy hoạt tính ức chế mạnh α-glucosidase (IC 50 = 15 mM); tuy nhiên, tiềm năng ức chế của nó giảm mạnh khi α-glucosidase ruột chuột được nuôi cấy với chất nền trước. Trong các nghiên cứu in vivo cũng cho thấy hoạt động chống tăng đường huyết của hợp chất oleanolic acid trong xét nghiệm dung nạp tinh bột. Đây là báo cáo đầu tiên xác định oleanolic acid trong quả S.caseolaris ức chế α-glucosidase của ruột và các hoạt động chống tăng đường huyết [8].

22



Hình 2. biểu đồ cặn chiết và các chất phân lập được từ Bần chua (50mg/ml nồng độ) đối với ức chế hoạt động α-glucosidase của chuột. Dữ liệu đại diện cho có nghĩa là ±SD của mẫu ba lần. Trong nghiên cứu khác về hoạt tính chống tăng đường huyết của thân cây Curcuma zedoaria (Christm.) và quả cây Sonneratia caseolaris cho thấy dịch chiết methanol của cây Bần chua có hiệu quả chống tăng đường huyết [25]. Maslinic acid phân lập từ quả Bần chua [62] đã được chứng minh là có tác dụng ức chế αglucosidase vừa phải. Các chất chiết xuất có thể tăng tiết insulin của tụy, tăng sự hấp thu glucose từ máu, hoặc giảm hấp thu glucose từ ruột [16], [10]. Kết quả nghiên cứu năm 1979 của các tác giả Anderson và Ward cho thấy quả Bần chua có chứa sợi toeritis có tác dụng làm giảm lượng đường trong máu và cholesterol [3]. Cung cấp chất xơ 39 g/ngày có thể làm giảm glucose 12 mg/dl trong điều kiện ăn chay và giảm lượng đường trong máu 17 mg/dl các điều kiện sau ăn. Cũng trong nghiên cứu tác dụng hạ đường huyết từ dịch chiết methanol của quả Bần chua thu hái từ khu vực Bagerhat, Sundarbans, Bangladesh của tác giả M.N.Hasan và cộng sự tháng 4 năm 2013 đã chứng minh dịch chiết có tác dụng hạ đường huyết và hoạt động trị tiểu đường; cải thiện glucose trong máu bằng gia tăng mẫn cảm insulin đến tế bào hoặc do giảm hấp thu glucose từ đường dạ dày - ruột hoặc

23



do giảm gan tạo đường và sự hủy glucose, giống như thuốc trị bệnh tiểu đường mà không cần insulin. Thành phần cơ bản của trái quả Bần chua có vài các đặc tính có dược tính và có thể dùng cho điều trị bệnh khác nhau [35]. Hoạt tính chống tai biến tim. Trong nghiên cứu của tác giả R.Ahmed và cộng sự về tác dụng chống tai biến tim trên đối tượng chuột kết quả cho thấy bột lá của Bần chua có tác dụng có lợi về phòng chống tai biến tim. Bột lá cũng làm giảm đáng kể nồng độ đường trong máu ở những con chuột sau khi dùng trong 28 ngày. Do đó thường xuyên của bột lá cũng có thể giúp bệnh nhân tiểu đường trong việc duy trì một mức độ đường trong máu bình thường [49].

24



CHƯƠNG 2. ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.1. MẪU THỰC VẬT. Cây Bần chua được thu hái vào tháng 07 năm 2013 tại Vườn Quốc gia Xuân Thủy (Cồn Ngạn) – Giao Thủy – Nam Định. Tọa độ. N. 20.25807; E. 106.57592. Mẫu cây được TS. Nguyễn Thế Cường, Viện Sinh thái và Tài nguyên sinh vật, Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam giám định.

Hình 3. Sonneratia caseolaris (L.) Engl. - Bần chua Ảnh TS. Nguyễn Thế Cường, chụp tại VQG. Xuân Thủy Mẫu tiêu bản (VAST,ĐTCB-TC5) được lưu giữ tại Viện Hoá Hóa sinh biển và Viện Sinh thái và Tài nguyên sinh vật, Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam. 2.2. PHƯƠNG PHÁP PHÂN LẬP CÁC HỢP CHẤT 2.2.1. Sắc ký lớp mỏng (TLC) Sắc ký lớp mỏng được thực hiện trên bản mỏng tráng sẵn DC-Alufolien 60 F254 (Merck 1,05715), RP18 F254s (Merck). Phát hiện chất bằng đèn tử ngoại ở hai

25



bước sóng 254 nm và 368 nm hoặc dùng thuốc thử là dung dịch H2SO4 10% được phun đều lên bản mỏng, sấy khô rồi hơ nóng trên bếp điện từ đến khi hiện màu. 2.2.2. Sắc ký lớp mỏng điều chế Sắc ký lớp mỏng điều chế thực hiện trên bản mỏng tráng sẵn Silica gel 60G F254 (Merck, ký hiệu 105875), phát hiện vệt chất bằng đèn tử ngoại hai bước sóng 254 nm và 368 nm, hoặc cắt rìa bản mỏng để phun thuốc thử là dung dịch H 2SO4 10%, hơ nóng để phát hiện vệt chất, ghép lại bản mỏng như cũ để xác định vùng chất, sau đó cạo lớp Silica gel có chất, giải hấp phụ bằng dung môi thích hợp. 2.2.3. Sắc ký cột (CC) Sắc ký cột được tiến hành với chất hấp phụ là Silica gel pha thường và pha đảo. Silica gel pha thường có cỡ hạt là 0,040-0,063 mm (240-430 mesh). Silica gel pha đảo YMC RP-18 (30-50 m, FuJisilisa Chemical Ltd.). 2.3. PHƯƠNG PHÁP XÁC ĐỊNH CẤU TRÚC HOÁ HỌC CÁC HỢP CHẤT 2.3.1. Điểm nóng chảy (Mp) Điểm nóng chảy được đo trên máy Kofler micro-hotstage của Viện Hóa sinh biển. 2.3.2. Phổ cộng hưởng từ nhân (NMR) Phổ cộng hưởng từ nhân (NMR). 1H-NMR (500 MHz), 13C-NMR (125 MHz), DEPT135, DEPT90, HSQC và HMBC được đo trên máy Bruker AM5a00 FT-NMR Spectrometer, Viện Hóa học, Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam. 2.4. PHƯƠNG PHÁP THỬ HOẠT TÍNH SINH HỌC 2.4.1. Hoạt tính kháng vi sinh vật kiểm định 2.4.1.a. Vật liệu Hoạt tính kháng vi sinh vật kiểm định được tiến hành để đánh giá hoạt tính kháng sinh của các hợp chất thu được theo phương pháp hiện đại của Vander Bergher và Vlietlinck (1991) [58], và McKane & Kandel (1996) [37]. Các chủng vi sinh vật kiểm định -

Vi khuẩn Gr (-). Escherichia coli (ATCC 25922 )

26



Pseudomonas aeruginosa (ATCC 25923 ) - Vi khuẩn Gr (+). Bacillus subtillis (ATCC 11774 ) Staphylococcus aureussubsp. aureus (ATCC 11632) - Nấm mốc.

Aspergillus niger (439) Fusarium oxysporum (M42)

- Nấm men .

Candida albicans (ATCC 7754) Saccharomyces cerevisiae (SH 20)

Chứng dương tính + Streptomycin cho vi khuẩn Gr(+) + Tetracyclin cho vi khuẩn Gr(-) + Nystatin hoặc Amphotericin B cho nấm mốc và nấm men. Kháng sinh pha trong DMSO 100% với nồng độ thích hợp. Streptomycin 4 mM; Tetracyclin 10 mM; Nystatin 4 mM. Chứng âm tính Vi sinh vật kiểm định không trộn kháng sinh và chất thử. Môi trường nuôi cấy vi sinh vật - Môi trường duy trì và bảo tồn giống. Saboraud Dextrose Broth (SDB- Sigma) cho nấm men và nấm mốc. Trypcase Soya Broth (TSB-Sigma) cho vi khuẩn. - Môi trường thí nghiệm. Eugon Broth (Difco, Mỹ) cho vi khuẩn, Mycophil (Difco, Mỹ) cho nấm. 2.4.1.b. Phương pháp Chuẩn bị VSVKĐ Các chủng VSVKĐ được duy trì trong các môi trường. thạch thịt - pepton đối với vi khuẩn; Hanxen đối với nấm men, và Czapek - Dox đối với nấm mốc. Trước khi tiến hành thí nghiệm, các chủng VSVKĐ được hoạt hóa trong các môi trường dinh dưỡng dịch thể. môi trường Eugon Broth cho vi khuẩn và Mycophyl cho nấm (ủ 24 giờ ở 37°C đối với vi khuẩn, 48 giờ ở 30°C đối với nấm), sau đó pha loãng tới nồng độ 0,5 đơn vị Mc Land (khoảng 108 vi sinh vật/ml). Chuẩn bị mẫu thử Hòa tan mẫu thử bằng dung môi DMSO với nồng độ 1mg/ml đối với chất tinh.

27



Tiến hành thí nghiệm Nhỏ vào các giếng của phiến thí nghiệm theo sơ đồ như sau. Dãy 1. môi trường nuôi VSVKĐ. Dãy 2. dung môi + huyền dịch VSVKĐ đã được hoạt hóa. Dãy đối 3. huyền dịch VSVKĐ đã được hoạt hóa. Dãy thí nghiệm. mẫu thử + huyền dịch VSVKĐ đã được hoạt hóa. Các phiến thí nghiệm trong tủ ấm 37oC/24 cho vi khuẩn và 30oC/48 giờ đối với nấm sợi và nấm men. 2.4.2. Hoạt tính gây độc tế bào 2.4.2.a. Thiết bị nghiên cứu Tủ ấm CO2 (INNOVA CO-170); Tủ cấy an toàn sinh học cấp II; Máy li tâm (Universal 320R); Kính hiển vi ngược (Zeizz); Tủ lạnh sâu -250C,-800C; Buồng đếm tế bào (Fisher, Hoa Kỳ); Máy quang phổ (Genios Tecan); Bình nito lỏng bảo quản tế bào và các dụng cụ thí nghiệm thông thường khác. 2.4.2.b. Các dòng tế bào Các dòng tế bào ung thư của người được cung cấp bởi ATCC gồm. KB (Human epidermic carcinoma), ung thư biểu mô, là dòng luôn luôn được sử dụng trong các phép thử độ độc tế bào ; Hep G2 (Hepatocellular carcinoma) - ung thư gan; LU (Human lung carcinoma) – ung thư phổi và MCF-7 (Human breast carcinoma) - ung thư vú. 2.4.2.c. Phương pháp Phương pháp thử độ độc tế bào in vitro được Viện Ung thư Quốc gia Hoa kỳ (NIC) xác nhận là phép thử độ độc tế bào chuẩn nhằm sàng lọc, phát hiện các chất có khả năng kìm hãm sự phát triển hoặc diệt tế bào ung thư ở điều kiện in vitro [20], [51]. Các dòng tế bào ung thư nghiên cứu được nuôi cấy trong môi trường nuôi cấy phù hợp có bổ sung thêm 10% huyết thanh phôi bò (FBS) và các thành phần cần thiết khác ở điều kiện tiêu chuẩn (5% CO2; 37oC; độ ẩm 98%; vô trùng tuyệt đối). Tùy thuộc vào đặc tính của từng dòng tế bào khác nhau, thời gian cấy chuyển cũng khác nhau. Tế bào phát triển ở pha log sẽ được sử dụng để thử độc tính.

28



Thử độc tế bào. 200l dung dịch tế bào ở pha log nồng độ 3 x 104 tế bào/ml vào mỗi giếng (đĩa 96 giếng) trong môi trường DMEM cho các dòng tế bào HepG2, MCF7, KB, LU. Mẫu thử được pha loãng sao cho đạt nồng độ cuối cùng là 128 g/ml; 32g/ml; 8g/ml; 2g/ml; 0,5g/ml. Ủ 370C, 5% CO2 3 ngày. Giếng điều khiển (đối chứng dương) chỉ gồm 200 l dung dịch tế bào 3x104 tế bào/ml. Ellipticine (Sigma) được dùng làm chất tham khảo (đối chứng âm). Sau 3 ngày nuôi cấy; ủ tiếp với MTT 0,2 mg/ml ở 370C trong 4 giờ; loại bỏ môi trường, thêm 100 l DMSO lắc đều đọc kết quả ở bước sóng 540 nm trên máy spectrophotometter Genios TECAN. Phần trăm kìm hãm sự phát triển của tế bào (Growth inhibition) được tính toán dựa trên số liệu đo mật độ quang học OD trên máy quang phổ TECAN theo công thức sau. OD mẫu thử - OD control (+) IC(%) = 100 x ______________________ OD control(-) – OD control (+) Giá trị IC50 được tính dựa trên số liệu phần trăm kìm hãm sự phát triển của tế bào bằng phần mền máy tính table curve.

29



CHƯƠNG 3. THỰC NGHIỆM VÀ KẾT QUẢ 3.1. THU MẪU THỰC VẬT VÀ XỬ LÝ MẪU Mẫu cây Bần chua (Sonneratia caseolaris) được rửa sạch, phơi khô trong bóng râm, sau đó sấy khô bằng tủ sấy ở nhiệt độ 50oC, sau cùng đem nghiền nhỏ thành bột thu được 5 kg bột khô. Sau đó được tiến hành chiết tổng bằng MeOH trên thiết bị chiết siêu âm thu được 570 g cặn chiết MeOH thô. Tiếp đó, ta hòa vào nước cất và chiết phân bố lần lượt với n_Hexan, chloroform và etyl axetat theo tỷ lệ 1/1, thu được các cặn chiết tương ứng từ đó.

Bột lá khô Sonneratia caseolaris Chiết MeOH

BC- Cặn MeOH (570g)

Bổ sung nước Bổ sung N-Hexan

N-Hexan. nước 1/1

BCH. CặnN-Hexan (22.5 g)

Lớp nước Bổ sung CHCl3

CHCl3. nước 1/1

BCC. CặnCHCl3(22.5 g)

Lớp nước EtOAc. nước 1/1

BCE. Cặn EtOAc (9.3 g)

Bổ sung EtOAc

BCW. Lớp nước

Hình 4. sơ đồ chiết phân đoạn dịch chiết methanol của cây Bần chua

30



3.2. PHÂN LẬP CÁC HỢP CHẤT Phần rửa 100% MeOH (BCW3)

CC, Sephadex LH-20 MW 1.1

BCW3.2 (1,3g)

BCW3.1 (1,3g) CC, Silicagel EMW 15.1.0.1

W3.1A

W3.1B (350mg)

W3.1B2 (350mg)

BCW1 (30mg)

W3.2C (400mg)

W3.2B

CC, Sephadex MW 1.1

W3.1D1 (30mg)

W3.1D2 (35mg)

CC, Sephadex MW 1.1

CC, Sephadex MW 1.1

BCW7 (5mg)

W3.2A (300mg)

W3.1D (116mg)

W3.1C

CC, YMC RP18 MW 1.1

BCW3.4

CC, Silicagel DMW 5.1.0.1

CC, Silicagel DAM 2.1.0.1

W3.1B2 (350mg)

BCW3.3

W3.2A

W3.2B (350mg)

W3.2C

CC, Silicagel EMW 20.1.0.2

CC, DMW 3.1.0.1

W3.2C 2

W3.2C1 (100mg)

CC, YMC RP18 MW 1.4

BCW3 (15mg)

BCW9 (5mg) BCW5 (7mg)

BCW6 (5mg)

BCW2 (7mg)

BCW4 (5mg)

Hình 5. sơ đồ phân lập các hợp chất từ phân đoạn BCW3 Phần dịch nước tiến hành chạy dianion theo tỉ lệ MW 0/100-100/0 thu được 3 phần BCW1, BCW2, BCW3. Phân đoạn BCW3 tiến hành phân tách thô thành 4 phân đoạn BCW3.1 đến BCW3.4 bằng sắc kí cột silica gel sephadex với hệ dung môi rửa giải MW 1/1. Từ phân đoạn BCW3.1 tiến hành chạy sắc kí cột silicagel thường hệ dung môi rửa giải là EMW 15/1/0.1 thu được phân đoạn từ W3.1A đến W3.1D. Từ phân đoạn W3.1B (350mg) chạy sắc kí cột pha thường sử dụng hệ dung môi DAM 2/1/0.1 thu được hai phân đoạn nhỏ hơn lần lượt là W3.1B1 và W3.1B2. Hợp chất BCW1 (30mg) thu được từ phân đoạn W3.1B1 bằng cách chạy sắc kí cột sử dụng hạt YMC với hệ dung môi MW 1/1. Từ phân đoạn W3.1B2 (100 mg) phân tách được hai hợp chất

31



BCW 7 (5mg) và BCW 8 (3mg) bằng cách tiến hành sắc kí cột sử dụng hạt sephadex với hệ dung môi MW 1/1. Từ phân đoạn W3.1D (116mg) chạy sắc kí cột sephadex sử dụng hệ dung môi MW 1/1 thu được phân đoạn là W3.1D1 và W3.1D2. Từ phân đoạn W3.1D2 (35mg) sử dụng sắc kí bản mỏng hệ dung môi DMW 2/1/0.1 thu được hai hợp chất là BCW5 (7mg) và BCW6 (5mg). Hợp chất BCW9 (5mg) thu được từ phân đoạn W3.1D1 (30mg) với hệ dung môi DMW 3/1/0.1. Tiến hành sắc kí cột pha thường với phân đoạn BCW3.2 (1.6g) sử dụng hệ dung môi DMW 5/1/0.1 thu được 3 phân đoạn W3.2A, W3.2B và W3.2C. Từ phân đoạn W3.2A (mg) tiếp tục chạy sắc kí cột sephadex với hệ dung môi rửa giải MW 1/1 thu được 3 phân đoạn W3.2A1, W3.2A2 và W3.2A3. Hợp chất BCW2 (7mg) và hợp chất BCW4 (5mg) thu được từ phân đoạn W3.2A2 (56mg) bằng cách sử dụng sắc kí cột với hạt silica gel thường hệ dung môi EMW 20/1/0.2 . Từ phân đoạn W3.2C (400mg) chạy sắc kí cột sephadex với hệ dung môi MW 1/1 thu được 2 phân đoạn W3.2C1 và W3.2C2. từ phân đoạn W3.2C1 (100mg) chạy sắc kí cột YMC RP18 hệ dung môi MW 1/4 thu được hợp chất BCW3 (15mg).

32



3.3. CẤU TRÚC CÁC HỢP CHẤT PHÂN LẬP 3.3.1. Hợp chất BCW1

Hình 6. phổ 1H-NMR của BCW1 Hợp chất BCW1 phân lập được từ phân đoạn dịch chiết nước của cây bần chua, có dạng dầu, không màu. Phổ 1H NMR xuất hiện tín hiệu cộng hưởng của 4 nhóm methyl, trong đó có 3 nhóm methyl bậc ba tại δH 1.02 (3H, s), 1.05 (3H, s), 1.95 (3H, s) và một nhóm methyl bậc hai tại δH1.31 dưới dạng tín hiệu doublet (J = 6.5 Hz). Vùng trường yếu có tín hiệu của 2 proton olefin tại tại δH 5.67 (1H, dd, 9.0, 15.5 Hz), 5.79 (1H, dd, 6.5, 15.5 Hz) thuộc một liên kết π cấu hình trans và một liên kết π khác thế ba lần với tín hiệu cộng hưởng tại δH 5.90 (1H, s). Ngoài ra trên phổ này còn có các tín hiệu của 1 nhóm CH2 tại δH 2.07 (1H, d, 17.0)/2.45 (1H, d, 17.0), một nhóm oximethine tại δH 4.42 (1H, t, 6.5 Hz) và 1 proton anome thuộc 1 gốc đường glucose cấu hình β cho tín hiệu doublet tại δH 4.38 với hằng số tương tác J = 7.5 Hz. Những tín hiệu nhận dạng trên phổ này gợi ý cho thấy đây có thể là một hợp chất megastigman glycoside 1 đơn vị đường.

33



Phổ 13C NMR của hợp chất này xuất hiện tín hiệu của 19 carbon, kết hợp với việc phân tích phổ cộng hưởng từ 2 chiều HSQC cho phép nhận dạng các tín hiệu gồm 1 nhóm carbonyl δC 201.97, 1 liên kết π dạng -CH=C< với δC 126.12/165.97, một liên kết π nữa dạng -CH=CH- với δC 128.79/138.19, một nhóm oximethine δC 76.94, một nhóm CH2 δC 48.48, hai carbon bậc bốn δC 37.08, δC 56.73, bốn nhóm methyl δC 21.03, δC 27.55, δC 28.05, δC 23.74 và 6 tín hiệu của gốc đường glucose tại δC 102.42, δC 75.22, δC 78.06, δC 71.48, δC 77.92, δC 62.67.

Hình 7. phổ 13C-NMR của BCW1

34



Hình 8. phổ HSQC của BCW1

Hình 9. cấu trúc của BCW1 Bảng 10. dữ liệu phổ NMR của hợp chất BCW1 Vị trí 1

#δ a[5] C

37.1

δCa,b 37.08

2

nd

48.48

3 4 5 6 7 8 9 10 11

202.0 126.2 165.8 56.8 128.8 138.3 77.0 21.0 27.6

201.97 126.12 165.79 56.73 128.79 138.19 76.94 21.03 27.55

δHa,c (J = Hz) 2.07 (1H, d, 17.0) 2.45 (1H, d, 17.0) 5.90 (1H, s) 2.69 (1H, d, 9.0) 5.67 (1H, dd, 9.0, 15.5) 5.79 (1H, dd, 6.5, 15.5) 4.42 (1H, t, 6.5) 1.31 (3H, d, 6.5) 1.02 (3H, s)

HMBC 1, 3, 11, 12 2, 6, 13 4, 5, 7, 8 5, 6, 8, 9 6, 9, 10 7, 8, 10, 1' 9 1, 2, 6, 12 35


12 13 1' 2' 3' 4' 5'

28.1 23.8 102.5 75.3 78.1 71.6 78.0

6'

62.7 #


28.05 23.74 102.42 75.22 78.06 71.48 77.92

1.05 (3H, s) 1.95 (3H, br s) 4.38 (1H, d, 7.5) 3.20 (1H, t, 8.2) 3.36 (1H, t, 8.7) 3.32 (1H, m) 3.24 (1H, m) 3.68 (1H, dd, 5.5, 12.0) 62.67 3.84 (1H, dd, 2.5, 12.0) a đo trong CD3OD, b 125MHz, c 500MHz

1, 2, 6, 11 4, 5, 6 9

δC .Số liệu phổ theo chất (6R, 9R)-3-oxo-α-ionol-β-D-glucopyranoside, tài liệu số [5]

Với những tín hiệu nhận biết nói trên, BCW1 được xác định là một hợp chất megastigman glycoside. So sánh với dữ liệu phổ trong các tài liệu đã công bố [5], hợp chất này được nhận dạng là (6R, 9R)-3-oxo-α-ionol β-D-glucopyranoside, với công thức phân tử là C19H30O7. Kết luận này còn được khẳng định thêm bằng các tương tác xa trên phổ cộng hưởng từ hạt nhân 2 chiều HMBC (hình 9). Các tương tác giữa H-11 và H-12 với C-1, C-2, C-6 và tương tác giữa H-11 với C-12, giữa H-12 với C11 cho thấy 2 nhóm methyl này liên kết vào vị trí C-1. Tương tác giữa H-13 với C-4, C-5, C-6 chỉ ra nhóm methyl này gắn với C-5. Nhánh bên isobutenyl được xác định liên kết vào vị trí C-6 bởi các tương tác giữa H-7 với C-5, C-6, C-8, C-9, giữa H-8 với C-6, C-9, C-10, giữa H-9 với C-7, C-8, C-10, giữa H-10 với C-8, C-9. Cuối cùng, gốc đường glucose gắn vào vị trí C-9 với các tương tác giữa H-1’’ với C-9 và H-9 với C-1’’.

Hình 10. một số tương tác HMBC quan trọng của BCW1

36



Hình 11. phổ HMBC của BCW1 3.2.2. Hợp chất BCW2 Hợp chất BCW2 phân lập được từ phân đoạn dịch chiết nước của mẫu cây bần chua, có dạng tinh thể màu trắng, điểm chảy 1610C. Phổ 1H-NMR của BCW2 có dạng một phenyl glycoside. Trên vùng trường yếu có tín hiệu của 2 proton thơm ở vị trí meta với nhau trên 1 vòng thơm 4 lần thế, cộng hưởng tại 6.14 (1H, d, 2.0) và 6.21 (1H, d, 2.0). Vùng trường mạnh có các tín hiệu của một nhóm methoxy tại 3.86 (3H, s) và một nhóm methyl tại 2.55 (3H, s) cho thấy sự có mặt của 1 nhóm acetyl trong phân tử. Ngoài ra trong phân tử này còn 1 gốc đường glucose cấu hình β với proton anome cộng hưởng tại 4.98 (1H, d, 7.5) và các proton đường trong vùng từ 3.14 – 3.69 ppm.

37



Hình 12. phổ 1H-NMR của BCW2

Hình 13. phổ 13C-NMR của BCW2 38



Phổ 13C-NMR cho tín hiệu của 15 carbon, trong đó có 1 nhóm carbonyl tại 203.36 ppm, 6 carbon thơm trong khoảng từ 92 – 165 ppm, 1 nhóm methyl bâc ba tại 33.14 ppm, một nhóm methoxy tại 56.42 ppm, một carbon anome điển hình tại 99.98 ppm và các carbon đường trong khoảng từ 61 – 78 ppm.


Hình 15. cấu trúc của BCW2

39



Phân tích chi tiết các tín hiệu trên phổ cộng hưởng từ hạt nhân 2 chiều HSQC cho thấy dữ liệu phổ của BCW2 (bảng 11) hoàn toàn phù hợp với hợp chất annphenone hay 4-Acetyl-3-hydroxy-5-methoxyphenyl β-D-glucopyranoside[4], một phenylglycoside phân lập từ loài artemisia annua năm 1997 với công thức phân tử C15H20O9. Bảng 11. dữ liệu phổ NMR của hợp chất BCW2 TT 1

#δ a,b[4] C

106.78

δCc,d 106.76

2

163.55

165.67

3 4 5 6 7 8 6-OMe 1’ 2’ 3’ 4’ 5’

96.06 164.63 92.12 163.28 205.72 32.33 55.61 99.18 72.75 76.35 69.44 75.54

96.54 164.04 92.33 163.00 203.36 33.14 56.42 99.98 73.45 76.91 70.10 77.66

6’

60.59

61.05

a

δHc,e (J = Hz)

HMBC (H → C)

6.14 (1H, d, 2.0)

1; 2; 4; 5

6.21 (1H, d, 2.0)

1; 3; 4; 6

2.55 (3H, s) 3.86 (3H, s) 4.98 (1H, d, 7.5) 3.24 (1H, t, 8.5) 3.29 (1H, t, 8.8) 3.14 (1H, t, 9.0) 3.40 (1H, m) 3.45 (1H, dd, 6.0; 11.5) 3.69 (1H, br d, 11.5)

1; 7 6 4 1’; 3’ 2’; 4’ 6’; 5’ 1’; 3’; 6’ 5’

Đo trong D2O; b100 MHz; c Đo trong DMSO-d6, d 125 MHz, e 500 MHz.

Trật tự các vị trí và các nhóm thế trong phân tử BCW2 cũng được xác nhận trên phổ HMBC (bảng 11và hình 13). Các tương tác xa giữa proton 6-OMe với C-6, giữa H-8 với C-1 và C-7 cho thấy nhóm methoxy liên kết vào C-6 và nhóm acetyl gắn vào C-1. Tương tự tương tác giữa H-1’ với C-4 khẳng định gốc đường glucose liên kết với C-4.

40




Hình 17. phổ HMBC của BCW2 3.2.3. Hợp chất BCW3 Hợp chất BCW3 phân lập được từ phân đoạn dịch chiết nước của mẫu cây Bần chua, có dạng bột vô định hình màu vàng. Phổ 1H-NMR của hợp chất này ở vùng trường yếu có các tín hiệu hệ ABX của 3 proton thơm thuộc một vòng benzen A cộng hưởng tại 6.81 (1H, d, 2.0); 6.76 (1H, d, 8.0); 6.65 (1H, dd, 2.0; 8.0) và 2 proton thơm

41



khác thuộc một vòng benzen B thế 4 lần xuất hiện tại 6.66 (1H, s) và 6.20 (1H, s). Sự có mặt của một gốc đường cấu hình β trong phân tử cũng được xác nhận với tín hiệu của 1 proton anome tại 4.14 (1H, d, 8.0). Ngoài ra phổ này còn cho tín hiệu của 2 nhóm methoxy cộng hưởng tại 3.81 (3H, s); 3.82 (3H, s), 3 nhóm methine tại 4.08 (1H, m), 2.10 (1H, m); 1.88 (1H, m), 2 nhóm oxymethylene tại 3,74 (2H, dd, 6,0; 11,0), 3,23 (1H, m) – 4,07 (1H, m), và 1 nhóm metilen tại 2.83 (1H, m) ppm.



42



Phổ 13C-NMR của hợp chất này có mặt 26 carbon, trong đó có 12 carbon thơm trong vùng từ 112 – 149 ppm, 2 nhóm methoxy tại 56.40; 56.49 ppm, 2 nhóm oximetilen tại 65.23, 69.56 ppm, ba nhóm metin tại 47.9; 45.9; 39.57 ppm, 1 nhóm metinlen tại 33.85 ppm, 1 carbon anome tại 105.18 và 5 carbon gắn oxi của đường trong vùng từ 62 – 78 ppm.


43




Hình 22. phổ HMBC của BCW3

44



Với những tín hiệu thu được từ các phổ 1 chiều nói trên, hợp chất này được nhận định là một lignan glycoside. Độ chuyển dịch hóa học của từng proton đã được gán với các carbon tương ứng nhờ phổ cộng hưởng từ hạt nhân 2 chiều HSQC (bảng 12). Trên phổ HMBC tương tác giữa các nhóm methoxy 7-OMe với C-7, 3’-OMe với C-3’ khẳng định vị trí các nhóm thế này trên các vòng thơm. Trật tự vị trí các nhánh propyl của lignan này cũng được xác định nhờ các tương tác xa giữa H-1 với C-2, C3, C-2a, C8, C-9, C-10 và giữa H-4 với C-5, C-9, C-10, C-3, C-3a, C1’, C-2’, C-6’. Vị trí của gốc đường glucose cũng được xác định nhờ các tương tác của proton anome H-1’’ với C-3a và H-3a với C-1’’. Từ những dấu hiệu nhận dạng nêu trên cùng với sự phù hợp hoàn toàn về dữ liệu phổ NMR của BCW3 với các số liệu đã được công bố [22] cho phép khẳng định cấu trúc hóa học của hợp chất này là (+)-isolariciresinol3a-O-β-glucopyranoside, với công thức phân tử là C26H34O11.

Hình 23. một số tương tác HMBC quan trọng của BCW3 Bảng 12. dữ liệu phổ NMR của hợp chất BCW3 Vị trí

#δ a C

δCa,b

δHa,c (J= Hz)

HMBC

1

33.9

33,85

2,83 (2H, m)

2, 3, 2a, 8, 9, 10

2

39.5

39,57

2,10 (1H, m)

2a

65.2

65,23

3,74 (2H, dd, 6,0; 11,0)

1

3

45.9

45,9

1,88 (1H, m)

1, 2, 4, 1’

3a

69.5

69,56

3,23* (1H) – 4,07* (1H)

1’’, 2, 3,

4

47.3

47,90

4,08* (1H)

3, 3a, 5, 9, 10, 1’ 2', 6'

5

117.4

117,38

6,20 (1H, s)

4, 6, 7, 9

6

145.8

145,14

-

45



7

147.1

147,13

-

8

112.4

112,43

6,66 (1H, s)

9

129.1

129,48

-

10

134.4

134,39

-

1'

138.7

138,64

-

2'

114.3

114,36

6,81 (1H, d, 2,0)

3'

148.9

148,90

-

4'

145.1

145,84

-

5'

116.1

116,09

6,76 (1H, d, 8,0)

1', 3'

6'

123.1

123,13

6,65 (1H, dd, 2,0; 8,0)

2', 4'

1''

105.2

105,18

4,14 (1H, d, 8,0)

3a, 3'', 5''

2''

75.0

75,19

3,21* (1H,)

4''

3''

77.9

77,85

3,20* (1H)

5''

4''

71.4

71,67

3,28* (1H)

6''

5''

78.2

78,13

3,34 (1H, m)

3''

6''

62.5

62,77

3,63* (1H) – 3,83 (1H)

4''

7-OMe

56.4

56,40

3,81 (3H, s)

7

3'-OMe

56.5

56,49

3,82 (3H, s)

3'

a

10, 6, 7, 1

4', 6'

đo trong CD3 OD, b 125MHz, c 500MHz

# Số liệu phổ của (+)-Isolariciresinol 3a-O-β-D-glucopyranoside tài liệu [22], * tín hiệu bị chồng lấp

46



3.3.4. Hợp chất BCW4

Hình 24. phổ 1H-NMR của BCW4 Hợp chất BCW4 phân lập được từ phân đoạn dịch chiết nước của mẫu cây Bần chua, có dạng dầu màu vàng. Tương tự hợp chất BCW3, các phổ NMR của hợp chất này cũng có dạng một lignan glycoside. Phổ 1H-NMR có các tín hiệu cộng hưởng của 2 hệ vòng thơm dạng ABX tại δ 6.96 (2H, d, 2.0), 6.79 (2H, d, 8.0), 6.93 (2H, dd, 8.0; 2.0) và δ 7.04 (2H, d, 2.0), 7.16 (2H, d, 8.5), 6.83 (2H, dd, 8.5; 2.0). Tín hiệu của một gốc đường cấu hình β với proton anome xuất hiện tại δ 4.89 (1H, overlap), và 2 nhóm oximethyl thế trên vòng thơm cho các tín hiệu singlet tại δ 3.87 (3H, s), 3.89 (3H, s). Ngoài ra ở vùng trường mạnh còn có các tín hiệu của hai nhóm oximetilen tại 3.89 (1H, overlap), 4.25 (1H, m), hai nhóm metin tại 3.15 (1H, m) và hai nhóm oxymetin tại 4.73 (1H, d, 4.0), 4.77 (1H, d, 4.0).

47




Hình 26. phổ 13C-NMR của BCW4 Phổ 13C-NMR cho tín hiệu của 26 carbon, trong đó có 12 carbon lai hóa sp2 trong khoảng từ 111 – 151 ppm thuộc vào 2 vòng thơm, hai nhóm methoxxy tại 56.44, 56.78 ppm, hai nhóm oxymetilen tại 72.68; 72.71 ppm, hai nhóm metin nội vòng tại 55.35; 55.54 ppm, hai nhóm oximetin tại 87.07; 87.49 ppm, một carbon anome tại 102.89 và 5 carbon liên kết với oxi thuộc gốc đường glucose trong khoảng từ 62 – 78 ppm. 48



Hình 27. phổ HSQC của BCW4 Độ chuyển dịch hóa học của từng cặp carbon với proton tương ứng đã được xác định bằng phổ cộng hưởng từ hạt nhân 2 chiều HSQC và được trình bày trong bảng 13. Trật tự các vị trí trên các vòng thơm, trên các nhánh propyl cũng như vị trí gốc đường glucose của hợp chất lignan glycoside này được xác định nhờ các tương tác xa trên phổ HMBC (bảng 13 và hình 21). Hơn nữa, việc so sánh dữ liệu phổ của BCW4 với các lignan glycoside đã công bố [11] cho phép khẳng định hợp chất này là Pinoresinol-4-O--D-glucoside, với công thức phân tử là C26H32O11.

49



Hình 28. một số tương tác HMBC quan trọng của BCW4 Bảng 13. dữ liệu phổ NMR của hợp chất BCW4 δHa,c (J= Hz) HMBC 54.1 3,15 (1H, m) 85.6 4,77 (1H, d, 4,0) 1, 4, 5, 8 71.7 3,89* (1H) - 4,25* (1H) 1, 5, 2, 6 54.2 3,15 (1H, m) 85.9 4,73 (1H, d, 4,0) 1, 5, 8, 4 71.7 3,89* (1H) - 4,25* (1H) 1, 5, 2, 6 133.1 111.1 6,96 (1H, d, 2,0) 2, 3', 4', 6' 146.2 148.2 115.8 6,79 (1H, d, 8,0) 1', 3', 6' 119.2 6,93 (1H, dd, 2,0; 8,0) 2, 2', 4' 136.1 111.2 7,04 (1H, d, 2,0) 6, 1'', 4'', 6” 146.2 149.5 116.0 7,16 (1H, d, 8,5) 1'', 3'', 4'' 119.5 6,83 (1H, dd, 2,0; 8,5) 6, 2'', 4'' 100.8 4,90 (1H, d, 7,5) 3' 73.7 3,51* (1H) 1'', 3'' 76.8 3,49* (1H) 2'', 4'' 70.3 3,43* (1H) 5'' 77.2 3,42* (1H) 4'' 3,70 (1H, dd, 5,0; 12,0) 6''' 61.3 62,52 4'' 3,89* (1H) 3'-OCH3 56.4 56,44 3,89 (3H, s) 3' 3''-OCH3 56.4 56,78 3,87 (3H, s) 3'' a đo trong CD3OD, b 125MHz, c 500MHz, d đo trong DMSO-d6. # Số liệu phổ của TT 1 2 4 5 6 8 1' 2' 3' 4' 5' 6' 1'' 2'' 3'' 4'' 5'' 6'' 1''' 2''' 3''' 4''' 5'''

#δ d C

δCa,b 55,35 87,07 72,68 55,54 87,49 72,71 133,78 111,01 147,34 149,13 116,10 119,79 137,50 111,68 147,50 151,01 118,08 120,06 102,89 74,92 77,86 71,35 78,21

pinoresinol-4-O--D-glucoside theo tài liệu [11], * tín hiệu bị chồng lấp

50



Hình 29. phổ HMBC của BCW4

51



3.3.5. Hợp chất BCW7

Hình 30. phổ 1H-NMR của BCW7 Hợp chất BCW7 phân lập được từ phân đoạn dịch chiết nước của mẫu cây Bần chua, có dạng bột vô định hình màu vàng. Phổ 1H-NMR của hợp chất này có tín hiệu của 1 cặp proton thơm tại δ 6.44 (1H, d, J = 2.0 Hz), 6.86 (1H, J = 2.0 Hz) thuộc một vòng benzen thế bốn vị trí 1, 3, 4, ,5 và tín hiệu singlet của 1 proton olefin tại δ 6.96 (1H, s) của một liên kết π thế 3 lần. Cũng ở vùng trường yếu còn ghi nhận sự có mặt của 1 hệ vòng thơm ABX với các tín hiệu cộng hưởng tại δ 7.58 (1H, d, J = 2.0 Hz), 6.93 (1H, d, J = 8.0 Hz), 7.59 (1H, dd, J = 2.0 Hz; J = 8.0 Hz). Ngoài ra trong phân tử còn 1 nhóm methoxi thế vào vòng thơm với tín hiệu tại δ 3.89 (3H, s) và một gốc đường cấu hình β với tín hiệu proton anome đặc trưng tại δ 5.06 (1H, d, J = 7.5 Hz).

52




Hình 33. phổ 13C-NMR của BCW7 Phổ

13

C-NMR của BCW7 xuất hiện tín hiệu của 22 carbon, trong đó có 1

nhóm carbonyl tại δ 181.99, 14 carbon lai hóa sp2 trong vùng từ δ 94-164, một nhóm methoxi tại δ 55.94 và 6 tín hiệu đặc trưng của 1 cấu tử đường glucose δ 100.00, δ 73.10, δ 76.43, δ 69.58, δ 77.23, δ 60.60.

53



Hình 34. phổ HSQC của BCW7 Bảng 14. dữ liệu phổ NMR của hợp chất δHa,c (J = Hz)

HMBC

164.2

δCa,b 164.18

3

103.5

103.30

6.96 (1H, s)

4; 2; 1’; 10

4 5 6 7 8 9 10 1’ 2’ 3’ 4’ 5’ 6’ 3’-OMe 1’’

182.1 161.2 99.3 162.7 94.8 156.9 105.3 121.2 110.3 148.1 151.0 115.8 120.5 56.0 97.5

181.99 161.07 99.47 162.93 94.99 156.89 105.31 121.17 110.29 148.10 151.05 115.82 120.54 55.94 100.00

6.44 (1H, d, 2.0)

5; 7; 10; 8

6.86 (1H, d, 2.0)

7; 9; 10; 6

7.58 (1H, br s)

3’; 6’; 4’; 2

6.93 (1H, d, 8.0) 7.59 (1H, dd, 2.0; 8.0) 3.89 (3H, s) 5.06 (1H, d, 7.5)

4’; 3’; 1’ 2’; 4’; 2 3’ 7

TT 2

#δ a C

54


2’’ 3’’ 4’’ 5’’

a


3.29 (1H, dd, 7.5; 9.0) 1’’; 3’’ 3.31 (1H, m) 4’’; 2’’ 3.17 (1H, t, 8.8) 5’’; 6’’ 3.44 (1H, m) 3’’; 6’’; 1’’ 3.47 (1H, dd, 6.0; 12.0) 6’’ 60.4 60.60 4’’; 5’’ 3.72 (1H, d, 11.5) đo trong DMSO-d6, b 125MHz, c 500MHz, # Số liệu phổ của chrysoeriol 780.1 76.1 69.9 76.7

73.10 76.43 69.58 77.23

glucopyranoside theo tài liệu [52].

Hình 35. phổ HMBC của BCW7 Từ những dấu hiệu nhận dạng trên, kết hợp với phân tích phổ cộng hưởng từ 2 chiều HSQC, hợp chất này được xác định là 1 flavone glycoside. So sánh với dữ liệu phổ trong các tài liệu đã công bố cho thấy các số liệu phổ NMR của BCW7 hoàn toàn phù hợp với Chrysoeriol 7-glucopyranoside[52]. Cấu trúc này cũng được làm sáng tỏ nhờ các tương tác xa trên phổ HMBC (hình 25). Trên phổ này các tương tác giữa H-3 với C-1’, giữa H-2’ và H-6’ với C-2 cho thấy vòng thơm C liên kết với vị trí C-2. Gốc đường glucose gắn vào C-7 với tương tác giữa H-1’’ với C-7. Tương tác giữa proton 3’-OMe với C-3’ khẳng định vị trí của nhóm thế oximethyl.

55



Hình 36. một số tương tác HMBC quan trọng của BCW7 3.3.6. Hợp chất BCW5



56



Hợp chất BCW5 phân lập được từ phân đoạn dịch chiết nước của mẫu cây Bần chua, có dạng bột vô định hình màu vàng. Cấu trúc của BCW5 hoàn toàn tương tự với BCW7 ngoại trừ sự xuất hiện thêm 1 gốc đường rhamnose liên kết với vị trí C-6’’ của đường glucose và nhóm hydroxy thế tại vị trí C-3’ thay vì nhóm methoxi ở BCW7. Phổ 13C-NMR của hợp chất này cho tín hiệu cộng hưởng của 27 carbon, trong đó có 1 nhóm carbonyl tại δ 181.74 ppm, 14 carbon lai hóa sp 2 trong vùng từ δ 94164 thuộc khung flavone, 6 carbon của cấu tử đường glucose tại δ 99.94 (carbon anome), δ 73.11, δ 76.27, δ 69.58, δ 75.57, δ 66.08, và 6 carbon của gốc đường rhamnose tại δ 100.54 (carbon anome), δ 70.76, δ 70.30, δ 72.09, δ 68.33, δ 17.83.

Hình 39. phổ 1H-NMR của BCW5 So với hợp chất BCW7, phổ 1H-NMR của BCW5 xuất hiện thêm 1 pronton anome tại δ 4.54 (1H, d, 1.0) và tín hiệu doublet của 1 nhóm methyl tại δ 1.07 (3H, d, 6.0) đặc trưng cho 1 gốc đường rhamnose. Ngoài ra phổ này cũng không xuất hiện tín hiệu của nhóm methoxy trong vùng δ 3.80-3.90. Với phổ cộng hưởng từ hạt nhân 2 chiều HMBC các tương tác xa giữa proton anome của đường rhamnose H-1’’’ với

57



C-6’’, giữa H-6’’ với C-1’’’, giữa H-1’’ với C-7 đã khẳng định trật tự liên kết của chuỗi đường trong phân tử. Từ những kết quả phân tích phổ NMR nêu trên, kết hợp với sự phù hợp hoàn toàn số liệu phổ NMR của BCW5 với các tài liệu đã công bố [1], hợp chất này được xác định là luteolin 7-rutinoside.

Hình 40. phổ HSQC của BCW5 Bảng 15. dữ liệu phổ NMR của hợp chất BCW5 TT 2

#δ a C

3

163.5 103.6

4 5 6 7 8 9 10 1’ 2’ 3’ 4’

182.6 161.6 100.2 165.2 95.6 157.6 106.0 121.7 113.8 146.4 150.9

δCa,b 164.88

δHa,c (J = Hz)

HMBC

102.28

6.70 (1H, s)

10; 1’; 2; 4

6.43 (1H, d, 2.0)

8; 10; 7; 5

6.73 (1H, d, 2.0)

6; 10; 9; 7

7.38 (1H, d, 2.0)

6’; 3’; 4’; 2

181.74 161.22 99.46 162.81 94.70 156.89 105.34 120.01 112.89 146.54 151.48

58


5’ 6’ 1’’ 2’’ 3’’ 4’’ 5’’


6.85 (1H, d, 8.0) 1’; 3’ 7.41 (1H, dd, 2.0; 8.0) 2’; 4’; 2 5.06 (1H, d, 7.5) 7 3.27 (1H, dd, 7.5; 9.0) 1’’; 3’’ 3.31 (1H, t, 9.0) 2’’; 3.36 (1H, m) 3.60 (1H, m) 3.61 (1H, m) 6’’ 66.08 1’’’ 3.85 (1H, d, 10.0) 1’’’ 100.4 100.54 4.54 (1H, d, 1.0) 6’’; 2’’’; 3’’’; 5’’’ 2’’’ 71.3 70.76 3.47 (1H, m) 4’’’ 3’’’ 70.8 70.30 3.67 (1H, m) 4’’’ 4’’’ 72.7 72.09 3.16 (1H, m) 2’’’; 3’’’; 6’’’ 5’’’ 68.9 68.33 3.42 (1H, m) 6’’’ 18.9 17.83 1.07 (3H, d, 6.0) 5’’; 4’’ a đo trong DMSO-d6, b 125MHz, c 500MHz, # Số liệu phổ của luteolin 7-rutinoside 116.7 120.0 101.1 73.6 77.6 70.2 76.8 66.06

115.86 119.21 99.94 73.11 76.27 69.58 75.57

theo [1].


59



Hình 42. phổ HMBC của BCW5 3.3.7. Hợp chất BCW6

Hình 43. cấu trúc của BCW6 Hợp chất BCW6 phân lập được từ phân đoạn dịch chiết nước của mẫu cây Bần chua, có dạng bột vô định hình màu vàng. Cấu trúc của BCW6 hoàn toàn tương tự với BCW5 ngoại trừ sự biến mất của nhóm thế hydroxy tại vị trí C-3’. Phổ 13CNMR của hợp chất này cũng có 27 carbon, trong đó có 15 carbon trong vùng từ 94181 ppm thuộc khung flavone và 12 carbon còn lại thuộc chuỗi đường rutinoside. So với hợp chất BCW5, phổ 1H-NMR của BCW6 có nhiều hơn 1 proton thơm, cụ thể

60



vùng trường yếu xuất hiện tín hiệu của 2 cặp proton thơm tại δ 7.88 (1H, d, 8.0, H-2', 6') và δ 6.84 (1H, d, 8.0, H-3', 5').Từ những đặc điểm nhận dạng nêu trên, kết hợp với

các tài liệu thu được, hợp chất này đã được xác định là apigenin 7-O-rutinoside[59] với công thức phân tử là C27H30O14.


61





62



Hình 46. phổ HMBC của BCW6 Bảng 16. dữ liệu phổ NMR của hợp chất BCW6 TT 2 3 4 5 6 7 8 9 10 1' 2', 6' 3', 5' 4' 1'' 2'' 3'' 4'' 5''

#δ a C

164.4 103.0 181.8 161.2 99.6 162.6 94.8 157.0 105.6 121.2 128.4 116.1 161.2 100.0 73.8 76.5 69.9 76.0

δCa,b 164.73 102.01 181.65 161.37 99.42 162.69 94.58 156.86 105.34 118.80 128.60 116.76 164.20 99.90 73.08 76.28 69.56 75.60

6''

66.3

66.06

1'''

100.4

100.5

δHa,c (J = Hz) 6.76 (1H, s) 6.42 (1H, d, 2.0) 6.73 (1H, d, 2.0) 7.88 (1H, d, 8.0) 6.84 (1H, d, 8.0) 5.05 (1H, d, 7.5) 3.27 (1H, dd, 7.5, 9.0) 3.31 (1H, t, 9.0) 3.17 (1H, m) 3.59 (1H, m) 3.46 (m) 3.85 (m) 4.54 (1H, br s)

HMBC 2, 4, 10, 1'

5, 7, 8, 10 6, 7, 9, 10

2', 4’, 6' 1’, 3', 5' 7 1'', 3'' 2'', 4'' 5'', 6'' 4'', 6'' 1''' 6''

63



2''' 71.0 70.72 3.46 (1H, m) 1''', 4''' 3''' 70.5 70.29 3.66 (1H, m) 2''', 4''' 4''' 72.3 72.06 3.15 (1H, m) 2''', 5''', 6''' 5''' 68.5 68.29 3.42 (1H, m) 4''' 6''' 17.9 17.77 1.07 (3H, d, 6.0) 4''', 5''' a b c # đo trong DMSO-d6, 125MHz, 500MHz, Số liệu phổ của apigenin -Orutinoside theo [59]

Hình 47. một số tương tác HMBC quan trọng của BCW6 3.3.8. Hợp chất BCW9


64



Hình 49. phổ 1H-NMR của BCW9 Hợp chất BCW9 tách được từ phân đoạn dịch chiết nước của mẫu cây Bần chua, có dạng bột vô định hình màu vàng. Các phổ NMR của hợp chất này có dạng một flavanone glycoside, trong đó phần chuỗi đường là rutinoside giống với các hợp chất BCW5 và BCW6. Phổ 1H-NMR của BCW9 có các tín hiệu proton thơm của hệ spin AB tại δ 6.13 (1H, d, 2.0), δ 6.11 (1H, d, 2.0) và một hệ ABX thuộc vòng thơm khác cộng hưởng tại δ 6.93 (1H, d, 2.0), δ 6.94 (1H, d, 8.0), δ 6.90 (1H, dd, 2.0; 8.0). Vùng trường mạnh hơn có hệ spin AMX tại δ 5.50 (1H, dd, 2.5; 12.0) và δ 2.77 (1H, dd, 2.5; 17.0), δ 3.27 (1H, dd, 12.0; 17.0) đặc trưng cho một hợp chất flavanone. Ngoài ra trên phổ này còn quan sát được tín hiệu của một nhóm methoxy tại δ 3.77 (3H, s), các proton anome đặc trưng cho 1 gốc đường glucose cấu hình β tại δ 4.96 (1H, d, 7.5), và 1 gốc đường rhamnose cấu hình α tại δ 4.52 (1H, br s), cùng với tín hiệu doublet của một nhóm methyl bậc hai tại δ 1.08 (3H, d, 6.0). Phổ 13C-NMR có tín hiệu của 28 carbon, trong đó có 1 nhóm carbonyl tại δ 197.05, một nhóm oximethine tại δ 78.41, một nhóm methylene tại δ 42.07, một nhóm 65



methoxy tại δ 55.74, mười hai carbon lai hóa sp2 thuộc khung flavanone trong vùng từ δ 95-165 và mười hai carbon thuộc chuỗi đường rutinoside.


66



Hình 51. phổ HSQC của BCW9 Bảng 17. dữ liệu phổ NMR của hợp chất BCW9 TT 2 3 4 5 6 7 8 9 10 1’ 2’ 3’ 4’ 5’ 6’ 4’-OMe 1’’ 2’’

#δ a C

78.4 42.1 196.6 162.9 96.4 165.0 95.6 162.4 103.3 129.3 114.2 145.0 145.6 115.4 117.8 55.8 100.5 73.0

δCa,b 78.41 42.07 197.05 163.07 96.43 165.18 95.61 162.53 103.37 130.93 114.17 146.49 148.02 112.10 118.02 55.74 99.51 73.03

δHa,c (J = Hz) 5.50 (1H, dd, 2.5; 12.0) 2.77 (1H, dd, 2.5; 17.0) 3.27 (1H, dd, 12.0; 17.0)

HMBC

6.13 (1H, d, 2.0)

8; 10; 5; 7

6.11 (1H, d, 2.0)

6; 10; 9; 7

6.93 (1H, d, 2.0)

7 6’; 1’; 4’; 2

6.94 (1H, d, 8.0) 6.90 (1H, dd, 2.0; 8.0) 3.77 (3H, s) 4.96 (1H, d, 7.5) 3.23 (1H, m)

2; 4; 10

6’; 1’; 3’ 2’; 1’; 4’; 2 4’

67


3’’ 4’’ 5’’


3.54 (1H, m) 4’’; 1’’ 3.13 (1H, m) 3.28 (1H, m) 3.43 (1H, m) 6’’ 66.06 5’’ 3.80 1H, d, 11.5) 1’’’ 99.7 100.63 4.52 (1H, br s) 2’’’; 3’’’; 5’’’; 6’’ 2’’’ 70.2 70.31 3.63 (1H, m) 3’’’ 70.8 70.74 3.44 (1H, m) 4’’’ 72.1 72.12 3.15 (1H, m) 5’’’ 68.1 68.36 3.40 (1H, m) 6’’’ 17.5 17.85 1.08 (3H, d, 6.0) 5’’’; 4’’’ OH-5 12.00 (1H, s) 5; 6; 10 a đo trong DMSO-d6, b 125MHz, c 500MHz, # Số liệu phổ của eriodictyol-7-O75.6 69.7 76.3 66.1

75.57 69.65 76.30

rutinoside theo [24]

Hình 52. phổ HMBC của BCW9 Với các tương tác xa trên phổ HMBC giữa proton 4’-OMe với C-4’, giữa H1’’ với C-7 và giữa H-1’’’ với C-6’’ đã khẳng định vị trí nhóm thế methoxy và thứ tự liên kết của chuỗi đường rutinoside. Ngoài ra các tương tác giữa H-2’, H-6’ với C-2,

68



C-4’, giữa H-5’ với C-1’, C-3’, C-6’, giữa C-3 với C-2, C-4, C-10, giữa H-6 với C-5, C-7, C-8, C-10, giữa H-8 với C-6, C-7, C-9, C-10 đã khẳng định trật tự liên kết phần khung flavanone. So sánh với dữ liệu phổ của BCW9 với các dữ liệu phổ đã công bố [24] cho thấy hợp chất này chính là eriodictyol-7-O-rutnoside.


69



Cấu trúc hóa học các hợp chất phân lập được từ phân đoạn BCW3 của cây Bần chua.

(6R, 9R)-3-oxo-α-ionol-βD-glucopyranoside

Pinoresinol-4-O--Dglucoside

Apigenin 7-O-rutinoside

Annphenone

Chrysoeriol 7glucopyranoside

(+)isolariciresinol-3a-O-βglucopyranoside

Luteolin 7-rutinoside

Eriodictyol-7-O-rutinoside

70



3.4. KẾT QUẢ THỬ NGHIỆM HOẠT TÍNH KHÁNG VI SINH VẬT VÀ GÂY ĐỘC TẾ BÀO CỦA MỘT SỐ HỢP CHẤT CÂY BẦN CHUA 3.4.1. Kết quả thử nghiệm hoạt tính kháng vi sinh vật kiểm định của một số hợp chất cây Bần chua. Hoạt tính kháng vi sinh vật kiểm định được tiến hành theo phương pháp đã mô tả trong mục 2.4.1. Kết quả thử ngiệm hoạt tính kháng vi sinh vật kiểm định được chỉ ra trên bảng 18. Bảng 18. hoạt tính kháng vi sinh vật kiểm định của các chất

ST T

Nồng độ Ký hiệu mẫu mẫu (g/ml)

Vi khuẩn Gr(-) P. E. aerugino coli sa (-) (-)

Nồng độ ức chế tối thiểu (MIC. g/ml) Vi khuẩn Gr(+) Nấm mốc B. subtillis

S. aureus

A. niger

F. oxysporum

(-)

(-)

(-)

(-)

Nấm men S. C. cerevisia albicans e (-) (-)

Nhận xét

Âm tính

1

BCW1

50

2

BCW3

50

(-)

(-)

(-)

(-)

(-)

(-)

(-)

(-)

Âm tính

3

BCW4

50

(-)

(-)

(-)

(-)

(-)

50

(-)

(-)

Kháng 1VSVKĐ

4

BCW5

50

(-)

(-)

(-)

(-)

(-)

(-)

(-)

(-)

Âm tính

5

BCW6

50

(-)

(-)

(-)

(-)

(-)

(-)

(-)

(-)

Âm tính

Kết quả cho thấy. Có 1 mẫu BCW4 biểu hiện hoạt tính kháng nấm mốc F.oxysporum với giá trị MIC từ 25-50g/ml ở nồng độ mẫu thử là 50g/ml.

71

` Luận văn thạc sĩ sinh học khóa 16


3.4.2 Kết quả thử nghiệm hoạt tính gây độc tế bào của một số hợp chất phân lập từ cây Bần chua Một số hợp chất thu được của cây Bần chua được tiến hành thử nghiệm hoạt tính gây độc tế bào theo phương pháp được mô tả trong phần 2.4.2. Kết quả thử nghiệm được chỉ ra trong bảng 19. Bảng 19. kết quả thử nghiệm hoạt tính gây độc tế bào của các chất Nồng độ phần trăm ức chế sự phát triển của tế bào dòng KB (%) STT Tên mẫu IC50 (µg/ml) 128 32 8 2 0,5 µg/ml µg/ml µg/ml µg/ml µg/ml 1 17 12 0 0 0 >128 BCW1 2 9 0 0 0 0 >128 BCW3 3 30 13 0 0 0 >128 BCW4 4 22 11 0 0 0 >128 BCW5 5 0 0 0 0 0 >128 BCW6 Ellipcicine 0,31

STT

Tên mẫu

1 2 3 4 5

BCW1 BCW3 BCW4 BCW5 BCW6 Ellipcicine

Nồng độ phần trăm ức chế sự phát triển của tế bào dòng Lu (%) 128 32 8 2 0,5 µg/ml µg/ml µg/ml µg/ml µg/ml 0 0 0 0 0 27 0 0 0 0 14 0 0 0 0 11 0 0 0 0 8 0 0 0 0

IC50 (µg/ml) >128 >128 >128 >128 >128 0,45

Tuy nhiên kết quả thử nghiệm cho thấy không có hợp chất nào thể hiện hoạt tính gây độc tế bào.

72



KẾT LUẬN 1. Đã thu thập được mẫu cây Bần chua tại RNM Vườn Quốc gia Xuân Thủy.Mẫu thực vật và được TS. Nguyễn Thế Cường, Viện Sinh thái và Tài nguyên sinh vật, Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam giám định là Sonneratia caseolaris(L.) Engl. Đồng thời, xây dựng được quy trình xử lý mẫu và sơ đồ tách chiết các hợp chất từ loài Bần chua (Sonneratia caseolaris (L.) Engl.). 2. Phân lập và xác định được cấu trúc của 8 hợp chất từ phần dịch chiết phân đoạn nước từ loài Bần chua (Sonneratia caseolaris (L.) Engl.). 3. Lần đầu tiên phân lập được các hợp chất: (6R, 9R)-3-oxo-α-ionol-β-Dglucopyranoside, Annphenone hay 4-Acetyl-3-hydroxy-5-methoxyphenyl β-Dglucopyranoside, (+)isolariciresinol-3a-O-β-glucopyranoside, Pinoresinol-4-O--Dglucoside, Chrysoeriol 7-glucopyranoside, Luteolin 7-rutinoside, Apigenin 7-Orutinoside, Eriodictyol-7-O-rutinoside từ loài Bần chua. 4. Đã tiến hành thử hoạt tính kháng vi sinh vật và hoạt tính gây độc tế bào của 5 hợp chất phân lập được trên một số chủng vi sinh vật và trên 2 dòng tế bào ung thu biểu mô, ung thư phổi. Trong số đó có hợp chất BCW4 thể hiện hoạt tính kháng nấm mốc Fusarium oxysporum (M42) ở nồng độ mẫu thử là 50µg/ml và ở các nồng độ thử nghiệm chưa tìm thấy hoạt chất gây độc tế bào trên 2 dòng tế bào thử nghiệm.

73



Tài liệu tham khảo 1.

Ahmet Cakir, Ahmet Mavi, Cavit Kazaz, Ali Yildirim, O. Irfan Kufrevioglu (2006), Antioxidant Activities of the Extracts and Components of Teucrium orientale L. var. orientale, Turk. J. Chem. 30, 483-494.

2.

Aknin, M., T.L.A. Dayan, A. Rudi, Y. Kashman & E.M. Gaydou. (1999), Hydroquinone antioxidant from the Indian Ocean tunicate Aplidium savignyi. Journal of Agricultural Food Chemistry, 47. 4175— 4177.

3.

Anderson, J.W. and Kyleen Ward RD (1979), High-carbohydrate, high fiber diets for insulintreated men with diabetes mellitus. Am. J. Clin. Nutr.32.23122321.

4.

Anil K. Singh, Vibha Pathak, Pawan K. Agrawal (1997), Annphenone, a phenolic acetophenone from Artemisia annua, Phytochemistry 44, 555-557.

5.

Anni Pabst, Denis Barron, Etienne Semon, and Peter Schreier - Two diastereomeric 3-oxo-α-ionol-β-D-glucopyranoside from Raspberry fruit, Phytochemistry 31 (1992) 1649-1652.

6.

Arifuddin, Sukenda & D. Dana (2004). The Effect Hydroquinone Extracted from Sonneratia caseolaris Fruit to Control Vibrio harveyi Artificial Infection on Tiger Shrimp, Penaeus monodon Fab. Jurnal Akuakultur Indonesia, 3(1). 2935.

7.

Arifuddin, Sukenda & D. Dana (2004). The Effect of Hydroquinone Extracted from Sonneratia caseolaris Fruit on the Hemolymph of Tiger Prawn, Penaeus monodon Fab., Infected by Vibrio harveyi. Jurnal Akuakultur Indonesia, 3(1). 23-28.

8.

Ashok Kumar Tiwari, V. Viswanadh, Ponnapalli Mangala Gowri, Amtul Zehra Ali, S.V.S. Radhakrishnan, Sachin Bharat Agawane, K. Madhusudana, Janaswamy Madhusudana Rao (2010). Oleanolic acid - an α-Glucosidase inhibitory and antihyperglycemic active compound from the fruits of Sonneratia caseolaris. Open Access Journal of Medicinal and Aromatic Plants Vol. 1(1). 19-23.

74


9.


Bần, Viện Thông tin, Thư viện Y học Trung ương (Việt Nam).

10. Bandaranayake

WM

(1998)

Traditional

and

medicinal

use

of

mangroves. Mangroves Salt Marshes, 2.133–48. 11. Barbara Vermes, Otto Seligmann and Hildebbert Wagner (1991), Synthesis of Biologicalyy Active Tetrahydrofurofuranlignan-(syringin,pinoresinol)-Monoand bisglucosides, Phytochemistry 30, 3087-3089. 12. Bhowmik A., Khan L.A., Akhter M. and Rokeya B (2009). Studies on the antidiabetic effects of Mangifera indica stem-barks and leaves on nondiabetic type 1 and type 2 diabetic model rats. Bangladesh Journal of Pharmacology. 4, 110-114. 13. Bishwajit Bokshi, Md.Nazmul Hasan Zilani, Aparajita Malakar, Debendra Nath Roy, Jamil Ahmad Shilpi, Samir Kumar (2013). Study of analgesic and antidiarrhoeal activities of Sonneratia caseolaris (Linn.) leaf and stem using diferent solvent system. Indonesian Journal of Pharmacy / Majalah Farmasi Indonesia. Vol.24 No. 4 . 255 –260 ISSN-p . 2338-9427. 14. C.S.I.R. (Council of Scientific and Industrial Research) (1948-1976) The wealth of India. 11 vols. New Delhi. 15. Charoenteeraboon J, Wetwitayaklung P, Limmatvapirat C, Paechamud T (2007), Hepatoprotective activity from variousparts of Sonneratia caseolaris. Planta Medica 73, 561. 16. Đinh Thị Thuý Duy(2014). Nghiên cứu thành phần hoá học trong cao petroleum ether từ lá cây Bần chua (Sonnerratia caseolaris (L.) Engl.). Luận văn đại học Trường đại học Cần Thơ. 17. Duke, J.A. 1983. Sonneratia caseolaris (L.) Engl. Handbook of Energy Crops Unpublished. http.//www.hort.purdue.edu/newcrop/duke_energy/Sonneratia_caseolaris.html. diakses tanggal 21 April 2011. 18. Farjou I.B., Al-Ani M. and Guirgea S.Y (1987). Lowering of blood glucose of diabetic rats by Artemisia extract. J. Fac. Med. 92, 137-147.

75



19. Fengxian, Z and Liu Meifang. 1994. Studies on pectin from plants Sonneratia . Acta botanica Austro Sinica. 9.116-119. 20. Fresney R.I (1993). Culture of animal Cells; John Wiley & Sons Inc., New York. A manual of basis techniques, 3rd Edition. 21. Ghani A. 2nd ed. Dhaka. Asiatic Society of Bangladesh (2003). Medicinal plants of Bangladesh with chemical constituents and used. 22. Hans Achenbach, Matthias Lowel, Reiner Waibel, Mahabir Gupta, and Pablo Solis - New Lignan Glucoside from Stemmadenia minima, Planta Med. 58 (1992) 270-272. 23. Henschler, R., H.R. Glatt, CM. Heyworth. 1996. Hydroquinone stimulates granulocyte-macrophage progenitor cells in vitro and in vivo. Environmental Health Perspectives, 104 (Supplement 6). 24. Hoffmann Bg., Lunder Lt. - Flavonoids from Mentha piperita Leaves, Planta Med. 50 (1984) 361. 25. Hogg RW, Gillan FT (1984) Fatty acids, sterols and hydrocarbons inthe leaves fromeleven species of mangrove. Phytochemistry 23, 93–97. 26. Hou W., Li Y., Zhang Q., Wei X., Peng A.,Chen L. and Wei Y (2009). Triterpene

acids

isolated

from

Lagerstroemia

speciosa

leaves

as

alphaglucosidase inhibitors. Phytother. Res.23,614-618. 27. http.//www.hoahocngaynay.com/vi/tin-tuc-hoa-hoc/hoa-hoc-viet-nam/190than-hoat-tinh-tu-re-ban.html. 28. http.//www.hort.purdue.edu/newcrop/duke_energy/Sonneratia_caseolaris.html 29. https.//sites.google.com/site/raurungvietnam/rau-than-go-lon/cay-ban-chua. 30. Jiny Varghese K, Belzik N, Nisha A R,Resiya S, Resmi S, Silvipriya KS (2010). Pharmacognostical and phytochemical studies of a Mangrove (Sonneratia caseolaris) from Kochi of Kerala state in India. Jiny Varghese K et al. / Journal of Pharmacy Research. 3(11),2625-2627. 31. Jongjan Mahadlek, Thawatchai Phachamud, Chantana Wessapun (2012). Antimicrobial Studies of Sonneratia caseolaris Using Different Agar Diffusion

76



Method. Journal of Pharmaceutical, Biological and Chemical Sciences, ISSN. 0975-8585 2012 RJPBCS Volume 3 Issue 1

Page No. 404- 410.

32. Kathiresan, K., Salmo III, S.G., Fernando, E.S., Peras, J.R., Sukardjo, S., Miyagi, T., Ellison, J., Koedam, N.E., Wang, Y., Primavera, J., Jin Eong, O., Wan-Hong Yong, J. & Ngoc Nam, V (2010). Sonneratia caseolaris. 33. Lê Thanh Phước và Từ Minh Tỏ (2012). Góp phần khảo sát thành phần hóa học của vỏ rễ Bần (Sonneratia caseolaris L.). Tạp chí Khoa học 2012.21a 129-133. 34. Little ELJr (1983). Commonfuelwoodcrops. a handbook for their identification. McClain Printing Co. 35. M.N. Hasan, N.Sultana, M.S. Akhater, M.M. Billahand, K.K. Islamp (April 2013). Hypoglycemic effect of methanolic extract from fruits of Sonneratia caseolaris – a mangrove plant from Bagerhat Region, the Sundarbans, Bangladesh. Journal of Innovation & Development Strategy.1-6 . ISSN 19972571. 36. Manulu, R.D.E. (2011). Kadar beberapa vitamin pada buah Pedada (Sonneratia caseolaris) dan hasil olahannya Skripsi. Dep. Tekn. Hasil Perairan . FPIK-IPB. 37. McKane, L., and Kandel J. (1996), Microbiology, McGraw-Hill, INC.. 38. Md. Sariful I. Howlader, Shubhra K. Dey, Arpona Hira, Arif Ahmed (2012), Evaluation of antinociceptive and antioxydant properties of the ethanolic, Pelagia Research Library Der Pharmacia Sinica, 3 (5).536-541 39. Mihopoulos, N., C. Vagias, I. Chinou, C. Roussakis, M. Scoullos, C. Harvala & V. Roussis. (1999). Antibacterial and cytotoxic natural and synthesized hydroquinones from sponge Ircinia spinosula. Zeitschrift fiir Naturforschung, 54. 417-423. 40. Naiborhu, P.E., D. Dana & Sukenda (2002). Ekstraksi dan Manfaat Ekstrak Mangrove (Sonneratia alba dan Sonneratia caseolaris) sebagai Bahan Alami Anti Bakteria pada Patogen Udang Windu, V. Harveyi. Tesis, Program Studi Ilmu Perairan, Program Pascasarjana, Institut Pertanian Bogor, Bogor. 41. Nguyễn Tiến Bân (1997), Cẩm nang tra cứu và nhận biết các họ thực vật hạt kín ở Việt Nam, Nxb Nông nghiệp, Hà Nội, tr 876.

77



42. Nuntavan Bunyapraphatsara, Aranya Jutiviboonsuk, Prapinsara Sornlek, Wiroj Therathanathorn, Sanit Aksornkaew, Harry H. S. Fong, John M. Pezzuto, Jerry Kosmeder (Dec. 2003). Pharmacological studies of plants in the mangrove forest. Thai Journal of Phytopharmacy Vol.10(2) pp 1-12. 43. P. Wetwitayaklung,C. Limmatvapirat,and T. Phaechamud (2013). Antioxidant and Anticholinesterase Activities in Various Parts of Sonneratia caseolaris (L.). Indian J Pharm Sci. 75(6). 649–656. PMCID. PMC3928728. 44. Pedro Avenido, Augusto E, Serrano, Jr (2012). Effects of the apple mangrove (Sonneratia caseolaris) on antimicrobial, immunostimulatory and histological responses in black tiger shrimp postlarvaefed at varying feeding frequency. Aquaculture, Aquarium, Conservation & Legislation International Journal of the Bioflux Society Volume 5, Issue 3. 112-123. 45. Pedro Avenido, Augusto E, Serrano, Jr (2012). Effects of the apple mangrove (Sonneratia caseolaris) on growth, nutrient utilization and digestive enzyme activities of the black tiger shrimp Penaeus monodon postlarvae. Library European Journal of Experimental Biology. 2 (5).1603-1608. 46. Perry, L.M (1980). Medicinal plants of east and southeast Asia. MIT Press, Cambridge. 47. Phạm Hoàng Hộ (2000). Cây cỏ Việt Nam II, nhà xuất bản Trẻ, thành phố Hồ Chí Minh, 26, 27. 48. Qi-Jie, Z., Wang Bo, Sun, Wang Yong-Jun, Li Ming-Guang. (2003). Ecologigal Assessment on the Introduction Sonneratia caseolaris and S.apetala at the Mangrove Forest of Shenzhen Bay, China. Acta Botanica Sinica. 45(5).544551. 49. R .Ahmed, S. J. Moushumi, H. Ahmed, M. Ali, W. M. Haq, R. Jahan, M. Rahmatullah (2010). Serum Glucose and Lipid Profiles in Rats Following Administration of Sonneratia Caseolaris (L.) Engl. (Sonneratiaceae) Leaf Powder in Diet. Advances in Natural and Applied Sciences, 4(2). 171-173, ISSN 1995-0772.

78



50. Sadhu SK, Ahmed F, OhtsukiT, Ishibashi M (2006), Flavonoids from Sonneratiacaseolaris. Journal of Natural Medicine 60, 264–265. 51. Scudiero D.A., Shoemaker R.H., Kenneth D.P., Monks A., Tierney S., Nofziger T.H., Currens M.J., Seniff D., Boyd M.R. (1988), Evaluation of a soluable tetrazolium/formazan assay for cell growth and drug sensitivity in culture using human and other tumor cell lines. Cancer Reseach. 48. 4827-4833. 52. Tang Yuping, Zheng Weiping, Lou Fengchang, Li Yanfang and Wang Jinghua (2009), Flavone Glycosides from the Leaves of Ginkgo biloba, Journal of Chinese Pharmaceutical Sciences 9, 119-121. 53. Thawatchai Phaechamud, Kotchamon Yodkhum, Chutima Limmatvapiratand Penpan Wetwitayaklung (2012). Morphology, Thermal and Antioxidative Properties of Water Extracts from Sonneratia caseolaris (L.) Engl. Prepared with Freeze Drying and Spray Drying. Journal of Pharmaceutical, Biological and Chemical Sciences. RJPBCS Volume 3 Issue 1 Page No. 725-739. ISSN. 0975-8585. 54. The Plant List (2010). “Sonneratia caseolaris”. 55. Tian Minqing, Dai Haofu, Li Xiaoming, Wang Bingui, (2009) Chemical constituents of marine medicinal mangrove plant Sonneratia caseolaris, Chinese Journal of Oceanology and Limnology Vol. 27 No. 2, P. 288-296, DOI. 10.1007/s00343-009-9138-7. 56. Trần Mỹ Linh, Vũ Hương Giang, Lê Quỳnh Liên, Nguyễn Tường Vân, Ninh Khắc Bản, Châu Văn Minh (2013). Đánh giá hoạt tính ức chế vi khuẩn kiểm định của một số loài thực vật ngập mặn tại vườn quốc gia Xuân Thủy, Nam Định. Tạp chí sinh học. 35(3). 342-347. 57. Tsoukatou, M., C. Hellio, C. Vagias, C. Harvala & V. Roussis. (2002), Chemical defense and antifouling activity of three Mediterranian sponges af the genus Ircinia. Zeitschrift fur Naturforschung, 54. 161-171. 58. Vander Bergher D. A., and Vlietlinck (1991), Screening methods for Antibacterial and Ativiral Agent from Higher Plants, Methods in Plant biochemistry. Academic Press., USA, V . 6.

79



59. Vedantha Mohan Chari, Madelon Jordan, Hildebert Wagner, Peter W. Thies (1977), A 13C-NMR study of the structure of an acyl-linarin from Valeriana wallichii, Phytochemistry 16 1110-1112. 60. Vlietlinck, A.,J. (1998), Screening methods for detection and evaluation of biological activities of plant preparation, Bioassay Methods in Natural Product reseach and Drug development, Kluwer acadamic publishers, USA. 61. Võ Văn Chi (2012), Từ điển cây thuốc Việt Nam (bộ mới) tập I, II, Nhà xuất bản y học, Hà Nội, 138 (I), 139 (I), 409 (II). 62. Wu Shi-Biao, Wen Y., Li Xu-Wen, Zhao Y.,Zhao Z. and Hu Jin-Feng (2009). Chemical constituents from the fruits of Sonneratia caseolaris and Sonneratia ovata (Sonneratiaceae). Biochemical Systematics and Ecology 37, 1-5. 63. Xavier Romero-Frias (1999). The Maldive Islanders, A Study of the Popular Culture of an Ancient Ocean Kingdom. Barcelona ISBN 84-7254-801-5. 64. Xu J, Lin P, Meguro S, Kawachi S. Phytochemical research on mangrove plants (1997). Lipids and carbohydrates in propagules of ten mangrove species of China. Mokuzai Gakkaishi. 43.875–81. 65. Zan Q, Wang Y, Wang B (2002). Accumulation and cycle of heavy metal in Sonneratia apetala and S.caseolaris mangrove community at Futian of Shenzhen. Huan Jing Ke Xue. 23.81–8.

80



Phụ lục

Phụ lục 1. Phổ 1H-NMR của BCW1


I




Phụ lục 4. Phổ 13C-NMR của BCW1

II




Phụ lục 6. Phổ HSQC của BCW1

III





IV



Phụ lục 9. Phổ HMBC của BCW1


V





VI





VII





VIII





IX





X





XI





XII





XIII





XIV





XV





XVI





XVII





XVIII



Phụ lục 37. Phổ HMBCcủa BCW3của BCW3

Phụ lục 38. Phổ HMBCcủa BCW3

XIX





XX





XXI



Phụ lục 43. Phổ 1H-NMRcủa BCW4


XXII



phụ lục 45. Phổ 13C-NMR của BCW4

Phụ lục 46. Phổ HSQC củaBCW4

XXIII



Phụ lục 47. Phổ HSQC củaBCW4


XXIV





XXV





XXVI





XXVII





XXVIII





XXIX





XXX





XXXI





XXXII





XXXIII





XXXIV





XXXV





XXXVI





XXXVII





XXXVIII





XXXIX





XL





XLI





XLII





XLIII





XLIV





XLV





XLVI




XLVII

Nghiên Cứu Thành Phần Hóa Học Và Khảo Sát Hoạt Tính Sinh Học Cây Bần Chua (Sonneratia Caseolaris (L.) Engl.)

Recommend Documents