NUMERACION DE Bacillus cereus Fundamento Recién a comienzos de 1,950 se estableció que Bacillus cereus es un microorganismo capaz de provocar una enfermedad transmitida por los alimentos (ETA). La estadística de varios países le adjudican a este agente porcentajes que varían del 1 al 23% de los brotes de origen bacteriano confirmados. B. cereus ha sido también recientemente señalado como agente de infecciones extraintestinales, El microorganismo es un bastón Gram positivo, móvil, aerobio-anaerobio facultativo esporulado. Dos formas clínicas diferentes de gastroenteritis se producen por la ingesta de alimentos confirmados con un número considerable de Bacillus Cereus el denominado síndrome diarreico y el emético. Ambos síndromes se producen por diferentes toxinas excretadas por el microorganismo. El desarrollo de las células vegetativas típicas ocurre entre 10°C a 50°C, con temperaturas óptimas entre 28°C y 35°C. Sin embargo, se han aislado variantes psicotrofas capaces de desarrollar y alterar la leche cruda a 5°C. El rango de pH es de 4.35-4.90 a 9.30 y la actividad acuosa (aw) mínima 0.912-0.950. Bacillus Cereus; es un microorganismo de distribución universal se halla presente en tierra, barro, sedimentos, aguas naturales, polvos vegetales y muchos tipos de alimentos. Las principales fuentes de contaminación que provocan el síndrome diarreico se encuentran en los alimentos derivados de la carne, sopas, vegetales, salsas y flanes mientras que el arroz cocido (arroz frito servido por restaurantes asiáticos) y pastas son la principal fuente de contaminación para el desarrollo del síndrome emético. Considerando que la temperatura ambiente permite la multiplicación del microorganismo, los alimentos mal cocinados a base de cereales, principalmente la comida china, comida en restaurantes y las listas para el consumo, mantenidas a temperaturas inadecuadas, constituyen un riesgo potencial para la salud de los consumidores. El síndrome ocasionado por la toxina emética reviste mayor gravedad que el de la toxina diarreica presentando un periodo de incubación variable entre 1 y 6 horas con náuseas, vómitos y muy raramente diarrea, el número de células que se necesita para desencadenar la sintomatología se cifra alrededor de los M 109 'UFC/g de alimento. El síndrome diarreico, se inicia entre las 8 y las 16 horas después de la ingestión de alimentos contaminados con aproximadamente 10 5 UFC/g. La naturaleza ubicua de Bacillus Cereus hace que inevitablemente se le encuentre en los alimentos. Sin embargo su presencia en número
reducido no constituye un problema; por ello se debe prevenir la germinación de las esporas y la multiplicación de las células vegetativas en los alimentos cocidos listos para el consumo. 1. Objetivo Disponer de un método para demostrar la presencia de un número elevado de Bacillus cereus. 2. Alcance Laboratorio de mediana y alta complejidad. 3. Consideraciones Generales Un hallazgo de números altos de Bacillus cereus, en los alimentos puede demostrar su implicación o participación potencial en un brote de intoxicación alimentaria. En los medios con yema de huevo, B.cereus, produce una zona opaca alrededor de las colonias, mientras que otras bacterias aerobias esporuladas, como B. thuringiensis, no producen esta zona opaca o es reducida. La metodología analítica considera como medio de selección el sembrado en Agar Manitol Yema de Huevo Polimixina (MYP), incubando a 30°C durante 24 a 48 horas, seguido de un recuento presuntivo de las colonias sospechosas de B. cereus; estas son rugosas, secas, con un sustrato de color rosado, rodeadas por un espeso anillo de precipitado blanco. Luego se aíslan estas colonias en Agar Tripticasa de Soya (TSA) a partir del cual se realizan las prueba para la identificación bioquímica de B. cereus: detección de B-hemólisis en Agar de Sangre, de movilidad y reducción de nitrato y de licuefacción de la gelatina. 4. Recursos Necesarios 4.1. Recursos Humanos Balarla eléctrica de 2,000 g de capacidad, sensibilidad de 0,1 g Personal adiestrado en microbiología. 4.2. Equipos y Materiales Baño María de 48-50°C Incubadoras, 30°C y 35°C Stomacher y/o licuadoras Microscopio, portaobjetos microscópicos y placas de cubierta Contador de colonias Gradillas Mecheros Bunsen Mezclador Vortex Asas de alambre de platino o micrón Placas petri, estériles, 15 x100 mm Pipetas de 1,5 y 10 mL graduadas en unidades de 0.1 mL Tubos de ensayo 16 x 125 Plumón de tinta indeleble
Espátula de Drigalski 4.3. Medios de Cultivo Agar Manitol Yema de Huevo Polimixina (MYP) Agar Tripticasa de Soya (TSA) Infusión Cerebro Corazón (BHI) Agar Sangre Base Medio de Gelatina Agar movilidad-nitrato Peptona 4.4. Reactivas Alfanaftilamina, solución acuosa al 0.5% en ácido acético 5N Ácido sulfanílico, solución acuosa al 0.8% en ácido acético 5N Reactivos para tinción de Gram 4.5. Aditivos Emulsión de yema de huevo al 50% Sangre desfibrinada de ovino 4.6. Soluciones y Colorantes Solución acuosa de polimixina B al 0.1% Solución salina 4.7. Patrones y Cepas de Referencia Cepa Bacillus cereus. Método de Recuento en Placa 5. Procedimiento DIA 1 Con ayuda de cucharas o tenedores estériles, pesar asépticamente, 10 g representativos de la muestra problema en el vaso homogeneizador y añadir 90 mL de agua peptonada al 0.1%; homogeneizar durante un minuto aproximadamente, a partir de esta dilución inicial de 1:10, hacer diluciones decimales en serie en eI mismo diluyente (hasta 10-3). Sembrar 0.1 mL por duplicado de cada una de éstas 3 diluciones en la superficie seca de placas de agar manitol yema de huevo polimixina (MYP) y con la ayuda de la espátula de Drigalsky o bastones de vidrio, esparcir cuidadosamente el inoculo sobre toda la superficie del agar hasta su completa absorción. Incubar las placas invertidas a 30°C durante 24a 48 horas. DIA 2 Dar corno recuento de B. cereus, las colonias que presenten bordes entrecortados, diámetro aproximadamente de 5 mm, rodeados de un halo amplio de hidrólisis de lecitina, sobre un fondo rojo violeta. Transplantar de 5 a 7 colonias típicas a tubos con Agar Tripticasa de Soya (TSA) e incubar a 35°C durante 24 horas.
DIA 3 A partir de los cultivos puros en TSA, realizar las pruebas Bioquímicas siguientes: Verificación de la B-hemolisina en agar sangre. Transplantar mediante estrías en placas de agar sangre. Incubar a 30°C de 18 a 24 horas. Prueba de movilidad y reducción de nitrato Transplantar por puntura a tubos con agar de movilidad nitrato. Incubar a 35°C durante 18 a 24 horas. El B. cereus, presenta movilidad positiva en 50 a 90 % de los casos y reduce el nitrato a nitrito. Licuefacción de la gelatina: Transplantar a tubos que contengan medio de gelatina. Incubar a 35°C durante 24 horas. Antes de la lectura, dejar durante unas dos horas bajo refrigeración. DIA 4
La lectura de la B-hemol¡sina en Agar Sangre, el B.cereus, es B-hemolítico. En los tubos de movilidad nitrato, añadir 0,3 mL de ácido sulfanílico y 0,3 mL de alfanaftolamina. La aparición del color rojo nar anja indica positividad. En el medio gelatina, antes de la lectura, dejar durante unas 2 horas bajo refrigeración. La licuefacción del medio caracteriza una reacción positiva (B.cereus hace líquida la gelatina), En caso de hallar B. cereus, guardar las cepas positivas. 6. Informe
Cuando los resultados de las pruebas bioquímicas concuerdan con el patrón indicado, se confirma que el aislamiento es de B. cereus. Calcular el número de unidades formadoras de colonias (UFC) por gramo o por mL, multiplicando el número de colonias en las placas por el factor de dilución. Cuando la prueba es negativa se expresa como <10 2 UFC/g ó mL Cuando la prueba es positiva (número de colonias) por factor de dilución. Cuando el número de colonias es excesivo >10 5 UFC/g ó mL. • • •
Límites Permisibles
El límite permisible para B. cereus, en alimentos estará de acuerdo a la clase de alimentos y al criterio de interpretación que se adopte. 8. Bioseguridad
Las muestras que se manejan pueden contener patógenos de clase 2 ó clase 3, es por lo tanto es necesario en todos los casos y durante el proceso se apliquen prácticas de bioseguridad acorde a estos niveles de riesgo. 9. Referencias
American Public Health Association, 1985. Standard Methods for the Examination of Dairy Products, 15th ed. APHA, Washington, DC. American Public Health Association, 1989. Standard Methods for the •
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Examination of Dairy Products, 17th ed. APHA, Washington, DC. The International Commission on Microbiological Specifications for Foods of the International Association of Microbiological Societies. Microorganismos de los Alimentos- Técnicas de Análisis Microbiología Vol. I, Segunda ed. Editorial Acribia, Zaragoza, España. Food and Drug Administration Bacteriológical Analytical Manual. 7th Ed. 1992. Published and Distributed by AOAC International USA. Organización Panamericana de la Salud - Organización'Mundial de la Salud. Guía Técnica N°003 para el Estudio "Evaluación del Riesgo Microbiológico de los Alimentos Vendidos en la Vía Pública en ciudades de América Latina" 1994. •
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10.
Anexos
Flujograma de secuencia de análisis Diagrama de secuencia de análisis Cuadro de identificación Bioquímica
NUMERACIÓN DE Bacillus cereus
10g Muestra + 90 mL AP 0.1%
DILUCIONES -2, -3 INCUBAR A 30° C/24-48 Hs.
AGAR MYP
CONTEO DE COLONIAS SOSPECHOSAS SELECCIÓN DE 3 – 5 COLONIAS
AGAR TSA
AGAR GLUCOSA
FERMENTACION DE LA GLUCOSA AMARILLO
CALDO VOGES PROSKAUER
ROJO (+)
INCUBAR A 35° C/24 Hs.
AGAR NITRATO MOVILIDAD
NITRATO (+) MOVILIDAD (+)
INCUBAR A 35° C/24 Hs.
