Reporte No.6 “Determinación de proteína por el método de Biuret.”
Centro de Ciencias Básicas. Departamento de Química. Academia de Bioquímica. Lic. Análisis Químicos Biológicos. Materia: Bioquímica I Profesor: M.C. Javier Martínez Rodríguez. Alumnas: Joselyn Georgina Flores Ibarra. Dulce María Palos Dueñas. Alejandra Ramos Ramos Hernández. Hernández. Fecha: 05/Octubre/2017
OBJETIVO
Determinar espectrofotométricamente la concentración de la proteína en una solución problema, usando la curva estándar (curva patrón o de calibración). INTRODUCCIÓN
Las proteínas son cadenas polipeptídicas que se diferencian de los oligopéptidos en el número de aminoácidos que contienen, en su carácter funcional y sobre todo en que son el resultado del proceso de expresión genética. La conformación de una proteína hace referencia a la disposición espacial de la misma, aspecto de vital importancia, pues va a estar directamente relacionado con la función que desempeñan. Según su conformación las proteínas pueden clasificarse en fibrosas y globulares. Las proteínas fibrosas poseen las cadenas polipeptídicas ordenadas de modo paralelo a lo largo de un eje, forman materiales físicamente resistentes e insolubles en agua, siendo elementos básicamente estructurales como por ejemplo la α -queratina del pelo, la fibroina de la seda o el colágeno de los tendones. Por su parte, las proteínas globulares, están constituidas por una o varias cadenas polipeptídicas plegadas de modo que puedan adoptar una conformación esférica o globular, desempeñando diferentes funciones, entre ellas: • • • •
Proteínas transportadoras (mioglobina) Catalizadores (enzimas) • protectora (anticuerpos)
Receptoras de señal (rodopsina) Reserva (albumina)
La conformación que presenta una proteína va a depender directamente de los distintos niveles estructurales que posee, pudiéndose observar hasta cuatro niveles estructurales, denominados estructura primaria, secundaria, terciaria y cuaternaria.( Garrido,2006). Las proteínas son un grupo de biopolímeros constituidos de aminoácidos que exhiben una amplia gama de estructuras y funciones. Las proteínas como un grupo de biomoléculas, desempeñan una gran variedad de funciones, algunas participan en la contracción muscular y sirven para dar soporte estructural, otras trasportan y almacenan moléculas pequeñas. Los anticuerpos (moléculas que sirven para como protección inmunológica) son proteínas al igual que las enzimas (catalizadores biológicos) y algunas hormonas. Las proteínas pueden llevar a cabo funciones tan diversas por la enorme posibilidad de combinaciones en la composición y secuencia de aminoácidos. Las proteínas también se clasifican según su composición, las que se forman solo de residuos de aminoácidos y no tienen otras biomoléculas son PROTEÍNAS SIMPLES; no todas las proteínas son solubles en agua, de hecho las proteínas insolubles son esenciales para dar soporte y mantener la integridad estructural de las células y organismos. La determinación cuantitativa de la concentración de proteínas es una de las pruebas que más frecuentemente deben hacerse en el laboratorio de bioquímica. Primitivamente, la cantidad de proteínas se evaluaba midiendo la cantidad total de nitrógeno proteico, y teniendo en cuenta que este elemento representa aproximadamente el 16% del peso de una proteína. Este era un método largo y laborioso y con poca sensibilidad. La aparición de métodos calorimétricos ha permitido solventar estos dos inconvenientes. Existen diversos métodos que permiten cuantificar la concentración de proteínas presente en muestras biológicas, basados específicamente en las propiedades que muestran las proteínas en solución. Los métodos más usuales son: Compuestos que tienen dos o más uniones peptídicas (péptidos y proteínas) al reaccionar con el reactivo de Biuret (sulfato de
cobre alcalino) se forma un complejo de color púrpura. Este color es el resultado de la coordinación de los átomos de nitrógeno del enlace peptídico con el Cu+2. La intensidad del color y la cantidad de producto depende de la concentración de proteínas. Este método es reproducible pero poco sensible. El rango de sensibilidad de este método es de 0,25 – 200 mg de proteínas por mL de solución, y el tiempo que toma realizar la prueba es de aprox 20-30 min y el método de lowry que es un método más sensible que el de Biuret pudiendo detectar muy bajas concentraciones (hasta 5 ug). El principio de la detección es el mismo que el de Biuret con la diferencia en que se util iza un segundo reactivo: la solución de Folin – Ciocalteau (fosfomolíbdato-fosfotungstato) en un medio cúprico alcalino, el cual se le agrega para incrementar la intensidad del color. Este incremento en la intensidad se debe a la reducción del reactivo Folin – Ciocalteau por los residuos de tirosina y triptofano presentes en las proteínas. El producto coloreado de la reacción es leída en un espectrofotómetro a 750 nm.( Herrera,2003). Método de Biuret
El nombre de la reacción procede del compuesto coloreado formado por la condensación de dos moléculas de urea con eliminación de amoníaco, por lo tanto detecta la presencia de compuestos con dos o más enlaces peptídicos y sirve para todas las proteínas y péptidos cortos. Al formar complejos los iones cúpricos con los enlaces peptídicos de las proteínas se produce un color violeta-morado bajo condiciones alcalinas. La absorbancia del color producido es leída a 540 nm. La intensidad del color (absorbancia) es proporcional al contenido proteico de la muestra. Permite la determinación de proteínas totales y albúmina sérica. El fraccionamiento salino separa la albúmina de las globulinas. Es importante elaborar una curva estándar de concentración vs. Absorbancia utilizando albúmina de suero de bovino (BSA) o de un estándar para la comparación con la muestra bajo estudio. Ventajas del método de Biuret • • • • • •
Menos costoso que el método de Kjeldahl. Rápido (se puede completar en menos de 30 min). Es el método más simple de análisis de proteínas. No es frecuente encontrar derivaciones de color. Pocas substancias no proteicas interfieren con la reacción de Biuret. No detecta nitrógeno de fuentes no proteicas o no peptídicas.
Desventajas del método de Biuret • • • •
No es muy sensible comparado con el método de Lowry. Requiere, al menos, 2 a 4 mg de proteína por prueba. Las concentraciones altas de sales de amonio y glicerol interfieren con la reacción. Puede ocurrir opalescencia en la solución final si están presentes altas concentraciones de lípidos o carbohidratos.
• • • • • • •
MATERIALES 6 Tubos de ensaye de 18x150nm 1 Gradilla para tubos de ensaye 1 Pinzas para tubo de ensaye 1 Baño María 1 Pipeta 1 mL 1 Celdilla de plástico de 3.5 mL 1 Espectrofotómetro
REACTIVOS Solución patrón de proteína Solución de NaCl al 0.9% Reactivo de Biuret Solución Problema
PROCEDIMIENTO
1. Preparar los tubos de ensaye como se indica en la tabla anexa.
2. Calentar los tubos en el baño maría (50 ° C) durante 10 minutos.
3. Enfriar los tubos con agua corriente.
4.Calibar el espectofotómetro de cero de absorbancia a 540 nm usando el tubo blanco (tubo 1).
5. Determinar la absorbancia a 540nm de cada uno de los tubos que contienen concentraciones conocidas de proteínas (tubos del 2-5).
6. Determinar la absorbanciaa a 540 nm del tubo problema (tubo 6)
7. Tabule las concentraciones de las proteínas (mg/ML) de los tubos 2-5 con sus respecivas absorbancias. RESULTADOS Tabla 1 resultados de las concentraciones obtenidas de proteína en cada tubo y las absorbancias determinadas por el espectrofotómetro
No. de Tubo 1 2 3 4 5 6
Concentración Proteína 0 mg 2 mg 4 mg 6 mg 8 mg 2.94 mg
Absorbancia
0 0.086 0.144 0.202 0.371 0.156
Tabla 2 Curva patrón de proteínas expresados a través de una gráfica de regresión lineal, el punto naranja muestra en donde se encuentra el tubo problema.
Curva Patrón de Proteína 0.4 0.35
y = 0.0858x - 0.0968 R² = 0.9485
0.3 a i c n a b r o s b A
0.25 0.2 0.15 0.1 0.05 0
-0.05
0
1
2
3
4
5
6
Concentración de la proteína (mg/ml)
Cálculos para la obtención de la concentración de la proteína de la solución problema a partir de la ecuación de la recta. Y=0.0858X-0.0968 Y=Absorbancia=0.156 X= 0.156-0.0968 0.0858
1
= 2.94
2
3
4
5
6
Ilustración 1 En la imagen de muestran los tubos con diferentes concentraciones de proteínas, se puede observar como la intensidad de la coloración va en aumento del tubo 1 al tubo 5, además de como en el tubo 6 la coloración es baja, mostrando entre cuales concentraciones se podría encontrar.
DISCUSIONES JOSELYN GEORGINA
La presencia de proteínas en una mezcla se puede determinar mediante la reacción del Biuret. El reactivo de Biuret contiene CuSO4 en solución acuosa alcalina (gracias a la presencia de NaOH o KOH). La reacción se basa en la formación de un compuesto de color violeta, debido a la formación de un complejo de coordinación entre los iones Cu2+ y los pares de electrones no compartidos del nitrógeno que forma parte de los enlaces peptídicos. La reacción debe su nombre al Biuret, una molécula formada a partir de dos de urea (H2N-CO-NH-CO-NH2), que es la más sencilla que da positiva esta reacción, común a todos los compuestos que tengan dos o más enlaces peptídicos consecutivos en sus moléculas La producen los péptidos y las proteínas, pero no los aminoácidos, ya que se debe a la presencia del enlace peptídico (- CO- NH -) que se destruye al liberarse los aminoácidos. Cuando una proteína se pone en contacto con un álcali concentrado, se forma una sustancia compleja denominada Biuret. Debido a dicha reacción fue que observamos que al agregar el reactivo de sulfato de cobre más solución de proteína precipitó una coloración violeta. Quedando en el fondo del tubo una tonalidad azul cielo reacción positiva. Precipitando a una coloración amarilla la reacción nos torna negativa al no haber presencia de proteínas. El método evaluado en el presente trabajo se basa en la reacción de Biuret. En un experimento anterior donde se usó el método de Biuret con desproteinización, los autores observaron que la intensidad del color del complejo proteína-Biuret era similar para las diferentes fracciones proteicas. El complejo se basa en la descomposición de los grupos amida para formar el enlace de cobre (II) o por el establecimiento de un enlace coordinado entre el metal y los pares e electrones libres de los átomos de oxígeno y de nitrógeno del péptido. El método de Biuret es la técnica más simple para la determinación de las proteínas solubles. Las sustancias que poseen dos o más enlaces peptídicos forman un complejo coloreado purpura con sales de cobre alcalinos. El desarrollo del color es diferente para cada proteína. Existen pocas interferencias en esta determinación: entre las que más se encuentran la presencia del ion amonio el cual altera el desarrollo del color, algunos pigmentos absorben a la misma longitud de onda algunos carbohidratos y lípidos capaces de formar complejos con el ion coordinado. Efectivamente, aplicando el método Biuret se puede determinar la concentración de proteína en una o varias muestras problema. El método de Biuret es el más utilizado para la cuantificación de proteínas, es un método rápido, sencillo y eficiente, y sobre todo didáctico Es importante conocerlo puesto que en la vida profesional puede ser útil, ya que como una carrera de investigación, es posible enfrentarse a trabajar con la presencia de soluciones de concentraciones desconocidas para saber cómo se deben manejar. Una manera fácil concisa para conocer la concentración de la proteína es por medio de análisis como este. En el método de Biuret, con el uso de la espectrofotometría es posible conocer las concentraciones de la muestra problema, esto comparando con la gráfica que se construye a partir de las absorbancias leídas, entonces se reforzó la construcción de curvas de calibración relacionando la absorbancia y la concentración, y a partir de esto se pudo identificar por medio de la interpolación, la concentración de la muestra problema.
DULCE MARÍA
Para la determinación de de proteínas, que en este caso fue la albumina de huevo se usó el método de Biuret el cuál según Pratt C. Cornely K. (2012) El método comprende un ensayo colorimétrico de un paso donde se cuantifica la formación de un complejo estable entre proteínas y cobre (II). El complejo presenta un color violeta característico, que se puede observar a 310nm o 540-560nm, el cual se da por la coordinación de un átomo de cobre con cuatro átomos de nitrógeno. El complejo se basa en la desprotonación de los grupos amida para formar el enlace con el cobre (II) o por el establecimiento de un enlace coordinado entre el metal y los pares de electrones libres de los átomos de oxígeno y de nitrógeno del péptido. Después de la adición del reactivo de cobre se requiere de tiempo para desarrollar una coloración de Biuret estable; es necesario considerar la posible influencia de aminoácidos libres que forman buffer en configuración tris y amoniaco. Se basa en la formación de un complejo coloreado entre el Cu 2+ y los grupos NH de los enlaces peptídicos en medio básico. 1Cu 2+ se acompleja con 4 NH. La intensidad de coloración es directamente proporcional a la cantidad de proteínas (enlaces peptídicos) y la reacción es bastante específica, de manera que pocas sustancias interfieren. La sensibilidad del método es muy baja y sólo se recomienda para la cuantificación de proteínas en preparados muy concentrados. De acuerdo con lo anterior y sabiendo que la albumina de huevo al ser proteína contiene carios grupos aminos los cuales se pueden desprotonar y así el nitrógeno enlasarce con el ion Cu2+ y así formar el complejo estable para posteriormente por medio de la colorimetría espectrofotometría las cuales dependen una de la otra determinar la concentración de la proteína en cada una de las muestras por medio del color que tomo cada una de las muestras. Entre mayor era la intensidad del color azul que llego a ser purpura la muestra con mayor concentración de albumina mayor eran los iones de cobre que normalmente son azules que se enlazaban con el nitrógeno e intensificando el color de la muestra y así por medio de las longitudes de onda de los colores emitidos por el complejo, y la absorción de estas longitudes de onda, se determina la concentración de ésta proteína por medio del espectrofotómetro. Es así como con ayuda de las muestras con valores conocidos, el espectrofotómetro que nos da valores de absorción, y por la de la curva patrón de la proteína, se pudo obtener el valor de concentración de la albumina de la muestra problema, la cual los valores de absorción se enconraba entre la muestra 2 y 3, que con lo ya las ayudas mencionadas se logró calcular su concentración la cual fue de 2,94 mg/mL de solución, comprobando así que efectivamente se encuentra entre estas muestras, comparando también con sus concentraciones (véase en la sección de resultados). Todo lo dicho del espectrofotómetro, la absorbancia, las longitudes de onda y todo lo mencionado en los dos párrafos anteriores, se justifica brevemente en la siguiente cita. El espectrofotómetro1 es un instrumento con el que se apoya la espectrofotometría para medir la cantidad de intensidad de luz absorbida después de pasar a través de una solución muestra. Un espectrofotómetro es un instrumento usado en el análisis químico que sirve para medir, en función de la longitud de onda, la relación entre valores de una misma magnitud fotométrica relativos a dos haces de radiaciones y la concentración o reacciones químicas que se miden en una muestra. Este instrumento tiene la capacidad de proyectar un haz de luz monocromática a través de una muestra y medir la cantidad de luz que es absorbida por dicha muestra. Esto le permite al operador realizar dos funciones: a) Dar información sobre la naturaleza de la sustancia en la muestra,
b) Indicar indirectamente qué cantidad de la sustancia que nos interesa está presente en la muestra. (Escalona M. 2009) ALEJANDRA
El objetivo de la práctica fue determinar la concentración de proteína de una solución problema, usando una curva estándar y realizando la determinación de dicha concentración espectrofotométricamente Durante la primera sesión de laboratorio se llevó a cabo la parte experimental, que consist ió en aplicar el método de Biuret con el fin de obtener varios pares de datos que serían graficados posteriormente en la segunda sesión. Los pares de datos consistían en la absorbancia de una determinada muestra, la cual dependía de la concentración de la proteína albumina sérica en dicha muestra. Algunos métodos de determinación de proteínas se basan en que las proteínas dan reacciones de color con algunos reactivos, como el método de Biuret. Garrido (2006), indica que en el método de Biuret, el nombre de la reacción procede del compuesto coloreado formado por la condensación de dos moléculas de urea con eliminación de amoníaco, por lo tanto detecta la presencia de compuestos con dos o más enlaces peptídicos y sirve para todas las proteínas y péptidos cortos. El reactivo empleado en este método es una solución de sales de cobre, generalmente sulfato de cobre, el método se basa en la formación de un complejo coloreado entre el Cu2+ y los grupos NH de los enlaces peptídicos en medio básico. Al formar complejos los iones cúpricos con los enlaces peptídicos de las proteínas se produce un color violeta-morado bajo condiciones alcalinas. La absorbancia del color producido es leída a 540 nm y la intensidad del color es proporcional al contenido proteico de la muestra (libro, X). La información anteriormente mencionada concuerda con lo observado durante la práctica, puesto que para llevar a cabo el método de Biuret, se prepararon 6 tubos de ensaye agregando a cabo tubo cantidades diferentes de la solución patrón de proteína, solución de cloruro de sodio y el reactivo de Biuret, excepto en los tubos 1 y 6, en el tubo 1 no se agregó solución patrón de proteína debido a que este tubo sería el tubo “blanco” y el tubo 8,
contenía un mililitro de la solución problema de albumina sérica, sin agregar de la solución patrón de dicha proteína. Agregar cantidades diferentes de la solución patrón de proteína se realizó con la finalidad de producir en cada tubo, una concentración conocida de proteín a en cada tubo, pero de diferente valor. A cada uno de los 6 tubos se les agregaron 3 mililitr os del reactivo de Biuret, dando cada tubo una intensidad del color violeta-azulado diferente, tal como se menciona en la teoría. Posteriormente los tubos fueron calentados a 50°C durante 10 minutos, y después de enfriar los tubos, se procedió a leer la absorbancia de cada tubo con el espectrofotómetro. Se calibro el espectrofotómetro a 540 nm usando el tubo 1, debido a que este tubo no contenía proteínas. Las concentraciones de proteína en los tubos fueron de 2, 4, 6 y 8 mg/mL, mientras que las absorbancias leídas en el espectrofotómetro por el equipo de trabajo fueron 0.086, 0.144, 0.202, y 0.371, respectivamente, mientras que la muestra problema presento una absorbancia de 0.156. Se utilizaron los datos de las concentraciones de proteína con cada una de sus absorbancias leídas para graficarlas y, a partir de estas, poder realizar la curva estándar. Debido a que en el método de Biuret, la intensidad de coloración es directamente proporcional a la cantidad de proteínas (enlaces peptídicos) se utilizó este principio para poder realizar una gráfica en la que en el eje de las abscisas se colocó la concentración de
la proteína, debido a que esta es la variable independiente, en el eje de las ordenadas, se colocó la absorbancia de las muestras, debido a que esta variable depende del valor de la concentración de proteína en la muestra. La grafica se realizó de una manera sencilla utilizando el software Excel, en el cual solo se tabularon los datos para cada una velas variables y al seleccionar la opción de gráfica, el programa arrojó la gráfica automáticamente. Analizando el valor de la concentración de la muestra problema obtenido en base a la curva de calibración, el cual fue de 2.94 mg/mL, este valor no se aleja mucho del valor de la concentración real de la proteína, lo que nos indica que el método de Biuret es un método útil para la determinación de la concentración de proteínas en una solución problema. Las posibles discrepancias entre los valores experimentales y el valor real de la concentración de la proteína se pudieron deber principalmente a errores de la medición de la absorbancia, pues durante la práctica se realizó la medición de dicha variable en dos ocasiones al mismo tubo y con la misma muestra, y sin embargo, en ambas mediciones el espectrofotómetro arrojo valores diferentes, aunque cercanos los valores unos de otros, estos valores no fueron idénticos. CONCLUSIONES JOSELYN GEORGINA
Es importante el análisis de proteínas para: la determinación de la actividad biológica en alimentos ejemplos: pectinasas durante la maduración de frutos; investigación sobre propiedades funcionales. Ejemplos: gliadina y gluteninas para la elaboración del pan; para el etiquetamiento nutricional del producto final, etc. Existe una gran necesidad del análisis de proteínas con el fin de obtener el contenido proteico total, composición de aminoácidos contenido de alguna proteína particular, contenido proteico durante el aislamiento y purificación de una proteína, nitrógeno no proteico y valor nutritivo relacionados con un alimento específico a analizar. El método de Biuret es bastante específico para proteínas, muestra pocas interferencias y es barato, pero tiene poca sensibilidad. DULCE MARÍA
En esta práctica se logró determinar la concentración de proteína de una solución problema con ayuda de las muestras con valores conocidos, el espectrofotómetro que nos da valores de absorción, y por la de la curva patrón de la proteína, se pudo obtener el valor de concentración de la albumina de la muestra problema, la cual los valores de absorción se encontraba entre la muestra 2 y 3, que con lo ya las ayudas mencionadas se logró calcular su concentración la cual fue de 2,94 mg/mL de solución, comprobando así que efectivamente se encuentra entre estas muestras, comparando también con sus concentraciones. Así como el uso de este aparato, la elaboración de la curva y el uso de datos que nos proporcionan estas técnicas, tanto como sus cálculos y usos de estas, la importancia que tiene en el área laboral y estudiantil de un AQB, sobre todo el área clínica, así como también se conocieron alternativas de este método de determinación, sus ventajas, desventajas, su mecanismo y la forma de trabajo junto con el del método aplicado en esta práctica; la función, utilización, importancia y mecanismo con el que se maneja y trabaja un espectrofotómetro, y todo lo que se lleva en la técnica de análisis llamadas colorimetría y espectrofotometría. ALEJANDRA
El objetivo de la práctica se cumplió satisfactoriamente, ya que se logró determinar espectrofotométricamente la concentración de proteína de una solución problema usando
una curva patrón o curva de calibración. Se determinó la concentración de proteínas en una solución problema, interpolando los datos obtenidos durante la práctica para obtener la concentración de esta solución, también se calculó la concentración de proteínas despejando de la ecuación de la recta proporcionada por el profesor de laboratorio que en lo personales resultó ser lo más fácil y conveniente, los datos manejados para determinar la concentración fueron los obtenidos y al sustituirlos se obtuvo una concentración de proteínas más exacta. Se aprendió también a construir una curva de calibración, y a partir de ella interpolar datos e interpretar la forma de ésta. CUESTIONARIO
1. Investigue y escriba con detalle la reacción bioquímica de Biuret. El reactivo de Biuret está hecho de hidróxido potásico (KOH) y sulfato cúprico (CuSO4), junto con tartrato de sodio y potasio (KNaC4O6·4H2O). El reactivo, de color azul, cambia a violeta en presencia de proteínas, y vira a rosa cuando se combina con polipéptidos de cadena corta. El Hidróxido de Potasio no participa en la reacción, pero proporciona el medio alcalino necesario para que tenga lugar. El método comprende un ensayo colorimétrico de un paso donde se cuantifica la formación de un complejo estable entre proteínas y cobre (II). El complejo presenta un color violeta característico, que se puede observar a 310nm o 540-560nm, el cual se da por la coordinación de un átomo de cobre con cuatro átomos de nitrógeno. El complejo se basa en la desprotonación de los grupos amida para formar el enlace con el cobre (II) o por el establecimiento de un enlace coordinado entre el metal y los pares de electrones libres de los átomos de oxígeno y de nitrógeno del péptido. Después de la adición del reactivo de cobre se requiere de tiempo para desarrollar una coloración de Biuret estable; es necesario considerar la posible influencia de aminoácidos libres que forman buffer en configuración tris y amoniaco. Se basa en la formación de un complejo coloreado entre el Cu 2+ y los grupos NH de los enlaces peptídicos en medio básico. 1Cu 2+ se acompleja con 4 NH. La intensidad de coloración es directamente proporcional a la cantidad de proteínas (enlaces peptídicos) y la reacción es bastante específica, de manera que pocas sustancias interfieren. La sensibilidad del método es muy baja y sólo se recomienda para la cuantificación de proteínas en preparados muy concentrados.
(Roca P. et. al. 2004) 2. Explique detalladamente el fundamento de la cuantificación de un analito cualquiera mediante espectrofotometría. Utilice el método de Biuret como ejemplo en su explicación. Si observamos una disolución acuosa de Cu2+ a trasluz percibimos un color azulado. Esta coloración se debe a la interacción de los iones cobre con la radiación
lumínica que atraviesa la disolución. Más concretamente, se debe a la absorción de algunas radiaciones lumínicas que corresponden al “color complementario” (en este
caso el amarillo). Las radiaciones no absorbidas son las que atraviesan la disolución sin obstáculo alguno y llegan a nuestro ojo. En nuestro ejemplo, estas radiaciones “transmitidas” corresponden al color azul. Una solución roja absorbe la luz verde y
transmite o refleja la luz roja. En ausencia de luz, las sustancias no tienen color. Siguiendo con el ejemplo de la solución de cobre, si comparamos el color de dos disoluciones de Cu2+ con diferente concentración, observamos que a mayor concentración corresponde una mayor intensidad de color azul de la disolución. Por lo tanto podemos saber la concentración de la sustancia según la intensidad del color. Esta propiedad de la interacción de la luz con una gran cantidad de especies químicas nos permitirá identificar y cuantificar analitos, dando lugar a una rama de la química analítica denominada espectrofotometría. La espectrofotometría estudia los fenómenos de interacción de la luz con la materia (Arenas I. López J. 2004) 3. Describa con figuras, imágenes y texto las diferencias y similitudes entre un fotocolorímetro y un espectrofotómetro. Estos son equipos utilizados en el Laboratorio para el análisis de muestras fisiológicas, basándose en el principio que cada compuesto químico absorbe o emite energía lumínica de diferente longitud de onda. Esta longitud puede estar en el espectro de luz visible, o en otra parte del espectro electromagnético. La diferencia fundamental entre un espectrofotómetro y un fotómetro o fotocolorímetro, consiste en que el fotocolorímetro trabaja únicamente en el espectro de luz visible y selecciona una longitud de onda determinada mediante filtros fijos. En cambio, un Espectrofotómetro es capaz de trabajar, no solo con la luz visible sino que en otras regiones del espectro electromagnético (ultravioleta e infrarroja). Además posee un monocromador para seleccionar la longitud de onda deseada.
(Equipos y Laboratorio. 2015) 4. Investigue y explique los fundamentos de los siguientes métodos de cuantificación de proteínas en muestras biólogicas: a) Método de Lowry Combina la reacción del Biuret con la reducción del reactivo de FOLINCIOCALTEAU por los grupos aromáticos de residuos de tirosina, triptófano, cistina cisteína e histidina. Origina compuesto azul intenso Mide a 750nm. b) Método de Bradford Se basa en la unión del reactivo Comassieblue G250 a las proteínas en medio ácido. Reconoce los aa arginina, fenilalanina, triptófano y prolina. Origina color azul intenso A=595nm c) Método de Kjeldahl El método Kjeldahl se basa en la transformación del nitrógeno contenido en la muestra en sulfato de amonio mediante la digestión con ácido sulfúrico en
presencia de un catalizador. El ion amonio obtenido se transforma en medio básico en amoníaco que se destila y valora con una solución de ácido patrón. d) Método de Dumas eterminar el contenido en nitrógeno de una sustancia química. Se basa en un método inicialmente descrito por Jean-Baptiste Dumas en 1826.1k Se usa comúnmente para estimar el contenido de proteínas de los alimentos. Los otros componentes mayoritarios como grasas y carbohidratos y otros compuestos estructurales como la lignina no contienen nitrógeno, pero los aminoácidos de las proteínas si. Otras sustancias como las vitaminas también contienen nitrógeno, pero son una parte muy pequeña y tienen una influecia insignificante en el resultado del análisis.(Del Puerto M. 2013) BIBLIOGRAFÍA
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