Penetapan Kadar Protein Dengan Metode Lowry
Metode Lowry merupakan pengembangan dari metode Biuret. Dalam metode ini terlibat 2 reaksi. Awalnya, kompleks Cu(II)-protein akan terbentuk sebagaimana metode biuret, yang dalam suasana alkalis Cu(II) akan tereduksi menjadi Cu(I). Ion Cu+ kemudian akan mereduksi reagen Folin-Ciocalteu, kompleks phosphomolibdatphosphotungstat (phosphomolybdotungstate), menghasilkan heteropolymolybdenum blue akibat reaksi oksidasi gugus aromatik (rantai samping asam amino) terkatalis Cu, yang memberikan warna biru intensif yang dapat dideteksi secara kolorimetri. Kekuatan warna biru terutama bergantung pada kandungan residu tryptophan dan tyrosine-nya. Keuntungan metode Lowry adalah lebih sensitif (100 kali) daripada metode Biuret sehingga memerlukan sampel protein yang lebih sedikit. Batas deteksinya berkisar pada konsentrasi 0.01 mg/mL. Namun metode Lowry lebih l ebih banyak interferensinya akibat kesensitifannya.
Reagen: 1. Reagen pembentuk kompleks: Siapkan segera sebelum digunakan campuran dari ketiga larutan-larutan berikut dengan perbandingan 100:1:1 Larutan A: 2%b/v Na2CO3 dalam akuades Larutan B: 1%b/v CuSO4.5H2O dalam akuades Larutan C: 2%b/v Kalium Natrium tartrat dalam akuades 2. NaOH 2N 3. Reagen Folin-Ciocalteu 1N Ke dalam labu alas bulat 1500 mL masukkan 100 g sodium tungstate, 25 g sodium molibdate, 700 mL akuades, 50 mL asam phosphate, dan 100 mL HCl. Campuran direfluks selama 10 jam, tambahkan 150 mL lithium sulfat, sulfat, 50 mL akuades dan beberapa tetes bromine (Br2). Didihkan campuran (tanpa pendingin) sekitar 15 menit (hingga kelebihan bromine habis). Dinginkan, encerkan dengan akuades hingga 1 L, saring (filtrat berwarna kehijauan). Sebelum digunakan, encerkan 1 bagian filtrat dengan 5 bagian akuades.
Standard: Gunakan larutan stok standard protein (misalnya albumin) yang mengandung 4 mg/mL protein dalam akuades, disimpan pada -20oC. Siapkan larutan standard dengan pengenceran larutan stok sbb: Larutan
stok (μL)
0
1.25
2.50
6.25
12.5
25.0
62.5
125
250
500
499
498
494
488
475
438
375
250
Akuades
(μL)
Konsentrasi Protein
(μg/mL)
0
10
20
50
100
200
500
1000
2000
Prosedur: 1. Ambil 1 mL sampel atau standard, tambahkan 1 mL NaOH 2N. Hidrolisis pada 100oC selama 10 menit pada penangas air. 2. Dinginkan pada suhu ruangan, tambahkan 5 mL reagen pembentuk kompleks. Biarkan larutan selama 10 menit pada suhu kamar. 3. Tambahkan 0.5 mL reagen Folin-Ciocalteu, homogenkan dengan vortex, biarkan selam 30-60 menit (jangan sampai lebih dari 60 menit) 4. Baca absorbansi pada 660 nm jika konsentrasi protein di bawah 500 μg/mL atau 550 nm jika konsentrasi protein antara 100 – 2000 μg/mL.
Catatan: Jika sampel berbentuk endapan, encerkan dulu dengan NaOH 2N. Reaksi yang terjadi dalam metode Lowry sangat tergantung pada pH. Oleh karena itu aturlah pH 10 – 10.5
Interferensi: Beberapa zat yang bisa mengganggu penetapan kadar protein dengan metode Lowry ini diantaranya adalah: buffer, asam nuklet, dan gula/karbohidrat, deterjen, gliserol, Tricine, EDTA, Tris, senyawa-senyawa kalium, sulfhidril, disulfida, fenolat, asam urat, guanin, xanthine, magnesium dan kalsium. Interferensi agen-agen ini dapat diminimalkan dengan menghilangkan interferens tersebut. Sangat dianjurkan untuk menggunakan blanko untuk mengkoreksi absorbansi. Interferensi yang disebabkan oleh deterjen, sukrosa dan EDTA dapat dieliminasi dengan penambahan SDS atau melakukan preparasi sampel dengan pengendapan protein.
Referensi: Dennison, C., 2002, A
Guide to Protein Isolation ,
Kluwer Academic Publishers, New York
Lowry, O.H., Rosenbrough, N.J., Farr, A.L. & Randall, R.J., 1951, Protein Measurement with the Folin Phenol Reagent, J. Biol. Chem, 193: 265-275
