INSTITUTO POLITÉCNICONACIONAL ESCUELA NACIONAL DE CIENCIAS BIOLÓGICAS DEPARTAMENTO DE FISIOLOGÍA
PRÁCTICA 4 POTENCIAL DE DIFUSION Y POTENCIAL DE LESIÓN
INTEGRANTES:
EQUIPO 5
GRUPO 4FM2
PROFESORES:
FECHA DE ENTREGA 6 DE NOVIEMBRE DE 2012
INTRODUCCIÓN La tendencia que tienen dos soluciones separadas por una membrana para llegar al equilibrio expresa la tendencia general de los sistemas químicos para llegar a un equilibrio de sus potenciales químicos y energéticos, fluyendo de regiones de mayor potencial a las de menor. Por lo tanto, el potencial de difusión se denomina como la diferencia de potencial generada a través de una membrana cuando un soluto con carga (ion) difunde debido al gradiente de concentración, es decir, se debe a la difusión de los iones y solo puede generarse si la membrana es permeable a ese ion (Martin, 2006) Cuando el flujo del ion, dado por la diferencia de concentraciones llega a ser compensado por el flujo de repulsión, dado por la diferencia de potencial eléctrico, se dice entonces que el ion esta en equilibrio electroquímico a través de la membrana (Alva et al., 2010). Este potencial esta definido por la ecuación de Nerst:
Donde E(ion)= potencial de equilibrio (volts) R= constante de los gases T= temperatura absoluta F= constante de Faraday z= valencia del ion [ION]i = concentración del ion en el interior de la célula [ION]o = concentración del ion en el exterior de la célula Es decir, que el potencial de equilibrio de Nerst relaciona la diferencia de potencial a ambos lados de una membrana biológica en el equilibrio con las características relacionadas con los iones del medio externo e interno y de la propia membrana semipermeable. La ecuación de Nerst se emplea para predecir la dirección del flujo iónico en los siguientes casos: 1.- Cuando la diferencia de potencial medida a través de la membrana es igual a la calculada mediante la ecuación de Nerst determinando para un ion determinado. En esta situación el ion se encuentra en equilibrio electroquímico y no habrá flujo neto del mismo a través de la membrana. 2.- Cuando el potencial de eléctrico medido es del mismo signo que el calculado por la ecuación de Nerst para un ion determinado, pero de mayor valor, la fuerza eléctrica es superior causada por el gradiente de concentración, por lo que habrá movimiento neto de dicho ion en la dirección determinada por la fuerza eléctrica. 3.- Cuando la diferencia de potencial eléctrico medida es del mismo signo, pero de menor cuantidad, que la calculada por la ecuación de Nerst , la fuerza debida al gradiente de concentración es superior a la eléctrica, y el movimiento neto de ion tiende a producirse en la dirección determinada por la diferencia de concentración.
4.- Cuando la diferencia de potencial eléctrico medida es de signo opuesto al predicho por la ecuación de Nerst, tanto la fuerza eléctrica como el gradiente de concentración se encuentran orientados en el mismo sentido y consiguiente el ion no se encuentra en equilibrio, por lo que tendría a fluir en dirección determinada por ambas fuerzas. Julius Bernstein fue el primero, en 1902, en proponer una hipótesis satisfactoria para explicar el origen del potencial de membrana en reposo en el nervio y en las fibras musculares. Mediante análisis químico determino que el interior es rico en K+ y contiene poco Na+ y Cl-. Además comprobó que en el interior de la célula hay aniones a los que la membrana en reposo no es permeable; basándose en esos datos, Bernstein postulo la siguiente hipótesis: “El voltaje de transmembrana es consecuencia de una desigual distribución de iones K+, como puede predecirse mediante la ecuación de Nerst” (Martin, 2006) Bernstein cortó fibras musculares de un músculo de rana e insertó un electrodo en el área cortada, haciendo contacto eficaz con el liquido interno de las fibras musculares, pudiendo además modificar el liquido externo del musculo (Alva et al., 2010). Al registro que obtuvo se le llamo potencial de lesión. El potencial de lesión es el potencial desarrollado entre las partes lesionada y no lesionada de un nervio, debido a la exposición de la superficie interna con carga negativa de la membrana polarizada en el lugar de la lesión. En los tejidos excitables, la lesión produce despolarización en la zona lesionada (potencial de lesión), lo que origina un flujo de corriente eléctrica entre ambas zonas (corriente de lesión). En la fibra muscular esquelética, la despolarización causada por una lesión es un proceso irreversible que se propaga gradualmente y despolariza finalmente a toda la célula. Asimismo, el potencial de lesión se aproxima al potencial transmembranal debido a que la superficie lesionada esta casi en el potencial del interior de la célula (Rothstein et al., 2005). La ecuación de Goldman-Hodkin-Katz predice el potencial de membrana para múltiples iones. Esta se utiliza para calcular el potencial de membrana en reposo resultante de la contribución de todos los iones que pueden atravesar la membrana: Esta ecuación incluye los valores de permeabilidad de la membrana porque la permeabilidad de un ion influye en su contribución al potencial de membrana. Si la membrana en impermeable a un ion, ese ion no afectara el potencial de membrana. La contribución de cada ion al potencial de membrana es proporcional a su capacidad para atravesar la membrana. La ecuación de Goldman-Hodking-Katz:
Em= Potencial de membrana en reposo. R= Constante de los gases T=Temperatura absoluta F=Constante de Faraday P= Permeabilidad relativa de la membrana al ion indicado con el subíndice. [ion in], [ion out] = Concentraciones del ion dentro y fuera de la célula. Aunque esta ecuación parece muy complicada, se puede simplificar en estas palabras: el potencial de membrana en reposo esta determinado por las contribuciones combinadas del producto (gradiente de concentración) x (permeabilidad de la membrana) para cada ion. Si la membrana no es permeable aun ion el término de permeabilidad de este ion será cero y el ion abandonaría la ecuación. La ecuación de Goldman predice los potenciales de membrana sobre la base de concentraciones iónicas y permeabilidades de membrana dadas y explica porque la ligera permeabilidad de la célula al Na+ hace que el potencial de membrana en reposo sea más positivo que el E determinado con la ecuación de Nerst. La ecuación de Goldman
también se puede utilizar para predecir lo que sucede con el potencial de membrana cuando cambian las concentraciones iónicas o las permeabilidades de las membranas. (Silverthorn, 2009) Para obtener el potencial de difusión se utiliza un huevo que se encuentra constituido así, en la parte externa existe en primer lugar una cutícula o película, de aproximado 10µm de grosor actúa como revestimiento, disminuyendo la porosidad, la cascara propiamente dicha tiene una matriz esponjosa que emite hacia el interior prolongaciones denominadas protuberancias mamilares. En la parte interna de la cascara existen dos membranas testáceas llamadas capa testácea externa (48 µm) e interna (22 µm) formadas por un entramado de fibras constituidas por un núcleo proteico (4.2%), así como de compuestos inorgánicos (94.3%) como el calcio, fosforo, magnesio, sodio, selenio y en gran proporción el potasio (2000mg) Estas dos láminas o subcapas están fuertemente adheridas entre si en la mayor parte de la superficie interior de la cáscara salvo en la porción obtusa del huevo en la cual se encuentran separadas por la cámara de aire. La lámina interna presenta fibras más finas que la capa externa y muestra una superficie lisa y homogénea debido a la presencia de un material no fibrilar conocido como manto. (Gil, 2010). Para la determinación del potencial de lesión, se utiliza musculo gastrocnemio de rana, el cual por su función en la transmisión de impulsos nerviosos para la contracción del mismo. Los potenciales de electrodo se definen como potenciales de celda para una celda que consiste en el electrodo en cuestión que actúa como cátodo y el electrodo estándar de hidrogeno que lo hace como ánodo, el potencial de electrodo es de hecho el potencial de una celda electroquímica que implica un electrodo de referencia cuidadosamente definido. (Wilches, 2007). HIPOTESIS Al cambiar el gradiente de concentración iones potasio ([k+]) en la membrana del huevo, esperamos un cambio en el potencial intramembranal acorde con los resultados obtenidos mediante la ecuación de Nerst. Esperamos que en la membrana de musculo de la rana exista permeabilidad selectiva al ion [k+], al cambiar el gradiente de ese ion se espera un cambio del potencial de lesión de acuerdo con los resultados obtenidos mediante la ecuación de Goldman. OBJETIVOS GENERALES -
Determinar el efecto del cambio de gradiente de concentración del ion [K+] sobre el potencial de difusión. Determinar el efecto del cambio del gradiente de concentración el ion [K+] sobre el potencial de lesión.
OBJETIVOS PARTICULARES -
-
Determinar la diferencia de potencial generada a diferentes concentraciones de KCl 1, 2.5, 5, 10, 20, 50 y 100mM extracelulares respecto a la de KCl 400 mM contenida en un huevo de gallina y compararlos con los resultados obtenidos mediante la ecuación de Nerst Determinar la diferencia de potencial generada por las soluciones de Ringer y K2SO4 10, 20, 50, 100, 200mM extracelulares respecto a la solución de LIC asociada a la parte lesionada del músculo gastrocnemio de rana y compararlos con los resultados obtenidos mediante la ecuación de Goldman.
FUNDAMENTOS Se utilizo la membrana testácea interna de huevo ya que es permeable al ion potasio. Donde se lleva a cabo un potencial de difusión generado a través de la membrana cuando un soluto con carga (ion) difunde debido al gradiente de concentración, es decir se debe a la difusión de los iones y sólo puede generarse por que la membrana testácea de huevo es permeable a ese ion. Se utilizo el nervio ciático de rana debido a que los en estos métodos se suelen hacer estudios en células musculares o nerviosas, debido a que estas células muestran una notable especialización para este tipo de actividades. La rana suele utilizarse como modelo en este estudio tanto por la facilidad de disponer de estos animales, como por el hecho de presentar muchos aspectos de su anatomía interna claramente visibles. Utilizamos el potencial de lesión donde se mide el de varias células (paralelos) si se afecta la diferencia de permeabilidad afecta a la pendiente. Se utilizo KCl y K₂SO₄ ya que tanto el ion Cl- como el SO₂-- son impermeables a las membranas del huevo y del musculo gastrocnemio respectivamente.
METODOLOGIA
PRACTICA 4 POTENCIAL DE DIFUSIÓN Y POTENCIAL DE LESIÓN
Potencial de difusión
En la cámara de aire del huevo romper el cascaron 3 cm, retirar membrana, desechar membrana y enjuagar con H₂O destilada.
Con pinzas de disección golpear levemente el cascaron en el extremo opuesto de la cámara, desprender cascaron.
Potencial de lesión.
Descerebrar y desmedular una rana, cortar la piel de una pata, exponer el musculo gastrocnemio, separándolo cortando los tendones del hueso.
Pasar el musculo por el anillo de goma hasta la mitad, cortar la mitad restante y jalarlo, para que la parte seleccionada quede dentro del anillo.
Colocar dentro una solución de 400 mM de KCl y un electrodo.
En 1 vaso de pp. colocar 50 ml de KCl 1 mM y colocar el cascaron en la abertura de 0.5 cm, donde este en contacto con el liquido y el otro electrón, medir potencial.
Introducir el tubo de vidrio en el anillo de goma, llenarlo con la solución de LIC, sujetarlo a un soporte, introducir el musculo en un vaso de pp. Con una solución de Riger.
Repetir lo anterior con concentraciones 5, 10, 20, 50 y 100 mM.
Medir el potencial de lesión del musculo, colocando un electrodo de Calomel en solución LIC. Y el otro electrodo en solución Ringer
Probar que sucede con la lectura del multimetro si se levanta el cascaron de la solución.
Sustituir solución por solución K₂SO₄ 0.025M y leer la diferencia de potencial.
Repetir el paso anterior con solución de K₂SO₄ en orden creciente de concentraciones.
POTENCIAL DE DIFUSIÓN CON LA CÁMARA DE USSING Y MEMBRANA ARTIFICIAL
Vaciar 1 compartimiento, enjuagarlo con solución de Na2HPO4 0.1 M y llenarlo con esta. Medir la diferencia de potencial
Repetir usando soluciones sucesivamente más concentradas, enjuagar y reponer la solución (0.05 M) del compartimiento de referencia.
Recortar la membrana de diálisis al diámetro de la cámara de Ussing, aplicar vaselina al compartimiento de la cámara, colocar en 1 la membrana, centrada, y unir los compartimientos.
Sujetar la cámara, llenar los 2 compartimientos con solución de Na2HPO4 0.05 M, medir diferencia de potencial, con un electrodo de calomel en los compartimiento conectando los electrodos al multímetro
Resultados Concentración extacelular de KCl (mM).
Concentración intracelular de KCl (mM).
1
400
2.5
Relación
Log de C ext/C int
E° Teórico (mV) (Ecuación de Nerst).
E° Experimental (mV).
2.5x10-3
- 2.602
-150.91
-145.7
400
6.25x10-3
-2.204
-127.83
-142.7
5
400
0.0125
-1.903
-110.37
-126.60
10
400
0.025
-1.602
-92.91
-118
20
400
0.050
-1.301
-75.45
-112.1
50
400
0.125
-0.903
-52.37
-95.3
100
400
0.250
-0.602
-34.91
-86.3
400
400
1
0
0
-62.6
C ext/C int
Comparación de E° teorico y E° experimental 20 0 -3
-2.5
-2
-1.5
-1
-0.5
-20 0
E° (Mv)
-40 -60 -80 -100
Teórico y= 58x + 0 r= 1 Practico y= 32.76x – 65.62
r= 0.986
Teoricos Experimentales
-120 -140 log C ext/ C int
-160
Figura 2. Efecto de las concentraciones milimolares (mM) del cloruro de potasio (KCl) sobre la diferencia de potencial generada (potencial de difusión) en un huevo de gallina. En el eje X se tiene al logaritmo natural del cociente de las concentraciones intra y extracelualres del ion.(log C ext / C int ), en el eje Y la diferencia de potenciales en milivolts de color naranja datos teóricos y en color rojo datos experimentales.
Concentracion de K+ de la solucion LIC (Mm).
Concentracion de la K+ de la solucion del recipiente (Mm).
Relación
Log de ext/C int
140
Ringer
140
5
0.035
-1.455
140
10
0.071
-1.148
140
25
0.178
-0.749
140
50
0.357
-0.447
140
100
0.714
-0.146
C ext/C int
C
E° Teórico (mV) (Goldman).
E° Experimental (mV).
-40 -88.27
-69.91
-45.63
-27.27 -8.91
-31.5 -25 -12.7 -0.53 +3
Tabla 2. - Efecto de las concentraciones milimolares (mM) de sulfato de potasio (K₂SO₄) sobre la diferencia de potencial generada (potencial de lesión) en musculo gastrocnemio de rana.
COMPARACIÓN DEL E° TEORICO Y EL E° EXPERIMENTAL POTENCIAL DE LESION
-1.6
-1.4
-1.2
-1
-0.8
-0.6
-0.4
-0.2
Teorico 20 Ecuacion de Goldman 0y = 60.66x - 0.130 0 R² = 1
E° (mv)
-20 -40 -60
Teorico Practico
-80
log Ce/Ci
PRACTICO y = 28.24x + 8.938 -100 R² = 0.981
Figura 3. Efecto de las concentraciones milimolares (mM) del sulfato de potasio (K2SO4) sobre la diferencia de potencial generada (potencial de lesión) en musculo gastrocnemio de rana. (E°) representa la diferencia de potencial de membrana en milivolts, (log Ce/Ci) al logaritmo natural del cociente de las concentraciones intra y extracelualres de los iones.
DISCUSIÓN El potencial de difusión en el huevo, debido a su composición, su membrana es sumamente permeable al K+ de esta forma, como los iones de K+ están presentes en gran concentración dentro de la célula, éstos tienden a difundirse de dentro hacia fuera de la membrana a favor de su gradiente de concentración, y esto se observa teóricamente como experimentalmente, la concentración extracelular se vuelve menos negativa se debe al ligero exceso de K+ y la intracelular se vuelve mas negativa por la ligera deficiencia del K+. La difusión de los iones K+ fuera de la membrana del huevo origina una diferencia de potencial eléctrico, positiva afuera y negativa dentro. Tanto mas K+ se difunda a favor de su gradiente de concentración mayor será la diferencia de potencial, a concentraciones milimolares pequeñas de KCl extraceluar se genera mayor diferencia de potencial ya que se alcanzara mas rápido el equilibrio disminuyendo la diferencia de potencial. Sin embargo llegara un punto cuando la diferencia de potencial será 0 la fuerza eléctrica que arrastra al K+ al interior de la célula es igual a la fuerza química que arrastra los iones de K+ fuera de la célula y este potencial recibe el nombre de potencial de equilibrio y este equilibrio se calcula mediante la ecuación de Nerst. En la figura 2 se observa el efecto de las concentraciones extracelular e intracelular sobre la diferencia de potencial, al comparar los resultados teóricos con los prácticos se observa que difieren mayormente en el dato 5, y al observar la ecuación de la recta difieren mucho, esto lo podemos a atribuir que al hacer el experimento no se contaba con la misma temperatura ya que nos encontrábamos aproximadamente a 21 °C este factor afectaría directamente a la pendiente de la recta, también otro factor influye a la pendiente es que la permeabilidad del huevo no es infinita. En la ordenada también se observa una gran diferencia los factores que pueden influir en esta son que el huevo a pesar de enjuagarlo muy bien quedan proteínas cargadas en la membrana, estas cargas afectan directamente la diferencia de potencial, otro factor influyente es el potencial de electrodo. En el potencial de lesión al musculo gastrocnemio de rana, contiene iones K+, Na+ y Cl- en su interior por la solución de LIC estos contribuirán al potencial de membrana pero en cuanto mayor es la concentración de una clase de ion en particular y mayor la permeabilidad de la membrana a este ion tanto mayor es su importancia en la determinación del potencial en este caso es al ion K+. Utilizamos soluciones extracelulares de K2SO4 y el ion SO42- es un anión prácticamente impermeable, solo se considera la concentración del K+ extracelular, sin embargo, al utilizar la solución de Ringer extracelular la cual contiene iones K+, Na+ y Cl-el potencial no puede considerarse solo al ion K+ y esto se obtiene por la ecuación de Goldman. Sin embargo, al tener solo concentraciones del ion K+ extracelulares, y la membrana es mas permeable a este que a los otros iones podría decirse que bajo estas condiciones se espera obtener el potencial de membrana en reposo. En la grafica podemos observar que los valores experimentales y los valores teóricos difieren esto se puede atribuir a la temperatura ya que no se trabajo a la temperatura absoluta, que el musculo gastrocnemio contiene células de tejido conectivo, vasos sanguíneos y nervios, si al manipular el musculo lo rompemos puede quedar expuesto el LIC y el LEC combinándose ambos estos factores afectaran directamente el potencial de lesión y con esto la pendiente de nuestra grafica.
Conclusiones -
Determinamos el efecto del cambio de gradiente de concentración del ion [K+] sobre el potencial de difusión de la membrana testácea de huevo de gallina. Comprobamos que la membrana testácea tiene una permeabilidad selectiva al ion K+. Observamos que entre mayor sea la concentración extracelular del ion K+ de la membrana testácea, la diferencia de potencial se hará menos negativa hasta que el ion K+ llegue a su potencial de equilibrio. Determinamos el efecto del cambio del gradiente de concentración el ion [K+] sobre el potencial de lesión del musculo gastrocnemio de rana. Comprobamos que la membrana del musculo gastrocnemio de rana permeabilidad al los iones K+. La diferencia de potencial de la membrana interna y externa del musculo gastrocnemio de rana por su potencial de lesión predice el potencial de membrana para múltiples iones que atraviesan la membrana.
Bibliografía
Alva S. C., Ávila V. G., Barrera S. J., Chuc M. E., Escalona C. G. N., Franco C. M., García. R. M., Guarneros B. E., Ortiz B. M. R. E., Pacheco R. J., Paniagua C. N., Ramírez S. J. E., Villanueva B. I., Zamudio H. S. R., 2001. Manual de laboratorio de fisiología general (Q.F.I), 6ª Ed. Edit. Escuela Nacional de Ciencias Biológicas. Instituto Politécnico Nacional, México, D.F. Koeppen, B. M., Levy, M. N., Stanton, B. A., 2006. Berne Y Levy Fisiología. 4ª Ed. Edit. Elsevier, España. Martin, C. E., 2006. Fundamentos de fisiología. Edit. Paraninfo Rothstein, M. J., Roy, H. S., Wolf, S., 2005. Manual del especialista en rehabilitación. Edit. Paidotribo Strand, L. F., 1982. Fisiologia humana: un enfoque hacia los mecanismos reguladores. Ed. Médica Panamericana Fisiología humana 4 edicion editoria medica panamericana España 2009 Silverthorn Dee unglaub Tratado de nutrición composición y calidad de los alimenos angel gil 2010 2 edicion editorial panamericana españa
