PRINCIPIOS DE FARMACOLOGIA Y TOXICOLOGIA. Dr. Julio C. Almanza Pérez
PRACTICA 4 ABSORCION. INFLUENCIA DE LA VIA DE ADMINISTRACION EN LA CONCENTRACION PLASMATICA DE UN FARMACO.
LICENCIATURA EN BIOLOGIA EXPERIMENTAL. ALUMNOS: CRUZ RODIGUEZ FRANCISCO GÓMEZ ZÚÑIGA ANDREA HERNANDEZ GARCIA GUADALUPE ELISA DÍAZ ESCORCIA FREEDDY DORANTES ARREOLA ARELY ALCALA VARGAS FRANCISCO FLORES VICENTE OMAR ANTONIO
09 DE JUNIO DEL 2014
Introducción Las diferencias de magnitud de los procesos farmacocinéticos (absorción, distribución y biotransformación) entre individuos y en el mismo individuo a lo largo de su vida, determinan que tanto los niveles de concentración plasmática y la permanencia de un fármaco en el organismo, sean la causa de la intensidad y duración del efecto clínico obtenido. Para muchos fármacos se ha determinado un margen o ventana o límites (mínimo y máximo) de concentraciones plasmáticas, que en la mayoría de los individuos de una población permiten obtener el efecto terapéutico deseado con un mínimo riesgo de efectos indeseables dosis-dependientes (Flórez J, 1997). La utilidad de la farmacocinética en la práctica clínica, reside en que permite calcular las dosis y el intervalo de dosificación de un fármaco a fin de poder lograr las concentraciones plasmáticas que se desean alcanzar para un individuo, en particular para lograr el efecto clínico deseado (Katsung B, 2010).
Para muchos fármacos como por ejemplo los antihipertensivos o los cardiotónicos como la digoxina, no es necesario efectuar cálculos farmacocinéticos, porque para manipular el plan de administración (dosis e intervalo) a fin de obtener el efecto terapéutico buscado se toma como referencia la magnitud de un efecto farmacológico observable que en el primer caso es la presión arterial y en el segundo caso es el efecto de toxicidad extracardíaca (Ritschel WA, 1985). En cambio para otro tipo de fármacos como pueden ser los antiepilépticos o los antibióticos aminoglucósidos, el método anterior no da resultado. Esto se debe porque el efecto terapéutico es difícil de evaluar debido a que no disponemos de parámetros clínicos o efectos terapéuticos observables y no se puede saber si continuar con el régimen de dosificación, o si por el contrario, este debe ser modificado. En estos casos, el esquema terapéutico está orientado a lograr una concentración plasmática predefinida (Rowland M, 1995). Esta concentración plasmática se ubica entre la concentración máxima (Cmax) y la concentración mínima (Cmin) de la ventana terapéutica, y la misma ya es conocida de antemano para muchos fármacos. El margen terapéutico para fármacos que ejercen un efecto clínico se obtiene mediante una valoración clínica cuidadosa de la respuesta farmacológica de un número suficiente de individuos seleccionados de forma apropiada. Para los agentes antimicrobianos, el margen terapéutico se establece en base a un parámetro farmacodinámico estático que es la concentración inhibitoria mínima (CIM) para las bacterias susceptibles (Zinsberg G, 2002). Las variaciones específicas de la respuesta farmacológica de muchos fármacos, pueden ser atribuidas a diferencias en su biodisponibilidad sistémica (cantidad de medicamento absorbido y velocidad del proceso de absorción). Éste fenómeno está asociado a la forma farmacéutica y a la vía de administración empleada cuando el medicamento se administran por vía oral o parenteral no intravenosa (Heinz L, 2000)
Principios de Farmacología y Toxicología /Practica No. 4
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Objetivos generales
Determinar la cantidad de sulfatizol sódico presente en el plasma sanguíneo de ratas, a diferentes intervalos de tiempo. Comparar las cinéticas de absorción del sulfatiazol sódico suministrado por diferentes vías de administración (intragastrica e intraperitoneal).
Objetivos Particulares
Conocer el manejo de ratas, como modelo experimental dentro de la farmacología. Conocer la técnica de punción cardiaca en ratas, para la obtención de sangre. Conocer la concentración del sulfatiazol sódico en el plasma sanguíneo de rata por técnica foto colorimétrica.
Material y Métodos Se emplearon 2 ratas hembras de la cepa Wistar las cuales se marcaron para su identificación, rata 1 (vía intragastrica) y rata 2 (vía intraperitoneal), cabe señala que la vía de administración de la rata 2, fue una modificación a lo dictado por el manual de prácticas, que manifestaba el uso de la vía subcutánea. A este equipo le correspondió el tiempo 60 (T60 = 60 minutos) para la vía intragastrica y el tiempo cero (T0 = 0 minutos) para la vía intraperitoneal. El tiempo estuvo distribuido en los diferentes equipos, como se muestra en la tabla 1.
Tabla 1. Intervalos de tiempo en la administración de sulfatiazol sódico en ratas por la vía intragastrica e intraperitoneal. Tiempo Vía Intragastrica Vía intraperitoneal (minutos) T0 3 2 T15 1 3 T30 6 5 T45 5 1 T60 2 6 En la tabla1 se muestran los diferentes tiempos de administración del sulfatiazol sódico por las 2 vías empleadas, así como el número de equipo correspondiente a cada uno de los tiempos. (Nuestro equipo fue el numero 2). Ya distribuido los tiempos de administración, el equipo preparo los carriles de dilución, esto con ayuda de una gradilla metálica y 8 tubos de ensayo, que fueron divididos en 2 lotes (4 tubos de cada lote) etiquetando los tubos por número y vía de administración, agregando a los dos primeros tubos de las diferentes vías, 9 ml de agua destilada con pipetas de 10 ml para mayor precisión y exactitud. Se procedió a la administración de 2ml de sulfatiazol sódico a la rata 2 (que correspondía al tiempo cero y vía intraperitoneal) e inmediatamente se le sacrifico con Principios de Farmacología y Toxicología /Practica No. 4
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pentobarbital sódico vía intraperitoneal, por punción cardiaca se extrajo 1 ml de sangre (empleando una jeringa de 5 ml de calibre) y se depositó en el tubo 1 del carril de dilución, se disecto y se extrajeron por completo hígado, corazón, cerebro y riñones, mismos que fueron colectados y envueltos en trozos de papel aluminio, y depositados dentro de un tubo de ensayo de plástico para llevarlos al ultracongelador. Esto correspondió a la segunda modificación hecha al protocolo, pues se aprovechó los órganos de ambas ratas, para evitar el sacrifico de otros especímenes para su obtención y procesado de órganos en la próxima práctica. Después se llevó acabo la técnica modificada Bratton-Marschall (ver más adelante) tomando una alícuota de 1 ml de la muestra del tubo 1, con ayuda de pipetas de 1ml para mayor precisión y exactitud y depositado en un tubo 2 que se le añadió 15 ml de agua destilada y 4 ml de ácido tricloroacetico (CCl3COOH) al 15 % . Con ayuda de un embudo de vidrio y papel filtro, se filtró el contenido del tubo 2, colectándolo en otro tubo (tubo 3) después se procedió a realizar la técnica de coloración, tomando una alícuota de 5 ml del tubo 3, también se le añadió 1 ml de nitrito de sodio (NaNO2) al 1%, (esto fue el tubo 4) después de transcurridos 3 minutos se añadió a ese mismo tubo 1 ml de sulfamato de amonio ((NH4)2S04 ) al 0.5 % Naftiletilendiamina al 1 %, después se filtró y con ayuda de una celda y un fotocolorímetro se procedió a su lectura a 545 nm de longitud de onda. Se realizó exactamente para la rata 1 (correspondiente al tiempo 60 y vía intragastrica) en esta rata en particular se tuvieron dificultades en cuanto a la punción cardiaca, ya que no se realizó cuando el corazón aun bombeaba sangre, por lo cual se disecto de manera rápida y se extrajo la sangre a corazón abierto, otra de las particulares que presento la rata, fue el que se encontró una masa fibrosa (posiblemente un tumor benigno) que cubría casi en su totalidad al corazón de la rata. De igual manera se procedió a la dilución, coloración y lectura de las muestras que en la rata 2. Resultados Por grupo obtuvimos las absorbancias a 545 nm para las dos vías administradas a diferentes tiempos tal como se muestra en la tabla 1. TABLA 1. ABSORBANCIA A DIFERENTES TIEMPOS; VIA INTRAGASTRICA E INTRAPERITONEAL
Tiempo
VIA INTRAGASTRICA VIA INTRAPERITONEAL
Abs 545 nm 15 30 45 60 15 30 45 60
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0.026 0.028 0.025 0.016 0.067 0.048 0.03 0.015
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Utilizando la curva de calibración para sulfatiazol sódico (GRAFICA 1.) se determinó la concentración plasmática del sulfatiazol sódico administrado en µg/5mL y usando un factor de dilución de 40 para obtener la concentración en µg/Ml, como se observa en la Tabla 2.
CURVA PATRON A B S O R B A N C I A
1 0.9 0.8 0.7 0.6 0.5 0.4 0.3 0.2 0.1 0
y = 0.023x + 0.0074 R² = 0.9998
CURVA PATRON Lineal (CURVA PATRON)
0
10
20
30
40
50
CONCENTRACIÓN µg/5mL
GRAFICA 1. CURVA DE CALIBRACIÓN PARA SULFATIAZOL SÓDICO
TABLA2. CONCENTRACION PLASMATICA DE SULFATIAZOL SODICO (µg/mL) A DIFERENTES TIEMPOS
Via de admon.
Intragastrica
Intraperitoneal
Tiempo
Abs 545 nm
g/ 5ml
Factor de dilucion
µg/ ml
15
0.026
0.405405405
30
0.028
0.675675676
45
0.025
0.27027027
10.81081081
60
0.016
-0.945945946
-37.83783784
15
0.067
5.945945946
237.8378378
30
0.048
3.378378378
45
0.03
0.945945946
37.83783784
60
0.015
-1.081081081
-43.24324324
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16.21621622 27.02702703
40
135.1351351
40
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Discusión Las sulfonamidas se administran por vía oral, intravenosa, intraperitoneal y tópica. Se absorben en el aparato digestivo y alcanzan una concentración mayor en líquido extraplasmático. Se distribuyen fácilmente en todos los tejidos atravesando la barrera placentaria y hematoencefálica. Se deben emplear al menos dos de estas vías para poder tener una comparación de la absorción del compuesto con respecto de la otra vía (Sumano L.H, Ocampo C., 1997). El sulfatiazol se une alrededor del 60-70 % a las proteínas plasmáticas, la fracción de sulfas libre es la que está disponible para su distribución en el organismo. En general el volumen de distribución de las sulfonamidas es de 0.3 – 0.8 l/ kg. Se acetilan en el hígado en mayor porcentaje y se excretan principalmente por los riñones. Ordinariamente las concentraciones en riñones son superiores a las plasmáticas, mientras que en la piel, hígado y pulmones son ligeramente inferiores. El Sulfatiazol Sódico se clasifica dentro del grupo de las sulfas de absorción y excreción rápida (Félix B.G, 2005). Habitualmente las sulfamidas se administran por vía oral y ocasionalmente por vía intravenosa (sulfadiazina, cotrimoxazol o sulfatiazol sódico) y tópica como la sulfadiazina argéntica. Las sulfamidas que se absorben por vía digestiva lo hacen con rapidez en el estómago e intestino delgado alcanzando tras una dosis de 2 g una concentración en la sangre de 50-100 g/ml tanto las de acción corta o intermedia como las de acción prolongada (comparado con nuestros resultados la concentración fue, relativamente más baja). Las sulfamidas tópicas se absorben parcialmente y pueden ser detectadas en la sangre. La distribución varía en función del comportamiento de cada compuesto, dependiendo de su unión a las proteínas y su metabolismo. En general, se distribuyen bien por todo el organismo y alcanzan concentraciones cercanas al 80% de los niveles séricos en el líquido sinovial, pleural o peritoneal. La concentración en el líquido cefalorraquídeo (LCR) de las sulfamidas de acción corta es del 30-80% de las correspondientes concentraciones plasmáticas (Skold O., 2000)
Conclusión Se determinó la cantidad de sulfatiazol sódico presente en el plasma de las ratas a diferentes intervalos de tiempo. Se compararon las cinéticas de absorción del sulfatiazol sódico suministrado por las vías de administración intrgastrica e intraperitoneal; y se observó que la vía intraperitoneal tiene mayor concentración que la via intragastrica. Cuestionario 1.
¿Cuál es la causa por la que se eligió tomar la muestra de sangre por punción cardiaca?
Por qué de este modo, obtenemos una mayor cantidad de muestra de sangre que de cualquier otra parte atómica de la rata. Como la punción fue a diferentes tiempos nos permite conocer la cantidad del fármaco que ha sido absorbido y transformado. Principios de Farmacología y Toxicología /Practica No. 4
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2.
¿Qué objetivo tiene adicionar a la muestra problema ácido tricloroacético al 15%?
El metabolito inactivo del ácido tricloroacético se une a las proteínas plasmáticas de un 71-88% desplazando a otros fármacos ácidos de su unión a proteínas. Y además si previamente se hidroliza la sangre por calentamiento con un ácido o una base, se comprueba al efectuar la administración que hay un aumento en la intensidad de la coloración, de donde se infiere que la hidrolisis ha liberado un producto conjugado. Precipita a las proteínas presentes en la sangre (Goodman G., 1981)
3.
Investigue cual es el fundamento de la técnica de Bratton- Marshall para sulfonamidas
Está basada en la disociación en medio acido de la parte aminada libre con el ácido nitroso yen la copulación subsiguiente del compuesto diazoico, resultante con la dimtilalfanaftilamina, el Naftol, el timol o la naftil diclorhidrato de etilenodiamina, lo que da una coloración roja purpurea fácilmente valorable por colorimetría. Esta reacción es tan sensible que según Marshall se muestra positiva en diluciones de una parte de sulfonamida en veinte millones de partes de agua. Las aminas libres en los compuestos, reaccionan con el nitrito de sodio formándose una sal en un medio acido, luego, este compuesto forma un complejo con N-1-napthylenediamine dyhydrochloride (NEDA) dando como resultado una coloración purpura (Goodman G. 1981) 4.
Investigue como se determina el factor de dilución para este método analítico
El factor de disolución para este método es de 40, el cual proviene de la multiplicación de los dos factores de disolución presentes en el método analítico, es decir, en el paso número uno, nos indican mezclar 1 ml de sangre con 9 ml de agua destilada para constituir la muestra, en este punto tenemos un factor de dilución de 1/10; en el paso dos nos indica que debemos tomar 1 ml de la muestra anterior y se mezcló con 15 ml de agua destilada y 4 ml de ácido tricloroacetico cuyo factor de dilución es de 1/20. Si multiplicamos ambos factores tenemos los factores de dilución manejados: (1/10)*(1/20)=1/200 Si obtenemos el inverso del mismo: (1/200)-1=200 Finalmente, lo dividimos entre los 5 ml pertenecientes a la curva de calibración, tenemos: 200/5= 40 (Flores J.2007)
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Bibliografía
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Sumano L.H, Ocampo C.; Farmacología Veterinaria, Ed. McGraw-Hill, México 1997 pp 234, 245, 256 Felix B.G; Manual de Practicas de Farmacología, Escuela Nacional de Enfermería y Obstetricia, UNAM, 2005 capitulo 5 Skold O. Sulfonamide resistance: Mechanisms and trends. Drug Resist Updat 2000; 3: 155-60. Goodman G. (1981) Las bases farmacológicas de la terapéutica; editorial Panamericana, 8° edición; Mexico: pp 23-27 Flores J.; Farmacologia Humana; editorial Elsevier; sexta edición; Madrid; pp. 58-60
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