FECHA 23/5/12 GRUPO 9 SUBGRUPO ɛ
PRACTICA G: CROMATOGRAFÍA DE GASES. OBJETIVOS: Determinar el contenido porcentual de limoneno en una muestra Parte A: Evaluar la Influencia de la temperatura en la separación de una mezcla de sustancias. Parte B: Determinar el contenido porcentual de limoneno en una muestra, utilizando los métodos de patrón interno y calibración directa. Comparar los resultados obtenidos por ambos métodos. METODOLOGÍA EXPERIMENTAL: Materiales y equipos:
Pipeta automática de volumen variable Tips para pipeta de 100 µL Microjeringa para GC de 10 µL (con topes) Matraces aforados de 10.00 mL
Patrón: aceite esencial de naranja 100% puro (limoneno: 95% (v/v))
Patrón interno: anisol (“purum” ≥99.0%)
Alcohol etílico para análisis (99.5%(v/v)) Etanol comercial para el lavado del material Muestra: Aceite esencial de limón
Cromatógrafo: Hewlett Packard 4890D
Condiciones de trabajo:
Detector: Ionización de llama (FID) Gas portador: Nitrógeno Atenuación en el cromatógrafo: OFF Range: 9 Temperatura del inyector: 150ºC Temperatura del detector: 250ºC Columna: o Fase estacionaria: HP-5 (5%fenil- 95%dimetilpolisiloxano) o Largo 15m o o o
Diámetro Interno 0.53mm Temperatura máxima: 320ºC No polar
Procedimiento experimental: Las disoluciones que se inyectaron se prepararon de la siguiente manera: Disolución Patrón
Estándar Interno (µL)
0 1
Aceite esencial de naranja (µL) 0 25
100 100
Disolvente (Alcohol etílico) Completar 10 mL Completar 10 mL
2 3 Muestra
50 100 100
100 100 100
Completar 10 mL Completar 10 mL Completar 10 mL
RESULTADOS: Concentración de limoneno %(v/v) en la muestra
Calibración directa Patrón interno
̅
R1 60.6023
R2 79.5015
R3 80.1961
R4 75.3228
R5 59.4723
CV
55.5648
54.7002
55.7425
56.2300
56.7128
DISCUSIÓN: La cromatografía de gases presenta gran aplicación en la determinación cuantitativa de compuestos volátiles y su principal ventaja frente a otras técnicas es la posible determinación de varios analitos en forma simultánea. El registro obtenido se denomina cromatograma y el mismo representa Señal analítica vs. Tiempo. En primera instancia se evaluó la influencia de la temperatura en la cromatografía de gases. Para ello se obtuvieron tres cromatogramas a diferentes temperaturas (60, 90 y 130ºC) y se pudo observar lo siguiente: Con la disminución de la temperatura aumentan los tiempos de retención de los analitos en estudio y se produce un ensanchamiento de los picos. En el cromatograma a 130ºC los picos presentan tiempos de retención muy pequeños y próximos entre sí, solapándose y no obteniéndose una resolución para el posterior estudio. Las temperaturas de 60ºC y 90ºC pueden ser utilizadas para la obtención de cromatogramas de buena resolución, prefiriéndose el de 90ºC por tener tiempos de retención más adecuados a la práctica y picos más estrechos.
Una vez elegida la temperatura de trabajo para el horno donde se encuentra la columna cromatográfica, se procede a la obtención de las medidas. Para la determinación de limoneno en la muestra se utilizan dos métodos cuantitativos a fin de compararlos y determinar cual presenta los mejores resultados. En el método de calibración directa se realiza la curva de calibración graficando directamente Área del pico vs. Concentración del patrón. Posteriormente se inyecta la muestra y se determina su concentración por interpolación. A fin de obtener la curva de calibración de mejor ajuste se realiza inspección visual de los gráficos obtenidos, evaluación de R 2 y determinación de los residuos. En este caso se opta por el modelo cuadrático con ordenada en el srcen como el de mejor ajuste, debido principalmente a la distribución aleatoria obtenida en el gráfico de residuales realizado. El segundo método utilizado para la determinación de limoneno en la muestra se denomina método del patrón interno. Para su realización se adiciona a cada uno de los patrones y a la muestra una concentración conocida de una sustancia denominada patrón interno, que debe cumplir determinadas condiciones para su utilización: se debe resolver completamente en el cromatograma, debe eluirse cerca del analito en estudio y no debe estar presente en la muestra. En este caso se utiliza Anisol como patrón interno. Para la obtención de la curva de calibración se grafica área del pico de Limoneno/área del pico de Anisol vs. Concentración de Limoneno/concentración de Anisol. El grafico de mejor ajuste elegido para este caso es la representación lineal sin ordenada ya que presenta un valor de R 2 aceptable y la inspección visual se corresponde con el modelo. Aunque no es el que presenta la mejor distribución aleatoria de residuales es el modelo más sencillo, y la sumatoria de los residuos presenta un valor aceptable. A fin de comparar ambos métodos cuantitativos se calcula el coeficiente de variación (CV) para cada uno de ellos, obteniéndose el menor valor para el método de patrón interno, siendo este el más preciso y por tanto el que arroja los resultados más confiables. Esto se explica porque la cromatografía de gases se encuentra muy afectada por pequeños cambios que puedan ocurrir en las condiciones de operación para cada una de las corridas. En el método de patrón interno, estas fluctuaciones se encuentran compensadas ya que todo factor que afecte la respuesta para el analito también afecta la respuesta obtenida para el patrón interno en forma proporcional. CONCLUSIONES: La temperatura afecta la separación de una mezcla de sustancias. Para elegir la temperatura de trabajo debe existir un compromiso entre la resolución obtenida y el tiempo para la obtención del cromatograma. En cromatografía de gases el método de patrón interno arroja mejores resultados que el método de calibración directa.
INTEGRANTES DEL EQUIPO:
Firma
Nombre
Firma
Firma
Firma
Nombre
Nombre
Nombre
Firma
Nombre
ANEXO Concentraciones Se consideran para todos los cálculos la concentración de patrón de limoneno 95% (v/v) y concentración de Anisol del 100% (v/v). C1 x V1 = C2 x V2 Disoluciones Patrón 0 1 2 3 Muestra
Concentración Analito % (v/v)de 0.0000 0.2375 0.4750 0.9500 ?
Concentración Patrón interno % de (v/v) 1.000 1.000 1.000 1.000 1.000
Áreas Estándares Blanco Disolución 1 Disolución 2 Disolución 3
Analito Estándar Interno Analito Estándar Interno Analito Estándar Interno Analito Estándar Interno
R1 ..... 190.9972 40.9734 169.1716 79.4936 166.4494 186.9296 203.8202
Repeticiones (áreas) R2 ..... 149.8910 40.6637 183.4969 71.9387 149.8362 181.4151 196.6938
R3 ..... 154.6489 41.7590 177.0176 93.0752 200.2690 171.1636 187.1404
MÉTODO DE CALIBRACIÓN DIRECTA
Estándares Blanco Disolución 1 Disolución2 Disolución 3
Promedio de Áreas del Analito 0 41.13203333 81.50250000 179.8361000
Concentración de Analito % (v/v) 0 0.2375 0.4750 0.9500
Modelo Lineal sin ordenada: 200 180
y = 185,159185x R² = 0,996341
160 140 120 a e r Á
100 80 60 40 20 0 0
0.2
0.4
0.6
0.8
1
Concentración %(v/v)
2
Aexperimental 0 41,13203333 81,5025 179,8361
Aregresión 0 43,9753064 87,9506129 175,901226
Residuales (Aexperimental – Aregresión) 0 -2,843273108 -6,448112875 3,93487425
Representación de Residuales: 6 4 2 0 1234 -2 -4 -6 -8
(Reciduales) 0 8,08420196 41,5781596 15,4832354 ∑ 65,145597
Modelo lineal con ordenada: 200 y = 189.669931x - 3.213907 R² = 0.997308
150
100
a e r Á
50
0 0
0.2
-50
Aregresión
0 41,13203333 81,5025 179,8361
-3,213907 41,8327016 86,8793102 176,972527
4 3 2 1
-2 -3 -4 -5 -6
0.6
0.8
1
Concentración %(v/V)
Aexperimental
0 -1
0.4
1234
Residuales (Aexperimental – Aregresión) 3,213907 -0,700668282 -5,376810225 2,86357255
(Reciduales)2 10,3291982 0,49093604 28,9100882 8,20004775 ∑ 47,9302702
Modelo cuadrático sin ordenada: 200 180
y = 33,294331x2 + 159,046358x
160 R² = 0,999780
140 120 100
a e r Á
80 60 40 20 0 0
0.2
0.4
0.6
0.8
1
Concentración %(v/V)
Aexperimental
Aregresión
0 41,13203333 81,5025 179,8361
0 39,6515184 83,0590535 181,142174
2 1.5 1 0.5 0 1234 -0.5 -1 -1.5 -2
Residuales (Aexperimental – Aregresión) 0 1,48051495 -1,55655348 -1,30607383
(Reciduales)2 0 2,19192451 2,42285874 1,70582884 ∑ 6,32061209
Modelo cuadrático con ordenada: 200
y = 33.294331x2 + 156.910688x + 0.542110 R² = 0.999798
180 160 140 120 100
a e r Á
80 60 40 20 0 0
0.2
0.4
0.6
0.8
1
Concentración %(v/V)
A
A
experimental
regresión
0 41,13203333 81,5025 179,8361
0,54211 39,6864068 82,5867202 179,655397
2 1.5 1 0.5 0 1234 -0.5 -1 -1.5
Residuales (Aexperimental – Aregresión) -0,54211 1,445626572 -1,084220232 0,180702673
(Reciduales)2 0,29388325 2,08983619 1,17553351 0,03265346 ∑ 3,5919064
Lineal sin ordenada Lineal con ordenada Cuadrática sin ordenada Cuadrática con ordenada
R2 0.996 0.997 0.999 0.999
Signo de residuales + + + -
+ + +
Dado el estudio para cada modelo, de los residuales, los R 2 y la inspección visual, se toma el modelo cuadrático con ordenada en el srcen como el modelo que mejor ajusta a los datos obtenidos particularmente por lo observado en los residuales donde existe mayor aleatoriedad de los mismos. Por lo tanto se usará este modelo para la realización de los cálculos posteriores. Área de las Muestras R1 R2 R3 R4 R5 107.8614 146.3322 147.7914 138.3344 105.6366 Concentraciones calculadas interpolando en curva de calibración % (v/v) 0.606023027 0.795015458 0.801961352 0.753228417 0.594723213 Concentraciones en la muestra %(v/v) 60.6023027 79.5015458 80.1961352 75.3228417 59.4723213
MÉTODO DE PATRÓN INTERNO:
Estándares Blanco Disolución 1 Disolución2 Disolución 3
Estándares Blanco Disolución 1 Disolución2 Disolución 3
Área de analito / área de patrón interno Repeticiones R1 R2 R3 0 0 0 0.242200227 0.221604288 0.235903096 0.477584178 0.480115619 0.46475091 0.917129901 0.922322411 0.914626665
Área de analito/ área de patrón interno 0 0.23323587 0.474150235 0.918026325
Promedios Concentración de analito/ concentración de patrón interno 0 0.2375 0.4750 0.9500
Modelo lineal sin ordenada: 1 o n r e t n i n ó r t
0.9
y = 0.973161x R² = 0.999593
0.8 0.7 0.6 0.5
p a a e r Á / o it l a n a a e r
0.4 0.3 0.2
Á
0.1 0 0
0.2
0.4
0.6
0.8
1
Conc analito/Conc patrón interno
yexperimental
yregresión
0 0,23323587 0,47415024 0,91802633
0 0,23112574 0,46225148 0,92450295
0.015
0.01
0.005
0 1234 -0.005
-0.01
Residuales (yexperimental – yregresión) 0 0,00211013 0,01189876 -0,00647663
(Residuales)2 0 4,4527E-06 0,00014158 4,1947E-05 ∑ 0,00018798
Modelo lineal con ordenada: 1 o n r e t n i n ó r t
0.9
y = 0.966819x + 0.004519 R² = 0.999666
0.8 0.7 0.6 0.5
p a a e r Á / o it l a n a a e r
0.4 0.3 0.2
Á
0.1 0 0
0.2
0.4
0.6
0.8
1
Conc analito/Conc patrón interno
yexperimental
yregresión
Residuales
0 0,23323587 0,47415024 0,91802633
0,004519 0,23413851 0,46375803 0,92299705
(yexperimental – yregresión) -0,004519 -0,00090264 0,01039221 -0,00497072
0.012 0.01 0.008 0.006 0.004 0.002 0 -0.002 -0.004 -0.006
1234
(Residuales)2 2,04214E-05 8,14763E-07 0,000107998 2,47081E-05 ∑ 0,000153942
Modelo cuadrático sin ordenada: 1 o n r e t n i n ó r t
0.9
y = -0,054803x2 + 1,014188x R² = 0,999920
0.8 0.7 0.6 0.5
p a a e r Á / o it l a n a a e r
0.4 0.3 0.2
Á
0.1 0 0
0.2
0.4
0.6
0.8
1
Conc analito/Conc patrón interno
yexperimental
yregresión
Residuales
0 0,23323587 0,47415024 0,91802633
0 0,23777842 0,46937437 0,91401889
(yexperimental – yregresión) 0 -0,00454255 0,00477586 0,00400743
0.006 0.004 0.002 0 1234 -0.002 -0.004 -0.006
(Residuales)2 0 2,06347E-05 2,28089E-05 1,60595E-05 ∑ 5,95031E-05
Modelo cuadrático con ordenada: 1 y = -0.054803x2 + 1.020741x - 0.001663 R² = 0.999927
0.8
o n r e t n i n ó r t a p a e r Á / o it l a n a a e r Á
0.6 0.4 0.2 0 0
-0.2
0.2
0.4
0.6
0.8
1
Conc analito/Conc patrón interno
yexperimental
yregresión
0 0,23323587 0,47415024 0,91802633
-0,001663 0,23767176 0,47082405 0,91858124
0.004 0.003 0.002 0.001 0 -0.001 -0.002 -0.003 -0.004 -0.005
1234
Residuales (yexperimental – yregresión) 0,001663 -0,00443589 0,00332619 -0,00055492
(Residuales)2 2,76557E-06 1,96771E-05 1,10635E-05 3,07933E-07 ∑ 3,38141E-05
Lineal sin ordenada Lineal con ordenada Cuadrática sin ordenada Cuadrática con ordenada
R2 0.99959 0.99967 0.99992 0.99993
Signo de residuales + + + + + +
+ -
Realizando la inspección visual de los gráficos obtenidos para cada uno de los modelos propuestos y teniendo en cuenta los valores de R2, es posible utilizar el modelo lineal sin ordenada para la realización de los cálculos ya que es una muy buena aproximación de los datos obtenidos. De todas maneras, el modelo que mejor ajusta es el cuadrático con ordenada, debido a la distribución aleatoria de los residuos y la menor sumatoria de los mismos.
Área limoneno Área anisol Área limoneno/area anisol Conc limoneno/conc analisol Conc limoneno en la muestra %(v/v)
R1 107.8614 199.4718 0.540735081
R2 146.3322 274.8948 0,532320727
R3 147.7914 272.4448 0.542463647
R4 138.3344 252.8004 0.547207994
R5 105.6366 191.4031 0.551906421
0.55564812
0.547001705
0.557424559
0.562299551
0.567127557
55.564812
54.7001705
55.7424559
56.2299551
56.7127557
