1- ‘¿Qué es y cual es el objetivo del fraccionamiento celular, la homogenización y la centrifugación diferencial? l fraccionamiento celular es una técnica bio!u"mica utilizada #ara se#arar los distintos org$nulos y com#onentes celulares #ara su estudio% &a técnica se inicia con la homogeneización% l tejido se tritura en un homogeneizador de manera !ue las células se com#rimen y se libera su contenido% &o !ue luego se hace con ese e'tracto es someterlo a diferentes centrifugaciones a diferentes velocidades y tiem#os, de manera !ue obtenemos fracciones enri!uecidas de los distintos org$nulos% (ara (ara obtener obtener org$nul org$nulos os celula celulares res intact intactos os el fracci fracciona onamie miento nto debe ser isotónico) isotónico) decir !ue la #resión osmótica o tonicidad tonicidad del amortiguador amortiguador debe corres#onder a la del interior de la célula, en las soluciones hi#otónicas los org$nulos estallar"an al ca#tar el agua, en cambio en una hi#ertónica se encoger"an% *es#ués de la homogenización se realiza una filtración gruesa a través de una gasa gruesa #ara eliminar restos de tejidos o células inta intact ctas as !ue !ue no hay hayan sido sido frac fracci cion onad adas as%% &a se#a se#ara raci ción ón de dich dichos os com#onentes se inicia con la centrifugación gradual, cuya velocidad se va aume aument ntan ando do #oco #oco a #oco #oco +e'#re +e'#resad sada a en mlt mlti# i#lo loss de la acel aceler eraci ación ón gravitaroria de la tierra% *e este modo los org$nulos se sedimentan en la sus#ensión una tras otra, de acuerdo con su tama.o y densidad% &os ncleos celulares sedimentan a una velocidad relativamente baja, si se decanta la ca#a su#erior y se sus#ende cuidadosamente el sedimento en un medi medio o isot isotón ónic ico o se obtie obtiene ne una una frac fracci ción ón enri enri!u !uec ecid ida a con con ncl ncleo eoss celu celula lares res,, sin sin emba embard rdo o #ued #ueden en habe haberr otros otros resto restoss celu celula lare ress como como el citoes!ueleto !ue re#resenta im#urezas% &as #art"culas de un tama.o y densidad menor !ue el ncleo se #ueden aisl aislar ar del sobre sobrenad nadan ante te de la #rim #rimera era cent centri rifu fugac gació ión n incre increme ment ntad ado o gradua gradualme lmente nte la veloci velocidad dad de la centri centrifug fugaci ación% ón% (ara (ara ello ello se re!uier re!uieren en centrifugas es#eciales !ue #ermiten obtener una a una las fracciones de las mitocondrias, las ves"culas membranosas y los ribosomas% l sobrenadante de la ultima centrifugación adem$s del amortiguador contiene el citosol con los com#onentes solubles de la célula% stos #rocesos se llevan a cabo a tem#eraturas bajas #ara retardar la acción degradativa de las enzimas liberadas y otros factores% / #esar de estas medidas de #recaución los organelos asilados se #ierden r$#idamente su actividad biológica% 0omogenización% onsiste en rom#er las células y liberar sus organelos usando una variedad de mecan mecanis ismo moss +mol +moles es,, #icar #icar,, trit tritura urarr, camb cambio ioss de #resi #resión, ón, cho!ue cho!ue osmótico, congelación y descongelación etc%
&as células se homogenizan en una solución isotónica, lo cual #reviene !ue se rom#a su membrana #or ósmosis con el #0 regulado y a tem#eraturas bajas #ara #revenir da.os enzim$ticos% &a homogenización es un #aso muy comn en la #re#aración de las muestras biológicas antes del an$lisis de $cidos nucle"dos y #rote"nas, o del estudio de las células, agentes #atógenos y otros objetos% omo resultado !ueda una #asta fina !ue consiste de las células y sus organelos #or se#arado% 2e refiere a rom#imiento de las células o tejido del cual #retende e'traer la organela o molécula de interés% entrifugación diferencial% n este método, el tubo de la centr"fuga es llenado inicalmente con una mezcla uniforme de la solución de la muestra, a través de la centrifugación se obtiene una se#aración de dos fracciones3 un #ellet !ue contiene la #art"cula sedimentada y un sobrenadante con la fracción no sedimentada de la solución% 4n #articular com#onente #uede terminar en el sobrenadante o en el #ellet, o #odr"a estar distribuido en ambas fracciones, de#endiendo de su tama.o y5o de las condiciones de centrifugación% l #ellet es una mezcla de todos los com#onentes sedimentados y esta contaminado con cual!uier #art"cula no sedimentada !ue estuviera en el fondo de el tubo% &as dos fracciones son recu#eradas #or decantación de la solución sobrenadante del #ellet% l sobrenadante #uede ser recentrifugado a altas velocidades #ara obtener una mayor #urificación con la formación de nuevo #ellet y sobrenadante% l #ellet #uede ser resus#endido en un #e!ue.o volumen y recentrifugado de#endiendo de lo !ue se desee se#arar% 6- ¿!ué son las r#m y las 7g8? buscar como se convierte de rm# a g 9:( la cantidad de vueltas !ue un cuer#o giratorio com#leta alrededor de su eje cada sesenta segundos% sta es la fórmula de conversión de la velocidad de centrifugación de r%#%m% +revoluciones #or minuto a g +es la fuerza centr"fuga relativa, e'#resada en g% (ara el c$lculo se debemos conocer el radio del rotor en cent"metros, #or lo !ue es im#rescindible calcular de nuevo esta relación #ara cada centr"fuga%
;- ¿Qué soluciones #ueden utilizarse en la homogenización !u"mica, cu$les son las ventajas y las desventajas de cada uno de ellos? 2e utilizan sustancias !ue #ueden da.ar directamente a la #ared celular , como3 2olventes organicos3 o es muy recomendable ya !ue causa un estrés muy fuerte en la celula% - ¿n la centrifugación diferencial se obtiene fracciones #uras? /!u" el homogenizado es centrifugado re#etidas veces a altas velocidades sedimentando #rogresivamente en #e!ue.as #art"culas% &a #rimera centrifugación es a @AA g #or 1A minutos, el cual sedimenta la fracción nuclear% ste #ellet contiene el ncleo celular intacto y tejido la #ró'ima se#aración es el sobrenadante #ost nuclear o #art"culas sus#endidas en el li!uido sobre el #ellet nuclear, el cual es transferido a otro tubo de centr"fuga y se centrifuga a 1A,AAA g #or ;A minutos en una centrifuga rerigerada% l material sedimentado se conoce como fracción mitocondrial, este contien mitocondrias y micro cuer#os la centrifugación diferencial se basa en la e'istencia de diferentes #art"culas en la sus#ensión !ue difieren en su densidad !ue la del medio% 2i se centrifuga en condiciones suaves, sedimentaran las #art"culas m$s densas #resentes y asi sucesivamente % #or lo tanto no se obtienen fracciones #uras, ya !ue en el #ellet han !uedado los organelos intactos mientras !ue en el sobrenadante esta una mezcla de fracciones de organelos%
B- Qué otras técnicas adicionales #ueden utilizarse #ara mejorar la #urificación de organelos celulares? Custifica la res#uesta% 4na vez realizado el #rimer #aso de homogenización se #ueden realizar varios #rocedimientos de #urificación como lo es la cromatograf"a, !ue se#ara los com#onentes individuales de una mezcla com#leja en distintas #orciones o fracciones% *es#ués de cada #aso de este ti#o, se utiliza un ti#o de an$lisis como #or ejem#lo una #rueba de #rote"nas de algn interés% 'isten tres ti#os de cromatograf"a3 / romatograf"a #or afinidad3 tiene una matriz aco#lada en forma covalente a una molécula !ue interactale modo es#ecifico con la #rote"nas de interés% stas se unen es#ec"ficamente a una columna de ti#o y #ueden ser liberadas #or un cambio en el #0 o mediante soluciones salinas concentradas% D Eiltración de gel3 se utilizan #ara se#arar #rote"nas en función de su tama.o% &a matriz consiste en diminutas microesferas #orosas% &a molécula de #rote"na es lo bastante #e!ue.a #ara ingresar en los orificios de las micro esferas se demoran y viajan con mas lentitud a través de la columna% Fntercambio iónico3 est$n llenas de #e!ue.as microesferas !ue tienen carga #ositiva o negativa, #or lo !ue retardan las #rote"nas con carga o#uesta% &a asociación de la #rote"nas con la matriz de#ende del #0 y la concentración iónica de la solución% Gambién e'iste la electroforesis !ue es cuando se a#lica un cam#o eléctrico a una solución !ue contiene una #rote"na, estas migraran en una dirección y a una velocidad !ue reflejan su tama.o y su carga neta% @- 2i se realiza la obtención de ncleos celulares, ¿an #uede realizarse fraccionamiento celular de este organero?¿!ué obtendr"a? 2i se #uede realizar el fraccionamiento de este org$nulo, teniendo cuidado necesario mediante una homogenización mec$nica o una centrifugación, lo !ue se #uede obtener es el *>/ de la células, este método es muy sencillo y comn adem$s de ser uno de los m$s ense.ados en el $rea de la bio!u"mica, H- ¿Qué efecto tiene la urea sobe las membranas celulares &a urea es una molécula #e!ue.a !ue #uede ser filtrada en el sistema renal, atraviesa f$cilmente las membranas celulares% /dem$s no afecta el #0 cuando se acumula, como ocurre con el amonio, y no es tó'ica% 4na limitante !ue #asa la
urea es !ue debe e'cretarse siem#re en soluciones, es decir, con cierto volumen de agua% Ia !ue la mayor"a de los amino$cidos en todos los tejidos van a ser transformados en glutamato a través de #rocesos de deaminacion este amino$cido se convierte en #ieza central del catabolismo de amino$cidos% s convertido enzim$ticamente en glutamato en casi todos los tejidos% J- ¿u$les son los colorantes vitales y !ué a#licación tiene?¿!ué ti#o de colorante es el acetocarm"n y cual es su fundamento !u"mico? 2on a!uellos !ue ejercen su acción en las #artes vivas de las células sin alterar su metabolismo, y #oniendo de relieve sus estructuras% 2on #referidos los colorantes vitales !ue son retenidos #or la célula durante el tiem#o necesario #ara #oder realizar la observación Colorantes vitales básicos Rojo neutro
s una sustancia soluble en agua% (uede ser administrada a los animales su#eriores #or v"a endovenosa o digestiva, en la #ro#orción del 1K) se a#lica diariamente varios cent"metros cbicos de la solución% (or la v"a digestiva se usa cuando se trata de estudiar la mucosa digestiva% Verde Jano
s también un colorante su#ravital, utilizado #ara el estudio de mitocondrios% 2e a#lica #or inmersión o inyección% &os mejores resultados se obtienen con sangre% n este caso se usa en una solución al 1 ' 1A AAA en suero fisiológico al A,JBK% 2e a#lica una gota en el #ortaobjeto con sangre fresca, y des#ués, se coloca un cubreobjeto% 4na observación minuciosa mostrar$ mitocondrios #rimero en los linfocitos y luego en los leucocitos granulares, hasta !ue todos !uedan te.idos% &a coloración dura varias horas, y la cor#oración #uede evitarse #oniendo vaselina en el borde del cubreobjeto% Azul Jano
s otro colorante su#ravital, !ue tiene iguales usos y se a#lica de idéntica forma !ue el verde Cano% Azul naftol
0a sido ocasionalmente usado como colorante vital% Violeta neutral
Giene #ro#iedades similares al rojo neutro, #ero ha tenido menos uso en trabajos microscó#icos% Colorantes vitales ácidos Alizarina roja S
2e ha usado como colorante vital #ara el tejido nervioso en #e!ue.os invertebrados% Púrpura brillante R
4sado como colorante vital #ara la levadura%
/zul try#an 2e em#lea disuelto en agua destilada, al 1K o mejor en suero fisiológico% 2e a#lica en inyecciones intra#eritoneales o subcut$neas, en la #ro#orción de A,B-1 cc de solución #or cada 6A gramos de #eso del animal% &as inyecciones se re#iten cada B d"as, hasta !ue el animal tome color azul% &a fijación se hace en formol al 1AK, y los cortes se realizan #or congelación . l acetocarmin es uno de los colorantes m$s antiguos, es insoluble en agua y alcohol, #ero soluble en medios alcalinos% &as moléculas del colornte reaccionan con com#onenetes celulares #or uniones no covantes ionicos, #uentes de hidrógeno, o covalentes% l #0 de la solución del colorante #uede determinar la e'tensión de la tinción mientras la reactividad de una molécula de colorante con tejidos es de#endiente a menudo de cambio%
Bibliografía Alberts, B. ( 2011, 3a ed.). introduccion a la biologia celular. Mexico D.F: Panamericana. Lodis, !. (201", #a. ed.). Biología Celular y molecular. B$enos Aires: %anamericana.
ht t ps : / / www. ec ur ed. c u/ Anex o: Col or ant es _v i t al es
im$genes tomadas htt#s355es%scribd%com5doc511;1JB6B;5Eraccionamiento-elular
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