Prinsip Kerja ELISA

Prinsip Kerja ELISA Pertama antigen atau antibodi yang hendak diuji ditempelkan pada suatu permukaan yang berupa microtiter. Penempelan tersebut dapat dilakukan melalui dua cara, yaitu penempelan secara non spesifik dengan adsorbs ke permukaan microtiter, dan penempelan secara spesifik dengan menggunakan antibody atau antigen lain yang bersifat spesifik dengan antigen atau antibodi yang diuji (cara ini digunakan pada teknik ELISA sandwich). Selanjutnya antibodi atau antigen spesifik yang telah ditautkan dengan suatu enzim signal (disesuaikan dengan sampel => bila sampel berupa antigen, maka digunakan antibodi spesifik , sedangkan bila sampel berupa antibodi, maka digunakan antigen spesifik) dicampurkan ke atas permukaan tersebut, sehingga dapat terjadi interaksi antara antibodi dengan antigen yang bersesuaian. Kemudian ke atas permukaan tersebut dicampurkan suatau substrat yang dapat bereaksi dengan enzim signal. Pada saat substrat tersebut dicampurkan ke permukaan, enzim yang bertaut dengan antibodi atau antigen spesifik yang berinteraksi dengan antibodi atau antigen sampel akan bereaksi dengan substrat dan menimbulkan suatu signal yang dapat dideteksi. Pda ELISA flourescense misalnya, enzim yang tertaut dengan antibodi atau antigen spesifik akan bereaksi dengan substrat dan menimbulkan signal yang berupa pendaran flourescense.

Berikut ini adalah contoh langkah kerja beberapa macam teknik ELISA, yaitu:

Pendeteksian antibody dengan ELISA indirect: 1.

Melapisi mikrotiter plate dengan antigen yang sudah dimurnikan dengan membiarkan

larutan berisi antigen menempel pada dinding/ permukaan selama 30-60 menit. 2. 3.

Membilas antigen yang tidak terikat dengan buffer. Melapisi sisi-sisi tertentuyang mungkin tidak spesifik dilekati oleh antigen dengan

protein yang tidak berhubungan/ tidak spesifik (seperti larutan susu bubuk) 4.

Membilas protein yang tidak melekat.

5.

Menambahkan sampel serum yang akan dideteksi antibodinya dan membiarkan

antibody spesifik untuk berikatan dengan antigen. 6.

Membilas antibody yang tidak terikat.

7.

Menambahkan anti-Ig yang akan berikatan pada daerah Fc pada antibody yang spesifik

(sebagai contoh, anti-rantai gamma manusia yang berikatan dengan IgG manusia). Daerah Fc pada anti-Ig akan berikatan secara kovalen dengan enzim. 8. 9.

Membilas kompleks antibody-enzim yang tidak terikat. Menambahkan substrat chromogenic: substrat yang tidak berwarna yang terikat ke

enzim akan dikonversi menjadi produk. 10. 11.

Inkubasi sampai muncul warna, dan Ukur dengan spectrometer. Jka semakin pekat warna yang dideteksi, maka makin besar

kadar antibody spesifik dalam sampel.

Pendeteksian antigen dengan ELISA sandwich: 1.

Melapisi mikrotiter plate dengan antibodi yang sudah dimurnikandimurnikan dengan

membiarkan larutan berisi antigen menempel pada dinding/ permukaan selama 30-60 menit. 2. 3.

Membilas antibodi yang tidak terikat dengan buffer Melapisi sisi-sisi tertentuyang mungkin tidak spesifik dilekati oleh antigen dengan

protein yang tidak berhubungan/ tidak spesifik (seperti larutan susu bubuk) 4. 5.

Membilas protein yang tidak melekat. Menambahkan sampel yang akan dideteksi antigennya dan membiarkan antibodi untuk

berikatan dengan antigen spesifik dari sampel. 6.

Membilas antigen yang tidak terikat.

7.

Menambahkan antibody yang telah terlabeli dengan enzim dan bersifat spesifik untuk

epitope yang berbeda pada antigen sampel, sehingga terbentuk sandwich. 8.

Membilas antibody-enzim yang tidak terikat.

9.

Menambahkan substrat chromogenic: substrat yang tidak berwarna yang terikat ke enzim

akan dikonversi menjadi produk. 10. 11.

Inkubasi sampai muncul warna. Ukur dengan spektrofotometer. Jika semakin pekat warna yang terdeteki, maka makin

besar kadarantigen spesifi dalam sampel.

Sugiono, stefanus. 2011. Enzyme-linked Immunosorbent Assay. Teknik Analisa ELISA