Universidad de Alcalá Departamento de Bioquímica y Biología Molecular Bioquímica. 2º de Farmacia. Curso 2010/11
Problemas de cinética enzimática 1.- En un cultivo de bacterias, la velocidad de reacción de un enzima E fue de 20 µg/min para una concentración de sustrato de 3 mM. Si la concentración de sustrato es igual o superior a 7 mM, la velocidad no supera los 40 µg/min. Al añadir un inhibidor competitivo, la velocidad de la reacción fue de 20 µg/min para una concentración de sustrato de 8 mM. Calculese la Km, la Vmax y la Ki para este enzima, sabiendo que la concentración de inhibidor añadido es de 6 mM.
a) Vmax: Si para una [S] ≥ 7 mM la velocidad es 40 µg/min, la Vmax=40 µg/min b) Km: ½ Vmax será 20 µg/min, como esta velocidad se consigue con una [S] = 3 mM, la Km = 3 mM Otra forma es utilizando la ecuación de Michaelis: Vmax [S]
V=
Km + [S]
40 =
20 x 3 Km + 3
c) Como es un inhibidor competitivo Vmax = Vmax´= 40 µg/min y ½ Vmax´= 20 µg/min. Esta velocidad se alcanza con una [S] de 8 mM en presencia de inhibidor, por lo tanto Km´= 8 mM. Además sabemos que Km = α Km´ ó
Km´ =
1+
[I] Ki
Km
Por lo tanto Ki = 3,6 mM
2.- Las velocidades iniciales a varias concentraciones de sustrato para una reacción catalizada por un enzima hipotético son: [S] (moles/l) 5x10-2 5x10-3 5x10-4 5x10-5 5x10-6 5x10-7
V (µmoles/min) 0.25 0.25 0.25 0.20 0.071 0.0096
a) ¿Cuál es la velocidad máxima para esta reacción?
b) ¿Por qué la velocidad inicial permanece constante a una [S] mayor de 5x10-4 M c) ¿Cuál es la concentración de enzima libre para una [S] de 5x10-4 M? d) ¿Cuál es la Km de la enzima? e) Calcular la velocidad inicial para [S]=1x10-6 y [S]=1x10-1 f) Calcular la concentración de producto formado en los cinco primeros minutos de reacción utilizando 10 ml de una disolución de sustrato 2x10-3 M
a) Vmax = 0.25 µmol/min, ya que por encima de [S] de 5x10-4 no aumenta b) Porque todos los enzimas está ocupados transformando un sustrato c) Cero, todos los enzimas ocupados, a esa [S] se da la Vmax d) Empleando la ecuación de Michaelis, utilizando la velocidad 0.20, 0.070 ó 0.0096 y sus correspondientes [S], como sabemos la Vmax, obtenemos una Km 0 1,25 x 10-5 moles/l
e) Sabiendo la Km y Vmax, aplicamos Michaelis utilizando esas [S] y obtenemos: [S]=1x10-6
una V = 0,018 µmol/min
[S]=1x10-1
una V = 0,25 µmol/min
f) A [2x10-3] la V = Vmax = 0,25 µmol/min En 5 min 0,25 x 5 = 1,25 µmol Tenemos 10 ml de sustrato, luego 1,25 µmol / 10-2 l = 1,25 x 102 µmol/l
3.- A partir de los siguientes datos de una reacción enzimática, determinar de que manera está actuando el inhibidor. Determinar la Km para el enzima y la Ki para el complejo enzima-inhibidor. ¿Cuál es la velocidad máxima? [S] mM 2 3 4 10 15
µg producto/h (sin inhibidor) 139 179 213 313 370
µg producto/h (6 mM inhibidor) 88 121 149 257 313
Se calculan los inversos de [S], producto sin inhibidor y producto con inhibidor, se representa y = 1/V frente a x = 1/[S] Sin inhibidor: La línea corta en y = 2x10-3, entonces 1/Vmax = 2x10-3, luego Vmax = 0,5x103 µg/h La línea corta en x = -2x10-1, entonces -1/Km = -2x10-1, luego Km = 5 mM
Con inhibidor: Como es un inhibidor competitivo la Vmax es la misma en presencia y ausencia de inhibidor. La línea corta en x = -1,1x10-1, entonces -1/Km = -1,1x10-1, luego Km=9 mM La Ki se calcula como en el ejercicio 1 Ki = 7,5 mM
4.- Habiéndose conseguido aislar de Salmonella tyfpimurium una enzima que cataliza la reacción A→P, se decidió hacer un estudio estructural y cinético de dicha enzima: [A] mM
1,00
0,55
0,25
0,20
V(mmol P/ min)
1,00
0,71
0,50
0,41
V (nmol P/min) con J
0,66
0,41
0,25
0,20
donde J es un inhibidor de E cuya influencia como tal se quiere estudiar. [J] = 0,25mM a) Km de la enzima estudiada para A, y Vmax para la transformación A--P en presencia de E b) Que tipo de inhibidor es J?. Calcula la Ki. c) Cuál seria el efecto sobre la Vmax de la enzima, de un aumento de la concentración de J?
Se calcula siguiendo el mismo procedimiento que el problema 4 a) Vmax = Vmax’ = 1.66 mmol P/min b) KM = 0.5 mM c) KM’ = 1.25 mM (con inhibidor) d) Ki = 0.16 nM (Inhibición Competitiva)
5.- La cinética de una enzima viene determinada como función de la concentración de sustrato en presencia y ausencia del inhibidor I. [S], Mx10-5 V(µmol/min) sin inhibidor -4
V(µmol/min) con inhibidor 10 M
0.3
0.5
1.0
3.0
9.0
10.4
14.5
22.5
33.8
40.5
2.1
2.9
4.5
6.8
8.1
a) Calcular la Km y la Vmax en presencia y ausencia de inhibidor b) Que tipo de inhibidor es? Calcular la Ki
Se calcula siguiendo el mismo procedimiento que el problema 4 a) Vmax = 50 µmol/min b) Vmax’ = 9.5 µmol/min c) KM = 1.1x10-5 M d) Ki = 2.3x10-5 M (Inh. No Competitiva)
