METODE PRAKTIKUM A. TEMPAT DAN TANGGAL PRAKTIKUM
Praktikum ini dilakukan dilakukan pada tanggal tanggal desember 2013, jam 09.30 WIB di Laboratorium Laboratorium Terpadu FKIK UIN Syarif Hidayatullah Jakarta. B. Alat dan Bahan Alat :
-
1 set (perangkat) alat SDS-PAGE
-
Labu ukur 1000 ml, 100 ml
-
Beaker glass
-
Erlenmeyer
-
Pipet tetes
-
Pipet volume+bulb
-
Mikropipet
-
Tube
-
Hotplate
-
Batang pengaduk
-
Sterefoam
-
Shacking inkubator
-
Timbangan analitik
-
Spatula
Bahan :
-
0,1006 gram standar gelatin sapi
-
0,1009 gram standar gelatin babi
-
Aquadest
-
0,0307 gram enzim pepsin
-
100 ml Larutan buffer asetat pH 4,525
-
Larutan stock Acrylamide/Bis Acrylamide Acr ylamide (30% T, 2,67 % C (100 mL dH2O, 29,2 gram acrylamide dan 0,8 gram N’ N’-bis-methyleneN’ -bis-methylene- acrylamide)
-
Larutan Resolving Buffer : 1,5 M Tris-HCl, pH 8,8 (siap pakai dari BioRad)
-
Larutan Stacking Buffer : 0,5 M Tris-HCl, pH 6,8 (siap pakai dari BioRad)
-
Sample Buffer (siap pakai sari BioRad)
-
10 x Running buffer (electroda buffer) : Tris-Glyeine-SDS, pH 8,3 (siap pakai.
-
Ammonium persulfate; 10 % (selalu dibuat pada saat akan dipakai)
-
Larutan monomer (volume total untuk 10 ml)
-
Resolving gel : 50 µl 10% APS + 5 µl TEMED (tambahkan dH2O sebagai overlay).
-
Stacking gel : 50 µl 10% APS + 10 µl TEMED
Prosedur Kerja A. Preparasi Sampel (Standar gelatin sapi dan gelatin babi)
1. Dibuat larutan buffer asetat 25 mM sebanyak 100 mL pH 4,5 dalam labu ukur 100 mL. 2. Ditimbang sebanyak 0,1006 gram standar gelatin sapi, 0,1009 gram standar gelatin babi, dan 0,0307 gram enzim pepsin didalam becker glass. 3. Di dalam becker glass, dilarutkan enzim pepsin sebanyak 0,0307 gram dengan 3 mL buffer asetat pH 4,5 menggunakan pipet volume. 4. Dari masing-masing gelatin sapi dan gelatin babi ditambahkan 7 mL buffer asetat menggunakan pipet volume dan larutan enzim pepsin dalam erlenmeyer dan ditutup dengan alumunium foil. 5. Larutan gelatin sapi serta larutan enzim pepsin dan larutan gelatin babi serta larutan enzim pepsin dimasukkan kedalam alat shacking inkubator untuk di inkubasi selama 12 jam dengan 400 RPM suhu 37 oC.
B. Persiapan Pembuatan Media Gel
1. Larutan stock Acrylamide/Bis Acrylamide (30% T, 2,67 % C) : -
Ditimbang sebanyak 29,2 gram acrylamide dan 0,8 gram N’ N’ -bismethylene- acrylamide.
-
Dilarutkan dalam 100 mL dH 2O lalu difilter dan disimpan pada 4oC.
-
Hindarkan dari cahaya dan penyimpanan maksimum 30 hari.
2. Larutan Resolving Buffer : 1,5 M Tris-HCl, pH 8,8 (siap pakai dari BioRad) : -
Sebanyak 18,15 gram Tris, dilarutkan dalam 75 mL dH 2O. Lalu diatur pH 8,8 dengan 6N HCl.
-
Ditambahkan dH2O hingga volume totalnya 100 mL dan disimpan pada suhu 4oC.
3. Larutan Stacking Buffer : 0,5 M Tris-HCl, pH 6,8 (siap pakai dari BioRad) -
Sebanyak 6 gram Tris, dilarutkan dalam 60 mL dH 2O. Lalu diatur pH 6,8 dengan 6N HCl.
-
Ditambahkan dH2O hingga volume totalnya 100 mL dan disimpan pada suhu 4oC.
4. Sample Buffer (siap pakai dari BioRad) 3,55 ml
Deionized water
1,25 ml
Stacking buffer
2,5 ml
Glycerol
2,0 ml
10 % SDS
0,2 ml
0,5 % (w/v) bromophenol blue
9,5 ml
Total volume
Simpan pada suhu ruang. Penggunaan : tambahkan 50 ml β-mercaptoethanol ke dalam 950 ml sample
buffer sebelum digunakan. Encerkan sample paling sedikit 1:2 di dalam sample buffer dan dipanaskan pada suhu 95oC selama 4 menit.
5. 10 x Running buffer (electroda buffer) : Tris-Glyeine-SDS, pH 8,3 (siap pakai) -
Ditimbang sebanyak 30,3 gr Tris + 144,0 gr + glycine + 10,0 gr SDS.
-
Dilarutkan dalam 1000 ml dH2O. Tidak perlu penyesuaian pH.
-
Disimpan pada suhu 4oC.
6. Ammonium persulfate (APS); 10 % (selalu dibuat pada saat akan dipakai) -
Ditimbnag 100 mg ammonium persulfate
-
Dilarutkan dalam 1 ml dH2O.
C. Proses Pembuatan Media
Siapkan larutan monomer (volume total untuk 10 ml) dengan mencampurkan bahan-bahan (lihat tabel 1), kecuali TEMED dan 10% APS.
Tabel 1. Formulasi gel untuk 10 ml volume total % gel
DDH2O (ml)
30% Degassed
Gel buffer
Acrylamid/Bis
10%
w/v
SDS (ml)
(ml) 4%
6,1
1,3
2,5
0,1
5%
5,7
1,7
2,5
0,1
6%
5,4
2,0
2,5
0,1
7%
5,1
2,3
2,5
0,1
8%
4,7
2,7
2,5
0,1
9%
4,4
3,0
2,5
0,1
10 %
4,1
3,3
2,5
0,1
11 %
3,7
3,7
2,5
0,1
12 %
3,4
4,0
2,5
0,1
13 %
3,1
4,3
2,5
0,1
14 %
2,7
4,7
2,5
0,1
15 %
2,4
5,0
2,5
0,1
16 %
2,1
5,3
2,5
0,1
17 %
1,7
5,7
2,5
0,1
Resolving Gel Buffer – 1,5 M Tri-HCl pH 8,8 Stacking Gel Buffer – 0,5 M Tri-HCl pH 6,8
Media gel terdiri dari separating gel dan stacking gel dibuat dengan cara mencampur bahan yang tertera pada Tabel 2. Resolving gel dibuat dengan konsentrasi 14 % sedangkan stacking gel dibuat dengan konsentrasi 5%. Tabel 2. Komposisi larutan media gel Bahan
Volume (ml) Resolving gel (10 ml)
Stacking gel (5 ml)
Larutan Buffer
2,86
1,25
SDS 10%
0.1
0,05
Akrilamid
4,7
0,85
APS 10%
20 µl
100 µl
TEMED
20 µl
10 µl
DDH2O
2,7
2,7
Hal
pertama
yang
dilakukan
dalam
pembuatan
media
gel
yaitu
mempersiapkan alat pencetak gel. Dua lempeng kaca direkatkan dan diberi pemisah dari plastik. Kemudian digunakan sebagai cetakan gel (mini slab gel). Gel yang dibuat terlebih dahulu yaitu gel bawah (resolving gel). Buffer, SDS 10%, akrilamid, dan akuades dicampur dan diaduk dalam gelas piala. Kemudian ditambahkan TEMED dan terakhir APS sambil tetap diaduk. Campuran dimasukkan dalam cetakan gel (mini slab gel) dengan menggunakan mikro pipet sampai sekitar 1 cm dari atas lempengan. Perlu diperhatikan ketika pemasukan larutan gel ke dalam slab jangan sampai terbentuk gelembung karena akan mengganggu jalannya proses separasi. Bagian yang tidak diisi gel, diberi akuades untuk meratakan gel yang terbentuk dan menghindari kontak udara dengan gel. Kemudian gel dibiarkan mengalami polimerisasi selama sekitar 30 menit. Lapisan air di atas gel dikeringkan dengan tisu. Gel atas (stacking gel) dibuat setelah gel bawah terbentuk. Buffer, SDS 10%, akrilamid, dan akuades dicampur dan diaduk dalam gelas piala. Kemudian ditambahkan TEMED dan terakhir APS sambil tetap diaduk. Larutan gel atas di pipet dan dimasukkan ke dalam mini slab di atas resolving gel hingga mencapai puncak plat. Kemudian sisir dipasang dengan cepat untuk menghindari terbentuknya gel sebelum sisir dimasukkan. Ketika memasukkan sisir diperlukan kehati-hatian agar tidak ada udara yang terperangkap. Setelah gel terbentuk, sisir diangkat sehingga terbentuk sumur-sumur. Masukkan sampel ke dalam tiap sumur dengan pipet tip kecil, dengan volume 100 mikron. Hubungkan sumber listrik DC, jalankan elektroforesis pada 200 volt. Untuk SDS-PAGE waktu elektroforesis umumnya 35 menit pada 200 V.
D. Proses Pemisahan
Plate gel ditempatkan ke dalam chamber elektroforesis, kemudian diisi dengan running buffer . Sebanyak 15 μl sampel dimasukkan ke dalam masing-masing sumur (well ) dengan menggunakan pipet mikro, sedangkan marker dimasukkan sebanyak 10 μl. Kemudian alat elektroforesis dihubungkan dengan arus listrik bertegangan 140 volt (dinaikkan menjadi 160 volt apabila sudah mencapai separating
gel ) dan besar arus 100 ampere. Running dilakukan selama sekitar 1 jam sampai protein standar mencapai batas akhir yaitu kira-kira 1 cm dari ujung gel. Setelah selesai, aliran listrik dimatikan dan katup elektroda dilepaskan. Kemudian plate gel dipindahkan dari chamber elektroforesis.
E. Proses Pewarnaan SDS-PAGE
Gel dikeluarkan dari plate-nya dengan cara membuka plate kaca yang tipis menggunakan spatula yang pipih. Kemudian dialiri air sampai gel terlepas dari plate kaca yang tebal. Gel diletakkan dalam wadah dan ditambahkan dengan akuades. Kemudian gel dibilas dengan menggunakan akuades sebanyak lima kali. Selanjutnya ditambahkan larutan stain (Coomassie Blue R 250) sampai terendam dan diinkubasi semalam. Larutan stain dibuang dan diganti dengan larutan penghilang warna (larutan destain). Kemudian gel dapat disimpan dalam bentuk kering atau direndam dalam air. Apabila pita-pita belum terlihat jelas, dapat dilakukan pewarnaan perak ( silver staining ).
Referensi : Anonymous. 2004. Mini Protein 3 Cell-Instruction manual. Bio Rad, USA.
