PROTEÍNAS Carol Montaño; Suajil Bermudez Laboratorio de Bioquímica, Departamento de Química Facultad Experimental de Ciencias y Tecnología. ni!ersidad de Carabobo, "alencia # "ene$uela
RESUMEN El ob%eti ob%eti!o !o de la presen presente te pr&cti pr&ctica ca 'ue caract caracteri eri$ar $ar cualit cualitati ati!am !ament entee la presen presencia cia de alguno algunoss amino&cidos con base en los resultados de las reacciones de identi'icaci(n de )a*aguc+i, antoproteíca, -cre/0osen+eim, )ul'idaci(n, Biuret y 1in+idrina2 se reali$( la +idrolisis de la caseína y luego se determin( mediante cromatogra'ía en papel los amino&cidos presentes en la caseína por medio de los 'actores de retenci(n 30'4, obtenindose como resultado los siguientes 0' 35555554 tanto para la muestra de caseína como para los patrones cisteína y arginina respecti!amente.
I. INTROUCCI!N Los
amino&cidos
son
las
miles de clases de proteínas di'erentes, que !arían unidades
en tama?o desde pptidos relati!amente peque?os
estr estruct uctur ural ales es m&s m&s simp simple less 3mon 3mon(m (mer eros os44 que que
+asta polímeros enormes de masas moleculares
componen las estructuras de las proteínas, est&n
del orden de los millones ;7=.
constituidas por un grupo 3167 o 1684, un grupo
Todas las proteínas, tanto si pro!ienen de los
carboxilo 3C996 o C99/4 unido al carbono 7 de
sistemas bacterianos m&s antiguos como de las
la molc molcul ula, a, un &tom &tomo o de +idro +idroge geno no y
una una
'ormas de !ida m&s comple%as, est&n construidas
cadena radical tambin conocida como grupo 0.
a partir del mismo con%unto de 7@ amino&cidos,
Esta :ltima es especí'ica para cada amino&cido amino&cido y
unidos de 'orma 'orma co!alente co!alente en secuencias secuencias lineales
contribuyen a la identi'icaci(n de los mismos ;<=.
carac caracte terí ríst stic icas as.. Debi Debido do a que cada cada uno uno de los los
La presencia de estos grupos químicos en la
amino&cidos tiene una cadena lateral propia que
estructura de los amino&cidos es lo que determina
determi determina na sus propie propiedade dadess química químicas, s, se puede puede
que que esta estass mol molcul culas as inte inter! r!en enga gan n en un gran gran
considerar este grupo de 7@ amino&cidos como
n:mero de reacciones químicas ;<=.
precursores de la estructura proteica ;7=.
Las Las
>rot >roteí eína nass
son son
las
macr acromol omolc cul ulas as
n gran n:mero de reacciones son utili$adas
biol(gicas m&s abundantes y est&n presentes en
para la detecci(n de proteínas. Debido a la
toda todass las las clu clula lass y en toda todass las las parte partess de las las
comple comple%id %idad ad de las molcula molculass protei proteicas cas y a la
mismas mismas.. Las proteí proteínas nas tambi tambin n presen presentan tan una
di'icultad de obtenerlas en 'orma pura y aislada,
gran !ariedad2 en una clula se pueden encontrar
estas pruebas son usadas sabiendo que identi'ican
grupos químicos especí'icos de la molcula de
Luego de completarse las distintas reacciones, se
proteína o m&s general toda!ía, para las cadenas
registraron las obser!aciones, las cuales se muestran
laterales de los amino&cidos encontrados en todas
en la tabla 17.
Ta%la N&'( )ustancias y cantidades empleadas
las proteínas. -sí, por e%emplo, el reacti!o de Aillon da una reacci(n positi!a cuando reacciona
en
con los grupos 'en(licos de los amino&cidos
amino&cidos.
presentes en la proteína ;8=.
las
general, las que podrían esperarse para los compuestos que contienen grupos aminos y
Su)tan*ia
Su)tan*ia
Su)tan*ia
Su)tan*ia
Rea**i+n
Rea**i+n de
rea**i+n de
Rea**i+n
de
/anto0rote1*a
A*re23
Sul4ida*i+n
de Biuret
Ro)emeim
-rginina
Feni la lani na <
Tri pt ('a no <
Ci st eína
Biuret
7
< Cisteína
Caseína <
Caseína
< Caseína
Caseína
8
< Tirosina
Tirosina
< Cisteína
< -rginina
< rea
< 679
< 679
< 679
< 679
grupo que pueda estar presente, su're sus propias .
de
<
reacciones características
identi'icaci(n
Rea**i+n Sa,a-u*i
grupos carboxilos, adem&s de cualquier otro
;8=
de
Su)tan*ia Tu%o
Las reacciones de amino&cidos libres, son en
reacciones
< 679 @,7mL de 1a96
@,mL 6198
@,mL de
1a96 <@
1a96
Cantidad
<@ y
concentrado y
Formalde+ido
y @,7mL de
<@ y
empleada
@,7mL de
7mL de 1a96
y
nitrato de
@,mL de
/na'tol
GA.
plomo <.
Cu)9
En la presente pr&ctica se reali$aron ensayos
@,@.
@,.
para el reconocimiento de amino&cidos, +idrolisis de la caseína comercial y la identi'icaci(n de sus amino&cidos mediante cromatogra'ía en papel.
Ta%la N&5( 9bser!aciones re'erentes a las reacciones de identi'icaci(n de los amino&cidos. Amino6*ido
Rea**ione) de Identi4i*a*i+n
7Prote1na7
II. MATERIA"ES # M$TOOS
A-ua
Sa,a-u*i
/anto0rote1*a
A*re23
Sul4ida*i+n
Biuret
Ro)emeim
>ara caracteri$ar cualitati!amente los distintos amino&cidos a tra!s de ensayos químicos se lle!aron
a
cabo reacciones cualitati!as de
identi'icaci(n y se reali$( la determinaci(n de los amino&cidos
de
la
caseína
mediante
cromatogra'ía en papel por medio de los 0'
-rginina
1aran%a
/
/
Incoloro 3/4
/
Cisteína
Fuerte 3H4 -marillo
/
Incoloro 3/4
Jris 3H4
/
Tirosina Fenilalanina Tript('ano Biuret rea
>&lido 3/4 Ael(n 3/4 / / / /
1aran%a 3H4 Incoloro 3/4 / / /
/ / 9cre 3H4 / /
/ / / / /
/ / / -$ul 3H4 Incoloro
Caseína
/
-marillo Fuerte
Aarr(n
Jris 3H4
3/4 Incoloro
679
Incoloro
3H4 Incoloro
Claro 3H4 Incoloro
Incoloro
3/4 Incoloro
3/4
3/4
3/4
3/4
3/4
obtenidos experimentalmente. Reacciones
de
Reconocimiento
de
los
Aminoácidos )e sometieron los distintos amino&cidos y la
Hidrolisis de la caseína comercial
)e prepar( un aparato de re'lu%o con 7@mL de 679, 7@ mL de 6Cl y 3@,@@K±@,@@@<4 g de
caseína con di'erentes reacti!os distribuidos de la
caseína,
manera que se indica en la tabla 1<, a ensayos
>osteriormente, se reali$( la prueba de Biuret
cualitati!os, siguiendo el procedimiento descrito en
para constatar que la reacci(n de +idrolisis +abía
;=
.
calentando
durante
8
minutos.
'inali$ado. Luego, la soluci(n 'ue 'iltrada y sta
caseína +idroli$ada se utili$( para las pruebas de identi'icaci(n
de
amino&cidos
y
para
la
cromatogra'ía en papel. Cromatografía en Papel
)e
reali$(
empleando
la
patrones
cromatogra'ía de
en
-rginina,
papel
Cisteína,
Tirosina, Jlicina, Fenilalanina y la Caseína +idroli$ada, utili$ando como 'ase m(!il 'enol.
9i-ura N&'( 0eacci(n de )a*aguc+i para la arginina 304, cisteína 3C4, tirosina 3M4, y agua. Como puede obser!arse, esta prueba 'ue positi!a 'rente a la arginina, puesto que sta posee
Ta%la N&8( Distancias recorridas por los
el grupo guanidino.
patrones y la muestra.
9rente7Amino6*ido7Prote1n
i)tan*ia
a
:d±<'=*m
Frente Cisteína -rginina Caseína
<<,G K,G 8, ,8
9i-ura N&5( Jrupo guanidino. La reacci(n es la siguiente
III. ISCUSI!N E RESU"TAOS Reacciones
de
Identificación
de
Los
Aminoácidos
En la tabla 17 se muestran los resultados obtenidos
en
las
di'erentes
reacciones
de
identi'icaci(n de los amino&cidos, las cuales se %usti'ican a continuaci(n La reacci(n de )a*aguc+i se basa en la identi'icaci(n
del
'undamenta en la
grupo
guanidino
condensaci(n del
y
se
grupo
Los amino&cidos restantes de la prueba resultaron
negati!os
puesto
que
stos
no
guanidino con /na'tol en un medio altamente
presentan el grupo guanidino para tornar positi!a
oxidante, con la posterior producci(n de un
este ensayo.
compuesto de color ro%o o naran%a intenso ;<=. En la siguiente 'igura se muestra el resultado de la reacci(n
La reacci(n antoproteíca permite identi'icar amino&cidos que tienen el anillo bencnico en su estructura, tales como la 'enilalanina o la tirosina. En esta reacci(n el amino&cido reacciona con &cido nítrico concentrado, ocurriendo la nitraci(n
del anillo arom&tico y como productos 'inales de
cuidado, una gota de &cido sul':rico concentrado
la reacci(n se 'orman nitroderi!ados de color
de manera que no se me$cla y se 'ormen dos
amarillo ;<=
'ases
;<=
. Esta >rueba result( positi!a para el
tript('ano, como puede obser!arse en la siguiente 'igura
Cuando los amino&cidos con la característica estructural ya mencionada, se calientan en presencia de &cido nítrico concentrado, producen compuestos nitrados de color amarillo, a los
9i-ura N&>( 0eacci(n de -cre/0osem+eim
cuales el &lcali como el +idr(xido de amonio,
para el tript('ano 3Trp4, cisteína 3Cys4 y agua.
con!ierten en sus sales respecti!as de color
:NO ENCONTRE MAS E ESTA REACCION SI ENCUENTRAS PON"O=
naran%a, como se puede obser!ar en la siguiente 'igura
La reacci(n de )ul'idaci(n es una prueba para identi'icar amino&cidos a$u'rados y las proteínas que los contienen, y se reconocen por la 'ormaci(n de una coloraci(n negra o gris mediante la siguiente reacci(n ;=
9i-ura N&8( 0eacci(n antoproteíca para la tirosina 3Tyr4, 'enilalanina 3>+e4 y agua. El anillo bencnico de la 'enilalanina no tiene la su'iciente capacidad para tornar positi!a esta prueba, al igual que el agua. La reacci(n de -cre/0osem+eim se lle!a a cabo
a?adiendo
unas
gotas
de
'ormol
o
'ormalde+ido a la soluci(n y despus, con
Como se puede obser!ar en la 'igura 1, la reacci(n result( positi!a para la cisteína ya que esta reacci(n se basa en la separaci(n mediante un &lcali, del a$u're de los amino&cidos, el cual al
La reacci(n dar& resultado positi!o si el
reaccionar con una soluci(n de acetato de plomo,
compuesto anali$ado posee al menos dos enlaces
'orma el sul'uro de plomo ;=.
peptídicos en su estructura
;=
. En el caso del
ensayo reali$ado en la pr&ctica el resultado di( negati!o ya que no se calent( para completar la reacci(n, esto se puede obser!ar en la siguiente 'igura
9i-ura N&?( 0eacci(n de )ul'idaci(n para cisteína 3Cys4, arginina 3-rg4 y agua.
>or :ltimo, la reacci(n de Biuret es una reacci(n general para la identi'icaci(n de pptidos yNo proteínas. )e le da ese nombre debido a que el
9i-ura N&@( 0eacci(n de Biuret para urea, agua y el reacti!o de Biuret.
color que se produce en esta reacci(n, es similar
Cuando se calienta la urea a
al de la condensaci(n de dos molculas de urea
descompone trans'orm&ndose en un compuesto
367 1OCO1674,
llamado PbiuretP, el cual en presencia de Cu7H en
conocido
en
alem&n
como
Biuret. )e 'undamenta en la 'ormaci(n de un
soluci(n alcalina 'orma un comple%o color
compuesto a$ul !ioleta por la reacci(n del ion
!iol&ceo ya que reconoce los enlaces peptídicos
c:prico con el pptido o proteína en medio
de las proteínas, esta prueba no es especí'ica para
alcalino. Este ion 'orma un enlace co!alente
identi'icaci(n de proteínas con dos o m&s enlaces
coordinado con los enlaces peptídicos ;=
peptídicos ;=. )e obtu!o la caseína comercial +idroli$ada mediante
la
desnaturali$aci(n
de
sta.
Entendindose por desnaturali$aci(n de una
que mantienen estable el p6 de los 'luidos
proteína,
biol(gicos4.
la
prdida
de
la
con'ormaci(n
tridimensional nati!a de la misma, prdida que
- la caseína +idroli$ada obtenida, se reali$aron
suele ir acompa?ada de un descenso en la
pruebas de identi'icaci(n de amino&cidos las
solubilidad 3las cadenas polipeptídicas de la
cuales 'ueron antoproteíca, -cre/0osem+eim,
proteína desnaturali$ada se agregan unas a otras y
)ul'idaci(n y Biuret2 los resultados se muestran
'orman un precipitado que se separa de la
en la siguiente 'igura
disoluci(n4.
Durante
el
proceso
de
desnaturali$aci(n se rompen las interacciones dbiles que mantienen estable la con'ormaci(n pero se mantienen los enlaces co!alentes del esqueleto polipeptídico, es decir, se pierden las estructuras secundaria, terciaria y, en su caso, cuaternaria, pero permanece intacta la secuencia de amino&cidos. La desnaturali$aci(n puede ser pro!ocada
por di'erentes causas o agentes
9i-ura N&( 0eacciones de )ul'idaci(n,
desnaturali$antes de tipo 'ísico o químico ;K=. En
la
pr&ctica
se
lle!(
acabo
la
desnaturali$aci(n por aumento de temperatura y
-cre/0osem+eim,
antoproteíca
y
Biuret,
reali$adas a la caseína +idroli$ada.
alteraci(n del p62 al aumentar la temperatura se
Como puede obser!arse en la tabla 17 las
pro!oca una mayor agitaci(n molecular que +ace
reacciones resultaron positi!as, excepto para
que las interacciones dbiles que mantienen
biuret ya que al desnaturali$ar la proteína se
estable la con'ormaci(n de la proteína terminen
pierden los enlaces peptídicos que unen a los
por ceder con la consiguiente desnaturali$aci(n.
amino&cidos, quedando solo la secuencia de
Con la alteraci(n de p6 se causa la !ariaci(n en
amino&cidos o estructura primaria y como se di%o
el grado de ioni$aci(n de distintos grupos
anteriormente la prueba de biuret solo resulta
'uncionales 3carboxilo, amino, +idroxilo, etc.4
positi!o
implicados
peptídicos en la molcula. El resultado positi!o
en
interacciones
dbiles
que
cuando
presencia
antoproteíca
de
y
enlaces
estabili$an la con'ormaci(n. Estas !ariaciones
para
pro!ocan la rotura de dic+as interacciones 3sobre
0osem+eim demuestra que en la caseína existe la
todo enlaces i(nicos y tambin puentes de
presencia de amino&cidos a$u'rados, anillos
+idr(geno4 y por lo tanto la desnaturali$aci(n
bencnicos y tript('ano respecti!amente.
3debido a ello son tan importantes los tampones
)ul'idaci(n,
+ay
-cre/
I. CONC"USIONES /
/
;8= 0odrígue$ , 3
racticas
)e pudieron caracteri$ar cualitati!amente los
de Bioquímica. Editorial Limusa. Cuarta edici(n,
distintos amino&cidos a tra!s de reacciones
Axico. >&ginas U
químicas. )e pudo reali$ar la cromatogra'ía en papel para la identi'icaci(n de los amino&cidos contenidos en
/
la caseína. )e corrobor( que la desnaturali$aci(n de una proteína ocurre a altas temperaturas y alteraciones de p6 ocurriendo de esta manera el rompimiento
/
de enlaces peptídicos de la proteína. En la cromatogra'ía de papel los componentes de una me$cla se separan en base a una distribuci(n di'erente entre la 'ase m(!il y la 'ase estacionaria.
;= -rmado -., Tapi$quent, A., )alamanca L V
Aoy
B.
37@
Juía
del
Estudiante/
Laboratorio de Bioquímica 3Q-9/U@<4. "alencia. Facultad Experimental de Ciencias y Tecnología. >&gina G. ;=
-mino&cidos
8
;En
Disponible
línea=
;Citado
en
internet
+ttpNNSSS.sisoyyomismo.'iles.Sordpress.comN7@ <7N@7Nprc8aroteínas ;En Línea= Espa?a ;Citado 8
Disponible
en
internet
. RE9ERENCIAS BIB"IORD9ICAS
+ttpNNSSS.biono!a.org.esNbiocastNdocumentsNte
;<= ni!ersidad del ulia. 0eacciones de
[email protected]' .
Identi'icaci(n de -mino&cidos y >roteínas. ;En línea=
"ene$uela
Disponible
;Citado
8
en
Internet
+ttpNNSSS.'c!.lu$.edu.!eNimagesNstoriesNcatedras NbioquimicaN@5reacciones5aminoC 8-rincipios de Bioquímica. Editorial C9. Cuarta edici(n, Axico. >&ginas RR/RG.