PROTOCOLO DE VALIDACIÓN VALIDACIÓN DEL MÉTODO ANALÍTIC ANALÍTICO O PARA LA DETERMINACIÓN DETERMINACIÓN DE ÁCIDO ACETILSALICÍLICO ACETILSALICÍLICO EN ORINA Clave:
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TABLA DE CONTENIDO
I.
OBJETIVO ................................................... ............................................................................. ........................................... .................
II.
ALCANCE ................................................... ............................................................................. ........................................... .................
III.
RESPONSABILIDADES ................................................... ........................................................................ .....................
IV.
PARAMETROS DE VALIDACIÓN
V.
METODOLOGIA
VI.
CRITERIOS DE ACEPTACION
VII.
REFERENCIAS BIBLIOGRAFICAS
VIII.
ANEXOS
2
…………….
2
…………….
2
…………….
2
……………………………… ………………………
……………………………… ………………………… ………………... ..
3
7
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Elaboró Nombre: Perla Ivonne Hernández Correa Firma: Fecha:14/08/20014
Revisó: Supervisor Nombre: Saúl de Jesús Díaz Ramírez Firma: Fecha:16/08/2014
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Autorizó: Asesor Nombre: Hernan I. Cortes Firma: Fecha:
PROTOCOLO DE VALIDACIÓN DEL MÉTODO ANALÍTICO PARA LA DETERMINACIÓN DE ÁCIDO ACETILSALICÍLICO EN ORINA Clave:
I.
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OBJETIVO
Evaluar estadísticamente, la confiabilidad del método espectrofotométrico utilizado para la cuantificación del ácido acetil salicílico en orina; mediante una validación parcial de acuerdo a la NOM-177-SSA1-2013.
II.
ALCANCE
Este protocolo de validación es aplicable al método analítico para la determinación de ácido acetil salicílico en orina mediante espectrofotometría UV.
lll. RESPONSABILIDADES Es responsabilidad del asesor del módulo del Laboratorio de Biofarmacia del área de Farmacia clínica autorizar el presente protocolo. El supervisor es responsable de la realización, revisión y aplicación de este protocolo. Así como de supervisar que cada actividad indicada en este documento se lleve a cabo conforme lo indicado en este documento. Los químicos analistas tienen la responsabilidad de conocer y aplicar los procedimientos para la validación del método analítico conforme lo indica este protocolo.
IV. PARÁMETROS DE VALIDACIÓN Linealidad Precisión (Repetibilidad y Reproducibilidad) Exactitud Límite de cuantificación Límite de detección
Elaboró Nombre: Perla Ivonne Hernández Correa Firma: Fecha:14/08/20014
Revisó: Supervisor Nombre: Saúl de Jesús Díaz Ramírez Firma: Fecha:16/08/2014
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V. METODOLOGÍA Método analítico a validar: Ver anexo 1 Reactivos
Fe (NO3)3 HNO3
HCl HgCl2
Equipos Centrifuga
Instrumentos
Espectrofotómetro UV
1. LINEALIDAD DEL MÉTODO La linealidad es la capacidad de un método analítico, en un intervalo de trabajo, para obtener resultados que sean directamente proporcionales a la concentración del compuesto en la muestra. Deben ser evaluadas un mínimo de 3 curvas de calibración. Para evaluar la linealidad del método, preparar 3 soluciones patrón en orina a partir de 3 pesadas independientes, como se indica en la tabla siguiente: ml de la solución patrón de salicilato de sodio en orina (1000 µg/ml)
ml de orina diluida (añadir con bureta)
-----------------------0.1 0.5 1 2 3 5
10 9.9 9.5 9 8 7 5
Concentración (µg/ml) Blanco 10 50 100 200 300 500
TABLA 1. Soluciones para la curva estándar. Elaboró Nombre: Perla Ivonne Hernández Correa Firma: Fecha:14/08/20014
Revisó: Supervisor Nombre: Saúl de Jesús Díaz Ramírez Firma: Fecha:16/08/2014
Autorizó: Asesor Nombre: Hernan I. Cortes Firma: Fecha:
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Solución estándar de referencia de salicilato de sodio en orina con concentración de 1000 µg/ml: Pesar con exactitud 50 mg de salicilato de sodio y depositarlos en un matraz volumétrico de 50 ml, disolver totalmente en 20 ml de orina libre de medicamentos diluida 1:10 con agua destilada y llevarla al aforo con la misma orina.
Procedimiento: 1) Preparar la Solución estándar de referencia de salicilato de sodio en orina con concentración
de 1000 µg/ml. 2) Realizar las soluciones para la curva estándar, descritas en la tabla 1. 3) Realizar el método analítico para la determinación de ácido acetilsalicílico, en el Anexo 1. 4) Leer a una longitud de onda 530 nm.
2. PRECISION Preparar por quintuplicado las soluciones a utilizar como muestras control de acuerdo a la siguiente tabla: Muestra control
MCB MCM MCA
ml de la solución patrón de salicilato de sodio en orina o agua (1000 µg/ml)
ml de orina diluida o agua (añadir con bureta)
Concentración (µg/ml)
-----------------------0.3 2.5 4.0
10 9.7 7.5 6
Blanco 30 250 400
TABLA 2. Preparación de muestras control. Solución estándar de referencia de salicilato de sodio en agua destilada con concentración de 1000 µg/ml: Pesar con exactitud 50 mg de salicilato de sodio y depositarlos en un matraz volumétrico de 50 ml, disolver totalmente en 20 ml de agua destilada, y posteriormente llevarla al aforo.
Elaboró Nombre: Perla Ivonne Hernández Correa Firma: Fecha:14/08/20014
Revisó: Supervisor Nombre: Saúl de Jesús Díaz Ramírez Firma: Fecha:16/08/2014
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2.1 REPETIBILIDAD Analizar en un mismo día al menos por quintuplicado las siguientes muestras control MCB, MCM y MCA. Con los datos obtenidos de las muestras control de calidad en orina, interpolar las absorbancias de la curva de calibración promedio para obtener los valores de la concentración experimental, evaluar la Repetibilidad calculando el CV% y DEA%.
Muestra
Control Bajo (30 µg/ml)
1 2 3 4 5 Promedio D.E. C.V. (%) Conc. Nominal (µg/ml)
30
Control Medio Control Alto (250 µg/ml) (400 µg/ml) Concentración recuperada (µg/ml)
250
400
DEA %
Tabla 3. Resultados de Repetibilidad. 2.2 REPRODUCIBILIDAD Analizar al menos por quintuplicado en tres corridas analíticas diferentes y en al menos 2 días, las muestras control MCB, MCM y MCA. Evaluar reproducibilidad con los datos de las muestras control de la tabla 2, en orina de dos de los equipos. Calcular la concentración experimental, interpolando las absorbancias en la curva de calibración promedio en orina y obtener la media, desviación estándar, coeficiente de variación y desviación absoluta para cada nivel de concentración. Elaboró Nombre: Perla Ivonne Hernández Correa Firma: Fecha:14/08/20014
Revisó: Supervisor Nombre: Saúl de Jesús Díaz Ramírez Firma: Fecha:16/08/2014
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Equiop
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Control Bajo (30 µg/ml)
Control Medio Control Alto (250 µg/ml) (400 µg/ml) Concentración recuperada (µg/ml)
Equipo 1
Equipo 2
Promedio D.E. C.V. (%) Conc. Nominal (µg/ml) DEA %
30
250
400
Tabla 4. Resultados de Reproducibilidad.
3. EXACTITUD De los datos de repetibilidad y reproducibilidad calcular la desviación de la concentración obtenida respecto al valor nominal (% de desviación) empleando la siguiente ecuación: Concentración adicionada – Concentración obtenida % desviación = Concentración adicionada
Elaboró Nombre: Perla Ivonne Hernández Correa Firma: Fecha:14/08/20014
Revisó: Supervisor Nombre: Saúl de Jesús Díaz Ramírez Firma: Fecha:16/08/2014
Autorizó: Asesor Nombre: Hernan I. Cortes Firma: Fecha:
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Vl CRITERIOS DE ACEPTACIÓN
Parámetro
Criterio de aceptación
Linealidad del método
Los datos de concentración recuperada de la curva de calibración deben estar dentro del 15% de la concentración nominal en cada nivel de concentración, excepto para el límite inferior de cuantificación, ya que puede ser menor o igual que el 20%. Al menos el 75% de las concentraciones de la curva de calibración con un mínimo de 6 puntos deben cumplir con este criterio El CV% del valor promedio no debe ser mayor que el 15%, excepto para el límite inferior de cuantificación, el cual debe ser menor o igual que 20% para métodos cromatográficos y para métodos inmunológicos, no debe ser mayor que el 20%, excepto para el límite inferior de cuantificación, el cual debe ser menor o igual que 25%. El CV% del valor promedio no debe ser mayor que el 15%, excepto para el límite inferior de cuantificación, el cual debe ser menor o igual que 20% para métodos cromatográficos y para métodos inmunológicos, no debe ser mayor que el 20%, excepto para el límite inferior de cuantificación, el cual debe ser menor o igual que 25%. El valor promedio del % de desviación no debe ser mayor que el 15%, excepto para el límite inferior de cuantificación, el cual debe ser menor o igual que 20%. Para métodos inmunológicos, no debe ser mayor que el 20%, excepto para el límite inferior de cuantificación, el cual debe ser menor o igual que 25%.
Repetibilidad
Reproducibilidad
Exactitud
Elaboró Nombre: Perla Ivonne Hernández Correa Firma: Fecha:14/08/20014
Revisó: Supervisor Nombre: Saúl de Jesús Díaz Ramírez Firma: Fecha:16/08/2014
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VII. REFERENCIAS
Secretaria de Salud. Norma Oficial Mexicana NOM-177-SSA1-2013, que establece las pruebas y procedimientos para demostrar que un medicamento es intercambiable. Requisitos a que deben sujetarse los Secretaria de Salud. Norma Oficial Mexicana NOM177-SSA1-2013, que establece las pruebas y procedimientos para demostrar que un medicamento es intercambiable. Requisitos a que deben sujetarse los terceros autorizados que realicen las pruebas, 2013. Colegio Nacional de Químicos Farmacéuticos Biólogos. México. Guía de validación de métodos analíticos. Ed. 2002. Colegio nacional de Químicos Farmacéuticos Biólogos México, A.C. México.
VIII. ANEXOS Anexo 1: METODO ANALITICO PARA LA DETERMINACIÓN DE ACIDO ACETIL SALICILICO EN ORINA Reactivo Trinder (para desarrollo de color): Pesar con exactitud 4 g de cloruro mercúrico, colocarlos en un matraz volumétrico de 100 ml, disolver en 12 ml de una solución 1N de ácido clorhídrico y disolver, ya disuelta la mezcla añadir 4 g de nitrato férrico nonahidratado pesados con exactitud, mezclar y diluir con agua destilada hasta el aforo.
Procedimiento: En un tubo de centrifuga colocar 1 ml de muestra (utilice las soluciones de cada una de las curvas y muestras control, tanto de agua como de orina) y utilizando una bureta adicionar 5 ml del reactivo de trinder para desarrollo de color. Agitar la muestra en vórtex durante 1 min. Determinar la absorbancia utilizando un espectrofotómetro y celdas de cuarzo de 1 cm de paso óptico a una longitud de onda de 540 nm, ajustando a cero con su blanco correspondiente (orina diluida 1:10 o agua destilada según el caso), preparando a las mismas condiciones que la muestra. Elaboró Nombre: Perla Ivonne Hernández Correa Firma: Fecha:14/08/20014
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Anexo 2: Formato de registro de resultados Parámetro
Linealidad del método
Repetibilidad
Reproducibilidad
Exactitud
Criterio de aceptación
Resultados
Decisión
Los datos de concentración recuperada de la curva de calibración deben estar dentro del 15% de la concentración nominal en cada nivel de concentración, excepto para el límite inferior de cuantificación, ya que puede ser menor o igual que el 20%. Al menos el 75% de las concentraciones de la curva de calibración con un mínimo de 6 puntos deben cumplir con este criterio El CV% del valor promedio no debe ser mayor que el 15%, excepto para el límite inferior de cuantificación, el cual debe ser menor o igual que 20% para métodos cromatográficos y para métodos inmunológicos, no debe ser mayor que el 20%, excepto para el límite inferior de cuantificación, el cual debe ser menor o igual que 25%. El CV% del valor promedio no debe ser mayor que el 15%, excepto para el límite inferior de cuantificación, el cual debe ser menor o igual que 20% para métodos cromatográficos y para métodos inmunológicos, no debe ser mayor que el 20%, excepto para el límite inferior de cuantificación, el cual debe ser menor o igual que 25%. El valor promedio del % de desviación no debe ser mayor que el 15%, excepto para el límite inferior de cuantificación, el cual debe ser menor o igual que 20%. Para métodos inmunológicos, no debe ser mayor que el 20%, excepto para el límite inferior de cuantificación, el cual debe ser menor o igual que 25%.
Elaboró Nombre: Perla Ivonne Hernández Correa Firma: Fecha:14/08/20014
Revisó: Supervisor Nombre: Saúl de Jesús Díaz Ramírez Firma: Fecha:16/08/2014
Autorizó: Asesor Nombre: Hernan I. Cortes Firma: Fecha: