LAPORAN PRAKTIKUM MIKROBIOLOGI DASAR MENENTUKAN JUMLAH & UKURAN MIKROBA
NAMA
:
Rifki Muhammad Iqbal
NIM
:
1211702067
KELAS
:
III B
JURUSAN BIOLOGI FAKULTAS SAINS DAN TEKNOLOGI UNIVERSITAS ISLAM NEGERI (UIN) SUNAN GUNUNG DJATI BANDUNG
2012
MENENTUKAN JUMLAH & UKURAN MIKROBA
Tanggal Praktikum : 30 November 2012
I.
Tujuan Praktikum -
Melakukan pengukuran sel mikroorganisme.
-
Melakukan perhitungan mikroba dengan cara Plate Count, MPN, dan Haemotytometer.
II.
Dasar Teori Mikroorganisme adalah makhluk hidup yang mempunyai ukuran yang sangat kecil.
Untuk mengamati mikroba tidak bisa digunakan mata telanjang. Beberapa alat digunakan untuk mengamatinya, seperti mikroskop dengan perbesaran yang beragam. Selain diamati, mikroorganisme atau mikrobia tersebut juga dapat dihitung.Perhitungan ini diperlukan untuk mengetahui seberapa banyak jumlah mikroba yangada di dalam s ampel. Alat yang digunakan untuk menghitung mikroba ini adalahcolony counter. Jumlah mikroorganisme dapat dihitung melalui beberapa cara, namun secara mendasar dapat dikelompokkan menjadi dua yaitu perhitungan langsung dan tidak langsung. Perhitungan secara langsung dapat mengetahui beberapa jumlah mikroorganisme pada suatu bahan pada suatu saat tertentu tanpa memberikan perlakuan terlebih dahulu, sedangkan jumlah organisme yang diketahui dari cara tidak langsung terlebih dahulu harus memberikan perlakuan tertentu sebelum dilakukan perhitungan (Arya, 2008). Perhitungan secara langsung, dapat dilakukan dengan beberapa cara antara lain adalah dengan membuat preparat dari suatu bahan (preparat sederhana diwarnai atau tidak diwarnai) dan penggunaan ruang hitung (counting chamber). Sedangkan perhitungan cara tidak langsung hanya untuk mengetahui jumlah mikroorganisme pada suatu bahan yang masih hidup saja (viabel count). Dalam pelaksanaannya, adabeberapa cara yaitu : perhitungan pada cawan petri (total plate count / TPC),perhitungan melalui pengenceran, perhitungan jumlah terkecil atau terdekat (MPNmethode), dan kalorimeter (cara kekeruhan atau turbidimetri). Metode perhitunganMPN sering digunakan dalam pengamatan untuk menghitung jumlah bakteri yang terdapat di dalam tanah seperti Nitrosomonas dan Nitrobacter. Kedua jenis bakteri ini memegang peranan penting dalam meningkatkan pertumbuhan dan produksi
tanaman, sehubungan dengan kemampuannya dalam mengikat N2 dari udara dan mengubah amonium menjadi nitrat (Lim, 1998). Perhitungan jumlah suatu bakteri dapat melalui berbagai macam uji seperti uji kualitatif koliform yang secara lengkap terdiri dari tiga tahap yaitu uji penduga (uji kuantitatif, bisa dengan metode MPN), uji penguat dan uji pelengkap.Waktu, mutu sampel, biaya, tujuan analisis merupakan beberapa faktor penentu dalam uji kualitatif koliform. Bakteri koliform dapat dihitung dengan menggunakan metode cawan petri (metode perhitungan secara tidak langsung yang didasarkan pada anggapan bahwa setiap sel yang dapat hidup akan berkembang menjadi satu koloni yang merupakan suatu indeks bagi jumlah organisme yang dapat hidup yang terdapat pada sampel) seperti yang dilakukan pada percobaan ini. (Lay, 1994). Pengukuran kuantitatif populasi mikroorganisme sangat diperlukan untuk berbagai macam penelaahan mikrobiologis. Berbagai macam cara dapat dilakukan untuk menghitung jumlah mikroorganisme, akan tetapi secara mendasar, mendasar, ada dua cara yaitu secara langsung dan secara tidak langsung. Ada beberapa cara perhitungan secara langsung, antara lain adalah dengan membuat preparat dari austu bahan (preparat sederhana diwarnai atau tidak diwarnai) dan penggunaan ruang hitung (counting chamber). Sedangkan perhitungan cara tidak langsung hanya untuk mengetahui jumlah mikroorganisme pada suatu bahan yang masih hidup saja (viabel count). Dalam pelaksanaannya, pelaksanaannya, ada beberapa cara yaitu : perhitungan pada cawan petri (total plate count / TPC), perhitungan melalui pengenceran, perhitungan jumlah terkecil atau terdekat (MPN methode), dan kalorimeter (cara kekeruhan atau turbidimetri) (Dwidjoseputro,1998). III. Metode Praktikum 3.1. Alat dan Bahan Alat
Bahan
Mikroskop
Alcohol 70 %
Cover glass
Akuades
Chamber / haemochitometer
Biakan bakteri
Tabung reaksi
3.2. Cara Kerja Penghitungan Penghitungan jumlah bakteri secara keseluruhan (langsung)
Bersihkan Petroff-Hauser Counting Chamber atau Haemocytometer dengan alkohol 70 % lalu keringkan dengan tissue.
Letakkan cover glass di atas alat hitung.
Tambahkan ± 50 µl µ l suspensi sel yeast (kira-kira 1 tetes) dengan cara meneteskan pada parit kaca pada alat hitung.
Biarkan sejenak sehingga sehingga sel diam di tempat (tidak terkena aliran air dari efek kapilaritas).
Letakkan alat hitung pada meja benda kemudian cari fokusnya pada perbesaran 40x10.
Lakukan perhitungan secara kasar apakah diperlukan pengenceran atau tidak.
Lukan pengenceran dengan perbandingan perbandingan 1:5 atau 1:10, apabila bertumpuk.
Hitung sampel, paling tidak sebanyak 5 kotak sedang (lebih banyak lebih baik).
IV.
Hasil Pengamatan dan Pembahasan
4.1. Hasil Pengamatan
Gambar
Keterangan Haemacytometer, Haemacytometer, merupakan sejenis alat yang digunakan untuk menghitung bakteri dalam satuan isi yang sangat kecil.
Jarum ose, merupak alat yang digunakan untuk mengambil biakan bakteri.
Tabung reaksi, digunakan sebagai tempat atau wadah bahan yang berisi bakteri.
Proses pemasukkan pemasukkan larutan Alkohol 70 % kedalam tabung reaksi.
Proses pengambilan biakan bakteri yang nantinya akan dimasukkan kedalam tabung reaksi yang sudah berisi larutan alkohol 70 %.
Proses pemasukkan biakan bakteri kedalam tabung reaksi.
Menutup bagian atas Haemacytometer dengan kaca penutup sebelum diisi dengan biakan bakteri.
Proses pemasukan biakan bakteri kedalam celah-celah Haemacytometer. Haemacytometer.
Proses identifikasi dibawah mikroskop.
4.2. Pembahasan
Penghitungan jumlah bakteri hidup terbagi atas dua, yaitu secara (tidak langsung) Misalnya perhitungan pengurangan jumlah substrat dan secara langsung. Penghitungan mikroba secara langsung antara lain: 1.
Plate Count (hitungan cawan) Plate count / viable count didasarkan pada asumsi bahwa setiap sel mikroorganisme hidup
dalam suspensi akan tumbuh menjadi satu koloni setelah ditumbuhkan dalam media pertumbuhan dan lingkungan yang sesuai. Setelah diinkubasi, jumlah koloni yang tumbuh dihitung dan merupakan perkiraan atau dugaan dari jumlah mikroorganisme dalam suspensi tersebut.
2.
Turbidimetri Turbidimetri merupakan metode yang cepat untuk menghitung jumlah bakteri dalam suatu
larutan menggunakan spektrofotometer . Bakteri menyerap cahaya sebanding dengan volume total sel (ditentukan oleh ukuran dan jumlah). Ketika mikroba bertambah jumlahnya atau semakin besar ukurannya dalam biakan cair, terjadi peningkatan kekeruhan dalam biakan.
Kekeruhan dapat disebut optical density (absorbsi cahaya, biasanya diukur pada panjang gelombang 520 nm – nm – 700 700 nm). Untuk mikroba tertentu, kurva standar dapat memperlihatkan
jumlah organisme/ml (ditentukan dengan dengan metode hitungan cawan) cawan) hingga pengukuran optical optical density (ditentukan dengan spektrofotometer). 3.
Hemasitometer Hemasitometer adalah metode perhitungan secara mikroskopis.Ruang hitung terdiri dari 9
kotak besar dengan luas 1 mm². Satu kotak besar di tengah, dibagi menjadi 25 kotak sedang dengan panjang 0,05 mm. Satu kotak sedang dibagi lagi menjadi 16 kotak kecil. Dengan demikian satu kotak besar tersebut berisi 400 kotak kecil. Tebal dari ruang hitung ini adalah 0,1 mm. Sel bakteri yang tersuspensi akan memenuhi volume ruang hitung tersebut sehingga jumlah bakteri per satuan volume dapat dapat diketahui.
Perhitungan Bakteri Secara Langsung
Ada beberapa cara perhitungan secara langsung, antara lain adalah dengan membuat preparat dari austu bahan (preparat sederhana diwarnai atau tidak diwarnai) dan penggunaan ruang hitung (counting chamber) (Sutedjo, 1991). Enumerasi mikroba dapat dilakukan secara langsung yaitu dengan menghitung jumlahnya tanpa ditumbuhkan terlebih dahulu dalam suatu medium, dalam teknik ini semua sel mikroba baik yang idup maupun yang mati akan terhitung. Untuk melakukan enumerasi mikroba dalam suatu bahan seringkali diperlukan pengenceran bertingkat(Waluyo 2010). Pengenceran dilakukan untuk memenuhi syarat penghitungan statistik, yaitu jumlah mikroba yang dihitung tidak boleh lebih dari 100 dengan demikian, kesalahan penghitungan dapat diminimalkan.
Perhitungan Bakteri Secara Tidak Langsung
Sedangkan perhitungan cara tidak langsung hanya untuk mengetahui jumlah mikroorganisme pada suatu bahan yang masih hidup saja (viabel count). Dalam pelaksanaannya, ada beberapa cara yaitu : perhitungan pada cawan petri (total plate count / TPC), perhitungan melalui pengenceran, perhitungan jumlah terkecil atau terdekat (MPN methode), dan kalorimeter (cara kekeruhan atau turbidimetri) (Sutedjo, 1991). 1. Berdasarkan kekeruhan Mikroba dalam suatu bahan cair dapat dideteksi berdasarkan kekeruhannya. Pertumbuhan sel bakteri didalam suatu medium cair akan meningkatkan kekeruhan media,
yang akan mempengaruhi jumlah sinar yang dapat ditransmisikan menembus medium. (Waluyo, 2010). 2. Berdasarkan jumlah lempeng total (plate count) Cara ini adalah cara yang paling umum digunakan untuk menentukan jumlah mikroba yang masih hidup, berdasarkan jumlah koloni yang tumbuh. Teknik ini diawali dengan pengenceran sampel secara seri, dengan kelipatan 1 : 10. Masing-masing suspensi pengenceran ditanam dengan metode tuang (pour plate) atau sebar (spread plate). Bakteri akan bereproduksi pada medium agar dan membentuk koloni setelah 18-24 jam inkubasi. Untuk menghitung jumlah koloni dalam cawan petri dapat digunakan alat ’colony counter’ yang biasanya dilengkapi dengan pencatat elektronik. (Waluyo, 2010). Hemasitometer
Hemasitometer adalah suatu alat yang dapat digunakan di gunakan untuk melakukan perhitungan sel secara cepat dan dapat digunakan untuk konsentrasi sel yang rendah.Hemasitometer rendah.Hemasitometer pada mulanya diperuntukkan untuk menghitung sel darah, yang ditemukan oleh LouisCharlesMalassez. Penghitungan konsentrasi sel pada hemasitometer ini bergantung pada volume dibawah coverslip. Pada chamber terdapat 16 persegi besar yang memiliki persegi-persegi kecil di dalamnya, di mana sisi persegi kecil besarnya 0,05 mm. Jika di atas bagian yang diasah tadi diletakkan sebuah kaca penutup, maka akan terbentuk ruangan yang tingginya 0,1 mm. Sehingga volume dari satu persegi kecil adalah 0,05*0,05*0,1 mm3=25.10-5 mm3. Kelebihan perhitungan sel dengan menggunakan hemasitometer adalah dapat menghitung jumlah sel yang hidup maupun yang mati, tergantung dari pewarna yang digunakan. Misalnya, bila pewarna trypan blue dicampukan ke dalam larutan sel maka sel yang hidup tidak akan berwarna dan sel yang mati akan berwarna biru. Kelebihan lainnya adalah morfologi sel dapat diamati, dapat mengevaluasi homogenitas dan data mendeteksi kontaminasi . (id.wikipedia.org). Hemasitometer yang akan digunakan dalam percobaan adalah tipe NeubauerImproved.Sebelum dilakukan pengamatan, terlebih dahulu harus dibersihkan hemasitometer dan cover glass dengan menggunakan alkohol.Hal ini dimaksudkan agar hemasitometer bersih dari debu dan kuman yang dapat mengganggu perhitungan.Setelah dibilas dengan alkohol, hemasitometer dikeringkan dengan menggunakan tisu lensa.Pada saat pengeringan, tisu lensa tidak boleh digosok-gosokkan pada permukaan hemasitometer.Hal ini bertujuan
agar garis-garis yang terdapat pada hemasitometer tidak hilang.Permukaan lensa objektif dan lensa okuler pada mikroskop harus dibersihkan terlebih dahulu dengan menggunakan tisu lensa. Hal ini bertujuan untuk membersihkan debu dan kotoran yang dapat mengganggu proses penghitungan mikroba. Pengamatan dilakukan pada p erbesaran 400X.
Kelemahan Dan Kelebihan Dari Metode Perhitungan Bakteri Secara Langsung Keuntungan metode ini ialah pelaksanaannya pelaksanaann ya cepat dan tidak memerlukan banyak peralatan peralat an.
Namun mempunyai kelemahan sebagai berikut:
Sel-sel mikroba yang telah mati tidak dapat dibedakan dari sel yang hidup. Karena itu
keduanya terhitung. Dengan Dengan kata lain l ain hasil yang diperoleh ialah jumlah total sel yang ada di dalam populasi. Pada beberapa macam sel eukariotik, penambahan zat warna tertentu (misalnya biru metilen sebanyak 0,1 %) pada sampel yang akan dihitung dapat membedakan membedakan sel hidup dari sel mati. Pada sel khamir misalnya baik sel hidup maupun sel mati akan menyerap biru metilen namun hanya sel hidup mampu mereduksi zat warna tersebut secara enzimatik menjadi tidak berwarna; jadi sel-sel mati akan tampak biru.
Sel-sel yang berukuran kecil sukar dilihat di bawah mikroskop, seperti bakteri karena ketebalan hemasitometer tidak memungkinkan digunakannya lensa obyektif celup minyak, sehingga kalau tidak teliti tidak terhitung. Hal ini biasanya diatasi dengan cara mewarnai
sel sehingga menjadi lebih mudah dilihat.
Untuk mempertinggi ketelitian, jumlah sel di dalam suspensi harus cukup tinggi, minimal 6
untuk bakteri 10 sel/mL. Hal ini disebabkan dalam setiap bidang pandang yang diamati harus terdapat sejumlah sel yang dapat dihitung
Tidak dapat digunakan untuk menghitung sel mikroba di dalam bahan yang banyak mengandung debris atau ekstrak makanan, karena hal tersebut akan mengganggu dalam perhitungan sel.
Kelemahan lain adalah sulitnya menghitung sel yang berukuran sangat kecil seperti bakteri karena ketebalan hemasitometer tidak memungkinkan digunakannya lensa obyektif celup minyak. Hal ini biasanya diatasi dengan cara mewarnai sel sehingga menjadi lebih
mudah dilihat. Kadang-kadang sel cenderung bergerombol sehingga sukar membedakan selsel individu. Cara mengatasinya ialah mencerai-beraikan gerombolan sel-sel tersebut dengan menambahkan bahan anti gumpal seperti dinatrium etilen diamin tetraasetat dan Tween 80 sebanyak 0,1 %.
Cara Menghitung Sel Mikroorganisme Dengan Ruang Hitung
Karena letak mikroorganisme tidak beraturan maka perlu dilakukan perjanjian supaya tidak terjadi perhitungan dua kali, yaitu : o
Sel-sel pada sisi kanan dan bawah tidak dihitung pada kotak yang sedang diamati/dihitung.
o
Sel-sel pada sisi kiri dan atas tetap dihitung pada kotak yang sedang diamati/dihitung.
Metode Perhitungan
Prinsip dari perhitungan Petroff-Hauser yaitu melakukan perhitungan dengan pertolongan 2
kotak-kotak skala, di mana dalam setiap ukuran skala seluas 1 mm terdapat 25 buah kotak 2
besar dengan luas 0,04 mm , dan setiap kotak besar terdiri dari 16 kotak kecil. Alat haemocytometer haemocytometer digunakan di bawah mikroskop, mikroskop, sisinya mempunyai mempunyai ukuran 0,05 mm. Sedangkan satu kotak sedang berukuran berukuran nilai 0,2 mm. Dan tebal nya adalah 0,1 mm. Jumlah sel per mL sampel dapat dihitung sebagai berikut: Jumlah sel dalam 25 kotak besar = Jumlah sel per kotak besar × 25 kotak 3
Jumlah sel per mm sampel = Jumlah sel dalam 25 kotak besar besar × (1/0,02) 3
Jumlah sel per ml sampel = Jumlah sel per mm sampel × 10
3
= Jumlah sel per kotak besar × 25 kotak× (1/0.02)x 10^3 Jumlah sel per ml sampel = Jumlah sel per kotak besar besar × 25 kotak × 50 × 10
3
Misalnya : didapatkan jumlah mikroba yang mau dihitung 12 sel mikroba, maka jumlah sel 6
7
per ml sampel adalah: 12 × 1,25 × 10 = 1,5 × 10 .
Kategori jumlah sel yang di dapat setelah melakukan praktikum adalah : 5
Jumlah sel/ml = jumlah jumlah sel sel x 2,5 x 10 = 13 x 2,5 x 10 = 32,5 x 10
5
5
Berdasarkan hasil pengamatan pengamatan dan perhitungan jumlah mikroba ini di dapat hasil 32,5 5
x 10 per mili liter (ml) jumlah sel bakteri ini termasuk kedalam kategori jumlah banyak sehingga dengan jumlah yang banyak tersebut dapat dikatakan suspensi bakteri Sarcina yang terkontaminan E.coli ini bersifat patogen.
V.
Kesimpulan
Dari praktikum tersebut dapat disimpulkan bahwa jumlah mikroba yang dihitung secara langsung yang terlihat pada perbesaran 400x adalah 13 koloni.Pada praktikum kali ini kita . Hemasitometer adalah suatu alat yang dapat digunakan menggunakan menggunakan alat Hemasitometer Hemasitometer
untuk melakukan perhitungan sel secara cepat dan dapat digunakan untuk konsentrasi sel yang rendah. Aturan penghitungan bakteri dengan Haemocytometer adalah : 1. Sel-sel pada sisi kanan dan bawah tidak dihitung pada kotak yang sedang diamati/dihitung. 2. Sel-sel pada sisi kiri dan atas tetap dihitung pada kotak yang sedang diamati/dihitung ∑ sel 5
yang didapat pada praktikum kali ini adalah 32,5 x 10 , jumlah bakteri ini termasuk kategori jumlah banyak sehingga bakteri bakteri tersebut bersifat patogen. patogen.
Daftar Pustaka Mikrobio logi. Djambatan ; Jakarta. Dwijoseputro, d. 1998. Dasar-Dasar Mikrobiologi
Hadioetomo, R. S. 1990. Mikrobiologi Dasar Dalam Praktek . Gramedia; Jakarta. Lay, Bibiana W. 1994. Analisis Mikroba di Laboratorium. PT Raja Grafindo Persada; Jakarta. Sutedjo.1991. Mikrobiologi Tanah. Rineka Cipta ;Jakarta. Mikrob iologi Umum. UMM; Malang. Waluyo, lud. 2010. Buku Petunjuk Praktikum Mikrobiologi
