STERILISASI I. Tujuan Percobaan 1. Memahami prinsip sterilisasi 2. Memahami dan melakukan metoda-metoda sterilisasi.
3. Menget Mengetahu ahuii cara cara kerja kerja autokl autoklaf af 4. Melakukan Melakukan proses proses sterilis sterilisasi asi alat alat dan bahan yang yang digunakan digunakan pada pengujia pengujian n mikrobiologi mikrobiologi 5. Membuat Membuat media media steril steril untuk untuk pengujian pengujian mikrob mikrobiolog iologii II. Teori Dasar
Sterilisasi adalah suatu proses untuk membunuh semua jasad renik yang ada, sehingga jika ditumbuhkan di dalam suatu medium tidak ada lagi jasad renik yang dapat berkembang biak. Steri Sterilis lisasi asi harus harus dapat dapat membunu membunuh h jasad jasad renik renik yang yang paling paling tahan tahan panas panas yaitu yaitu spora spora bakteri bakteri (Fardiaz, 1992). Sterilisasai adalah tahap awal yang penting dari proses pengujian mikrobiologi. Sterilisasi adalah suatu proses penghancuran secara lengkap semua mikroba hidup dan spora-sporanya. Ada 5 metode umum sterilisasi yaitu : •
Sterilisasi uap (panas lembap)
•
Sterilisasi panas kering
•
Sterilisasi dengan penyaringan
•
Sterilisasi gas
•
Sterilisasi dengan radiasi Meto Metode de yang yang palin paling g umum umum digun digunak akan an untu untuk k ster steril ilis isas asii alat alat dan dan baha bahan n peng penguj ujia ian n
mikrobiologi adalah metode sterilisasi uap (panas lembap) dan metode sterilisasi panas kering. A. Sterilisasi Uap Sterilisasi uap dilakukan dengan autoklaf menggunakan uap air dalam tekanan sebagai penst pensteri erilny lnya. a. Bila Bila ada kelemb kelembapa apan n (uap (uap air) air) bakteri bakteri akan akan terkoag terkoagula ulasi si dan dirusa dirusak k pada pada temp temper erat atur uree yang yang lebi lebih h rend rendah ah diba dibandi nding ngkan kan bila bila tidak tidak ada ada kele kelemb mbapa apan. n. Meka Mekani nism smee penghancuran bakteri oleh uap air panas adalah karena terjadinya denaturasi dan koagulasi beberapa protein esensial dari organism tersebut.:
Prinsip cara kerja autoklaf
Seperti yang telah dijelaskan sebagian pada bab pengenalan alat, autoklaf adalah alat untuk memsterilkan berbagai macam alat & bahan yang menggunakan tekanan 15 psi (2 atm) dan suhu 1210C. Untuk cara kerja penggunaan autoklaf telah disampaikan di depan. Suhu dan tekanan tinggi yang diberikan kepada alat dan media yang disterilisasi memberikan kekuatan yang yang lebi lebih h besa besarr untu untuk k memb membun unuh uh sel sel diba dibandi nding ng denga dengan n udara udara pana panas. s. Bias Biasan anya ya untu untuk k mesterilkan media digunakan suhu 1210C dan tekanan 15 lb/in2 (SI = 103,4 Kpa) selama 15 menit menit.. Alasan Alasan digunak digunakan an suhu suhu 1210C atau 249,8 0F adalah karena air mendidih pada suhu tersebut jika digunakan tekanan 15 psi. Untuk tekanan 0 psi pada ketinggian di permukaan laut ( sea level level ) air air mendi mendidi dih h pada pada suhu suhu 1000C, sedang sedangkan kan untuk untuk autokl autoklaf af yang yang dileta diletakkan kkan di ketinggian sama, menggunakan tekanan 15 psi maka air akan memdididh pada suhu 1210C. Ingat kejadian ini hanya berlaku untuk sea level, jika dilaboratorium terletak pada ketinggian tertentu, maka pengaturan tekanan perlu disetting ulang. Misalnya autoklaf diletakkan pada ketinggian 2700 kaki dpl, maka tekanan dinaikkan menjadi 20 psi supaya tercapai suhu 1210C untuk mendidihkan air. Semua bentuk kehidupan akan mati jika dididihkan pada suhu 1210C dan tekanan 15 psi selama 15 menit. Pada Pada saat saat sumb sumber er pana panass diny dinyal alak akan an,, air air dalam dalam auto autokl klaf af lama lama kelamaan akan mendidih dan uap air yang terbentuk mendesak udara yang mengisi autoklaf. Setelah semua udara dalam autoklaf diganti dengan dengan uap air, air, katup katup uap/ud uap/udara ara ditutu ditutup p sehing sehingga ga tekana tekanan n udara udara dalam autoklaf naik. Pada saat tercapai tekanan dan suhu yang sesuai, maka proses sterilisasi dimulai dan timer mulai menghitung waktu mundur. Setelah proses sterilisasi selesai, sumber panas dimatikan dan tekana tekanan n dibiar dibiarkan kan turun turun perlah perlahan an hingga hingga mencapa mencapaii 0 psi. psi. Autokl Autoklaf af tidak tidak boleh boleh dibuka dibuka sebelum tekanan mencapai 0 psi. Untuk mendeteksi bahwa autoklaf bekerja dengan sempurna dapat digunakan mikroba pengguji yang bersifat termofilik dan memiliki endospora yaitu yaitu Bacillus stearothermophillus, stearothermophillus, lazimnya mikroba ini tersedia secara komersial dalam bentuk spore spore strip. strip . Kertas spore Kertas spore strip ini dimasukkan dalam autoklaf dan disterilkan. Setelah proses sterilisai lalu ditumbuhkan pada media. Jika media tetap bening maka menunjukkan autoklaf telah bekerja dengan baik. (http://www.scribd.com/doc/16574529/petunjuk-praktikum-mikrobiologi-dasar ).
B. Sterilisasi Panas Kering Sterilisasi panas kering biasanya dilakukan dengan menggunakan oven pensteril. Karena panas kering kurang efektif untuk membunuh mikroba dibandingkan dengan uap air panas maka metode ini memerlukan temperature yang lebih tinggi dan waktu yang lebih panjang. Sterilisasi panas kering biasanya ditetapkan pada temperature 160-170oC dengan waktu 1-2 jam. Sterilisasi panas kering umumnya digunakan untuk senyawa-senyawa yang tidak efektif untuk disterilkan dengan uap air panas, karena sifatnya yang tidak dapat ditembus atau tidak tahan dengan uap air. Senyawa-senyawa tersebut meliputi minyak lemak, gliserin (berbagai jenis minyak), dan serbuk yang tidak stabil dengan uap air. Metode ini juga efektif untuk mensterilkan alat-alat gelas dan bedah. Karena suhunya sterilisasi yang tinggi sterilisasi panas kering tidak dapat digunakan untuk alat-alat gelas yang membutuhkan keakuratan (contoh:alat ukur) dan penutup karet atau plastik. C. Sterilisasi dengan penyaringan Sterilisasi dengan penyaringan dilakukan untuk mensterilisasi cairan yang mudah rusak jika terkena panas atu mudah menguap (volatile (volatile). ). Cairan Cairan yang disterilisasi disterilisasi dilewatkan dilewatkan ke suatu saringan (ditekan dengan gaya sentrifugasi atau pompa vakum) yang berpori dengan diameter yang cukup kecil untuk menyaring bakteri. Virus tidak akan tersaring dengan metode ini. D. Sterilisasi gas Ster terili ilisasi sasi gas gas
digu diguna naka kan n
dal dalam pem pemapar aparan an gas gas
atau atau uap uap
unt untuk membu embunu nuh h
mikroorganisme dan sporanya. Meskipun gas dengan cepat berpenetrasi ke dalam pori dan serbuk padat. Sterilisasi adalah fenomena permukaan dan mikroorgani mikroorganisme sme yang terkristal terkristal akan dibunuh. Sterilisasi gas biasanya digunakan untuk bahan yang tidak bisa difiltrasi, tidak tahan panas dan tidak tahan radiasi atau cahaya.
E. Sterilisasi dengan radiasi
Radiasi sinar gama atau partikel elektron dapat digunakan untuk mensterilkan jaringan yang telah diawetkan maupun jaringan segar. Untuk jaringan yang dikeringkan secara liofilisasi, sterilisasi radiasi dilakukan pada temperatur kamar (proses dingin) dan tidak mengubah struktur jaringan, tidak meninggalkan residu dan sangat efektif untuk membunuh mikroba dan virus sampai sampai batas batas terten tertentu. tu. Steri Sterilis lisasi asi jaring jaringan an beku dilakuk dilakukan an pada suhu suhu -40 deraja derajatt Celsiu Celsius. s. Teknologi ini sangat aman untuk diaplikasikan pada jaringan biologi.
III. Alat dan Bahan Alat : - Autoclave
- Batang pengaduk
- Oven
- Spatel
- Erlenmeyer
- Gunting
- Tabung reaksi
- Kertas label
- Cawan petri
- Benang kasur
- Botol media
- Alumunium Foil
- Gelas ukur
- Labu takar
- Kapas
- Kasa asbes
- Kaki tiga
Bahan : - Nutrient Agar - Nutrient Broth
IV. Prosedur Percobaan Cara sterilisasi tabung reaksi dan gelas ukur:
Kapas di bungkus kain kasa dan di ikat dengan benang kasur
bungkusan kapas di masukkan ke mulut tabung tabung reaksi dan labu uk ur
mudian permukaannya di tutup dengan alumunium foil dan di ikat menggunaka menggunaka n benang k asur agar tidak terlepas
selanjutnya tabung reaksi dan labu ukur di masukkan ke da lam autoclave
Cara sterilisasi gelas kimia dan labu takar:
permukaan permukaan gelas kimia dan labu tak ar di tutup de ngan aluminium foil
selanjutkan gelas kimia dan labu takar di masukkan ke dalam autoclave
Cara sterilisasi cawan petri:
seluruh permukaan cawan petri di bungkus menggunakan kertas hvs
Kemudian Kemudian cawan petri yang telah dibun gkus di masukkan ke dalam autoclave
Cara sterilisasi pipet volume:
kapas dibungkus kain kasa dan di ikat manggunakan bena ng kasur
bungkusan kapas di masukkan masukkan ke dalam mulut mulut pipet volume
selanjutnya ujung mulut di tutup menggu nakan a lumunium foil foil
kemudian pipet volume di bungkus dengan k ertas hvs secara menyeluruh
masukkan kedalam autoclave
Pembuatan dan sterilisasi media serta larutan pengencer
Nutrien Agar nutrient agar di timbang untuk pembuatan 400ml
Nutrien Nutrien agar dimasukkan kedalam labu erlenmeyer dan ditambahkan aquad es 400 mL
lalu dipanaskan mengun akan Hot plate stirrer dan diaduk menggunakan magnetik stirrer stirrer sampai larutan jernih
utan dibagi menjadi 2 bagian kedalam labu erlenmeyer dan mulut mulut labu erlenmeyer ditutup ditutup dengan g ulungan kapa s
kemudian dilapisi dengan alumunium foil foil
masukkan kedalam autoclave
Nutrien Broth nutrien broth ditimbang ditimbang unu tk pembuatan 200 mL
nutrien broth dimasukkan kedalam labu erlenmeyer dan ditambahkan aquad es 200 mL
lu dipanaskan mengunakan Hot plate stirrer dan diaduk menggunakan magnetik stirrer stirrer sampai larutan jernih.
an dibagi menjadi 2 bagian kedalam labu erlenmeyer dan mulut labu labu erlenmeyer ditutup dengan gulungan k apas
kemudian dilapisi dengan alumunium foil foil
masukkan kedalam autoclave
V. Data Pengamatan dan Perhitungan Data Pengamatan
No 1
Media Nutrien Agar
T=0 jam •
T=24 jam Nutrien dita ditamb mbahk ahkan an
Agar deng dengan an
Setela Setelah h didiam didiamkan kan selama selama 24 jam jam di labo labora rato tori rium um,,
Aquades
lalu
larutan
dipanaskan
dan
berubah bentuk dari larutan
Nutrien
mengha menghasil silkan kan laruta larutan n
menj menjad adii
Nut Nutri rien en
yang ang
agar
kuning
perubahan
Agar Agar
berwarna muda. •
•
Sete Setela lah h
kuning dist dister eril ilis isas asii
menggunakan autoklaf larutan tetap berwarna
Agar
pada padata tan n dan
mengalami warna
muda
kuning keruh.
sepe sepert rtii
dari
menjadi
kuning muda. 2
Nutrien Broth
•
Nutrien
•
Setela Setelah h didiam didiamkan kan selama selama
ditambahkan ditambahkan Aquades
24 jam jam di labo labora rato tori rium um,,
lalu lalu dipa dipana nask skan an dan dan
larutan Nutrien Broth tidak
mengha menghasil silkan kan laruta larutan n
mengalam alamii
Nut Nutri rien en
Brot Broth h
yang yang
perubahan han
warn warna. a.
Laru Laruta tan n
Nutr Nutrie ien n
bening atau jernih.
Broth
tetap
Sete Setela lah h
kuning bening atau jernih.
kuning
dist dister eril ilis isas asii
ben bentuk
perubahan han dan
berwarna
•
Broth
berwarna
menggunakan autoklaf larutan tetap berwarna kuni kuning ng
beni bening ng
atau atau
jernih.
Nutrien Agar setelah di sterilisasi
Gambar ini merupakan madia Nutrien Agar setelah dist dister eril ilis isas asii
meng menggu guna naka kan n
auto autokl klaf af
dan dan
suda sudah h
didiamkan selama 24 jam di laboratorium. Nutrien Agar Agar menj menjadi adi pada padata tan n seper seperti ti agar agar dan beru beruba bah h warna menjadi kuning agak keruh.
Nutrien broth setelah disterilisasi
Gambar ini merupakan merupakan madia Nutrien Broth setelah setelah disterili disterilisasi sasi menggunakan autoklaf dan sudah didiamkan selama 24 jam di laboratorium. Nutrien Broth tetap berwarna kuning bening atau jernih. Alat-alat yang disterilisasi adalah labu Erlenmeyer, labu takar, pipet volume, gelas ukur, tabung reaksi dan cawan petri. Semua alat yang sudah disterilisasi tidak mengalami perubahan dan dapat dikatakan semua alat dalam keadaan steril. Perhitungan
Dit : berat Nutrien Agar yang dibutuhkan untuk pembuatan 200 mL dan berat Nutrien Broth yang dibutuhkan untuk pembuatan 100 mL. Dik : Nutrien Agar : 28 gram untuk 1000 mL, Nutrien Broth : 8 gram untuk 1000 mL Jawab : Nut Nutri rien en Agar Agar yang yang dibu dibuttuhka uhkan n
= 200 200 mL/ mL/1000 1000 mL x 28 gram gram = 0,2 x 28 = 5,6 gram
Nut Nutri rien en Brot Broth h yan yang g di dibutu butuhk hkan an
= 100 100 mL/ mL/1000 1000 mL x 8 gr gram = 0,1 x 8 = 0,8 gram
VI. Pembahasan
Pada Pada percoba percobaan an kali kali ini dilakuk dilakukan an steril sterilisa isasai sai alat-a alat-alat lat yang yang berada berada di labora laborator torium ium mikr mikrobi obiol olog ogi. i. Tuju Tujuan an dila dilakuk kukan anny nyaa ster steril ilis isas asii alat alat iala ialah h agar agar alat alat-al -alat at yang yang bera berada da di laboratorium tidak terkontaminasi dengan mikroorganisme yang ada di lingkungan sekitar. Alatalat yang disterilisasi adalah tabung reaksi, labu ukur, labu takar, labu Erlenmeyer, pipet volume, dan cawan petri. Alat-alat disterilisasi menggunakan autoklaf pada suhu 121oC selama 15 menit. Alat-alat yang disterilisasi menggunakan autoklaf merupakan alat-alat gelas yang presisi. Alasan menggunakan autoklaf ialah waktu yang dibutuhkan untuk mensterilkan alat sangkat singkat dan pada suhu 1210C alat gelas tidak akan memuai sehingga tidak akan merubah ukuran alat. Alasan tidak menggunakan oven untuk mensterilkan alat gelas ini karena oven membutuhkan waktu yang lama yaitu 1-2 jam dan membutuhkan suhu yang tinggi 160-170oC. Pada suhu 160-170oC, alat gelas akan memuai sehingga dapat merubah ukuran alat. Sebelum disterilisasi menggunakan autoklaf,semua alat ditutup dengan kapas yang dibungkus kain kasa dan dilapisi alumunium foil. Tujuannya agar semua alat yang disterilisasi benar-benar steril dari mikroba. Percobaan selanjutnya adalah pembuatan dan sterilisasi media serta larutan pengencer. Media yang digunakan adalah Nutrien Agar dan Nutrien Broth. Pembuatan media Nutrien Broth dilakukan terlebih dahulu karena Nutrien Broth tidak mengandung agar sehingga dapat mudah larut dalam aquades dan waktu yang dibutuhkan untuk melarutkan Nutrien Broth sangat cepat. Untuk membuat media Nutrien Broth dibutuhkan 0,8 gram Nutrien Broth dan 100 mL aquades. Nutrien Broth lalu dilarutkan dengan aquades dan menghasilkan larutan yang berwarna kuning keruh. Warna kuning keruh ini berarti larutan masih belum steril. Lalu larutan Nutrien Brot Broth h dipa dipanas naskan kan mengg menggun unaka akan n hot hot plat platee stir stirre rer r . Pemanas Pemanasan an dilaku dilakukan kan sambil sambil diaduk diaduk mengg mengguna unaka kan n magne magneti ticc stir stirre rerr yang yang bertu bertuju juan an agar agar Nutr Nutrie ien n Brot Broth h laru larutt semp sempur urna na dan mengha menghasil silkan kan laruta larutan n yang yang jernih jernih.. Setela Setelah h dilaku dilakukan kan pemana pemanasan san,, labu labu Erlenm Erlenmeye eyerr ditutu ditutup p dengan kapas yang dibungkus kain kasa dan dilapisi dengan menggunakan alumunium foil.
Tujuan ditutup kapas dan alumunium foil ialah agar proses sterilisasi media Nutrien Broth berjalan lancar dan menghasilkan media Nutrien Broth yang benar-benar steril. Setelah itu labu Erlenmeyer dimasukkan kedalam autoklaf dengan suhu 1210C selama 15 menit. Setelah 15 menit, labu dikeluarkan dari autoklaf dan menghasilkan larutan Nutrien Broth yang berwarna kuning kuning bening bening atau atau jernih jernih sama sama dengan dengan warna warna laruta larutan n Nutrie Nutrien n Broth Broth sebelu sebelum m dimasu dimasukka kkan n kedalam autoklaf. Setelah itu larutan Nutrien broth didiamkan selama 24 jam di laboratorium. Pendiaman ini dilakukan karena mikroba atau bakteri dapat berkembang biak dengan cepat dalam waktu 24 jam. Setelah 24 jam didiamkan, larutan tetap berwarna kuning bening atau jernih. Media Nutrien Broth yang sudah disterilisasi dibandingkan dengan Nutrien Broth control.
Ini merupakan gambar Nutrien Broth yang sudah disterilisasi dan Nutrien Broth control. Dari gambar terlihat sekali perbedaan warna antara Nutrien Broth yang sudah disterilisasi dan Nutrien Broth control. control. Warna larutan larutan Nutrien Broth control adalah kuning keruh. Warna Warna kuning keruh ini ini dise disebab babka kan n laru laruta tan n Nutr Nutrie ien n Brot Broth h ini ini tida tidak k dist dister eril ilis isas asii dan warn warnaa kunin kuning g keruh keruh ini ini menandakan bahwa terdapat banyak bakteri didalam larutan Nutrien Broth control dan dapat dikatan tidak steril. Tetapi warna larutan Nutrien Broth adalah kuning bening atau jernih. Warna kuning bening ini menandakan bahwa larutan Nutrien Broth yang sudah disterilisasi ini tidak terdapat bakteri atau mikroba didalam larutan Nutrien Broth atau dapat dikatakan bahwa larutan Nutrien Broth ini sudah steril. Untuk membuat media Nutrien Agar dibutuhkan 5,6 gram Nutrien Agar dan 200 mL aquades aquades.. Langkah Langkah kerja kerja pembua pembuatan tan media media Nutrie Nutrien n Agar Agar ini sama sama sepert sepertii pembuat pembuatan an media media
Nutrien Broth. Proses pemanasan larutan Nutrien Agar dibutuhkan suhu 123-1250C. Hal ini dilaku dilakukan kan agar agar laruta larutan n Nutrie Nutrien n Agar Agar menjad menjadii homoge homogen n dan tidak tidak cepat cepat memadat memadat.. Setela Setelah h dilakukan pemanasan dihasilkan Nutrien Agar yang berwarna kuning muda. Lalu larutan Nutrien Agar ini dimasukkan kedalam autoklaf dengan suhu 1210C selama 15 menit. Setelah 15 menit, larutan Nutrien Agar dikeluarkan dari autoklaf dan menghasilkan larutan Nutrien Agar yang berwarna berwarna kuning muda sama seperti seperti warna larutan Nutrien Agar sebelum sebelum dimasukkan dimasukkan kedalam autoklaf. Sama seperti larutan Nutrien Broth, larutan Nutrien Agar juga didiamkan selama 24 jam di laboratorium. Setelah didiamkan selama 24 jam, larutan Nutrien Agar berubah bentuk dari larutan menjadi padatan yang menyerupai agar. Selain perubahan bentuk, terjadi juga perubahan warna dari warna kuning muda menjadi warna kuning agak keruh.
VII. Kesimpulan
1. Steril Sterilisa isasi si merupakan merupakan suatu proses proses penghanc penghancura uran n secara secara lengkap lengkap semua semua mikroba mikroba hidup hidup dan spora-sporanya. 2. Terd Terdap apat at 5 meto metode de umum umum ster steril ilis isas asii yait yaitu u ster steril ilis isas asii uap, uap, ster steril ilis isas asii panas panas kerin kering, g, sterilisasi dengan penyaringan, sterilisasi gas dan sterilisasi dengan radiasi. 3. Metode Metode sterilis sterilisasi asi uap diguna digunakan kan untuk sterili sterilisas sasii sediaa sediaan n farmas farmasii dan bahan-bah bahan-bahan an lainnya yang tahan terhadap temperature yang digunakan dan tahan terhadap penembusan uap air. 4. Larutan Larutan Nutrien Nutrien Agar setelah setelah disterilis disterilisasi asi memadat memadat seperti seperti agar dan berwarna berwarna kuning. kuning. 5. Laruta Larutan n Nutrie Nutrien n Broth Broth setelah setelah dister disterili ilisas sasii berwar berwarna na kuning kuning bening bening yang yang menanda menandakan kan larutan tidak terkontaminasi dan sudah steril. 6. Prinsip penggunaan autoclave didasarkan pada mikroorganisme, termasuk spora yang
tahan panas, mudah terbunuh dengan panas lembab pada tempratur sedikit di atas titik didih air. VIII. Daftar Pustaka
http://ekmon-saurus.blogspot.com/2008/11/bab-2-media-pertumbuhan.html http://www.scribd.com/doc/16574529/petunjuk-praktikum-mikrobiologi-dasar
Fardiaz, Srikandi. 1992.Mikrobiologi Pangan. Departemen Pendidikan dan Kebudayaan. PAU Pangan dan Gizi. Institut Pertanian Bogor. Hadioetomo,R.S.1993.Mikrobiologi Dasar Dalam Praktek.Granedia,Jakarta. Suriawiria,U.2005.Mikrobiologi Dasar.Papas Sinar Sinanti,Jakarta. Lim,D.1998.Microbiology,2nd Edition,McGrow-hill book,New York.