Fijación y técnicas de preparación de extendidos citológicos
Introducción Citología es parte de la biología que estudia las células y sus organelas, su desarrollo ha sido paralela al del microscopio. Desde hace muchos años ha sido de gran valor en el campo de la medicina para la detección del cáncer cervico-uterino y de otros sitios del cuerpo. Los laboratorios de citología deben estar dotados de varias áreas de trabajo: -Citología ginecológica -Citología de líquidos o derrames -Punción aspiración con aguja fina(PAAF fina(PAAF)
Interpretación celular Métodos
de recolección Fijación y fijadores Preservaci ón de líquidos antes de ser procesados procesados Preservación Preparación de material citológico para el examen microscópico Tinción y montaje de la muestra celular
Métodos de recolección
Citología ginecológica: Citología convencional es recolectada del cérvix por el personal médico o enfermería
Punción Aspiración con aguja Fina pueden ser recolectadas por patólogos (as) con experiencia en este campo.
Citología de líquidos corporales como orina y esputo pueden ser recolectada por el mismo paciente siguiendo las recomendaciones médicas o del laboratorio Para la recolección de los derrames como pleural, peritoneal, LCR y otros , el paciente debe estar ingresado y el medico debe realizar la recolección adecuada.
Citología cervico-vaginal
Punción aspiración con aguja fina (PAAF=BAAF)
Derrames corporales
Toracocentesis y paracentesis
Fijación
La fijación inmediata de las muestras es necesaria para preservar los detalles celulares en los extendidos citológicos. Si las muestras se dejan secar al aire antes de la fijación las células pueden sufrir distorsión en su arquitectura .
Fijadores Para
preservar muestras ginecológicas :
Alcohol
al 95%- éter. Alcohol 95% en atomizador o citospray. Metanol al 100% Propanol 80% Isopropanol 80%
Pre-fijador para muestras de líquidos corporales:
alcohol 50%. Para las PAAF se pueden utilizar:
Alcohol
95% Formalina buferada al 10% Secado al aire.
Fijación inmediata
Liq. Pleural fijado en alcohol 95%
Liq. Pleural fijado en formalina al 10%
Muestra de liq. Peritoneal fijada en alcohol al 95%
Fijadores especiales
Solución de formalina buferada neutral: Formalina 37-40%100ml Agua 900ml Fosfato de sodio monobásico ………. 4 g Fosfato de sodio bibásico…………… 6.5 g. Solución de Bouin Solución acuosa de ácido pícrico 1.2 %50ml Formol 37-40%
250ml
Acido acético glacial 50ml
Fijador de Carnoy -Etanol 95% 60 ml -Cloroformo 30 ml -Acido acético glacial 10 ml (en este fijador la muestra no debe permanecer más de 15 min)
Vapor de formalina: este fijador hemolisa los glóbulo rojos y encoge las células Fijador ácido Pícrico -Acido pícrico 1.3 g -Alcohol etílico 70% 1000ml
Preservación de Líquidos antes de ser procesados
Preservar la morfología celular hasta que la muestra sea procesada es esencial para la correcta interpretación. Los especimenes pueden ser sometidos al laboratorio sin preservación si se facilita la inmediata preparación de los extendidos. El tiempo entre la recolección de la muestra y la preparación antes de sufrir daño celular depende del PH, proteínas, actividad enzimática y la presencia o ausencia de bacterias. Ejemplo: Lavado Gástrico
Preparación del material citológico para el examen microscópico
Muestras líquidas como orina , derrames pleurales, peritoneales o LCR., se deben someter al método de sedimentación en centrifuga por 5 min a 1500 o 2000rpm , del material obtenido se realiza los extendidos. Muestras con alto contenido mucoso como Esputo, aspirado bronquial o líquido de mucocele deben realizarse los extendidos citológicos directamente seleccionando partículas sólidas, decoloradas o con sangre.
Método de sedimentación celular
Preparación del extendido citológico de esputo
Preparación con filtro de membrana o millipore
Los filtros de millipore son elaborados de celulosa aproximadamente de 140milimicras, especialmente utilizado en muestra con poco contenido celular como LCR.
Preparación de bloque celular
La técnica de bloque celular o inclusión en agar parafina se realiza a partir del sedimento celular decantando liquido sobrenadante y agregando agar líquido, este método es útil para complementar diagnostico del citológico .
Tinción Papanicolaou
Tinción de rutina elaborada por el Dr. Georges Papanicolaou, tienen un valor práctico en la diferenciación celular tanto citoplasmática como nuclear y sus modificaciones. Para este método se necesitan 3 soluciones especificas: Hematoxilina de Harris Orange 6 (OG6) Eosina Azur 36, 50 ó 65 (EA-50) Cada una de estas soluciones deben de ser filtradas antes de utilizarla.
Pasos de tinción Pap. Re fijación en alcohol al 95% 10 min Hidratación en alcohol 80%, 70%, 50% agua una sumersión en cada una 3. Tinción Nuclear en Hematoxilina de Harris 6 min 4. Enjuague en agua 5. Extracción diferencial en ácido clorhídrico al 0,25%. 6. Enjuague y deshidratación en agua, alcohol 50%, 70%, 80% y 95% 7. Tinción citoplasmática en Orange 6 1 ½ min 8. 3 enjuague en alcohol al 95% 9. Tinción citoplasmática en EA 36, 50 o 65 1 a 3 min. 10. Enjuague en 3 alcoholes 95% 11. Deshidratación total en etanol absoluto 12. Clarificación celular en Xilol 1. 2.
Tinciones especiales
1. 2. 3. 4. 5. 6. 7.
Tinción para evaluación hormonal: Tinción de Shorr Alcohol al 50%……100ml
Biebrich Scarlet 0.5 gr Orange G-6 0.25gr Fast-Green 0.075gr Acido fosfotúngstico 0.5gr Acido fosfomolíbdico 0.5gr Acido acético 1.0ml
Método de la tinción: 1. Teñir la Mx., en solución de Shorr por 1 min. 2. Enjuagar en alcohol al 70%, 95% y alcohol absoluto 3. Aclarar en xilol y montaje permanente
Otras tinciones Método de Rakoft:
Light Green 83ml Solución acuosa de eosina al 1 % 17ml La muestra tomada de la pared vaginal se coloca en 2 cc., de solución salina y se le agrega 1 gota de la mezcla de Rakoft, se deposita esta muestra en la lamina.
Tinción para cromatina sexual:
1. Tinción de Biebrich Scarlet-Fast-Green 2. Tinción de Orceina acética 3. Tinción Cresil Violeta
Montaje de la muestra procesada
Los medios de montajes crean un capa permanente entre la lámina y el cubreobjetos protegiéndola del medio ambiente, daños mecánicos, disecación celular, logrando así almacenarlas luego de haber sido visualizadas o diagnosticadas . Se coloca una gota del medio de montaje sobre la muestra Se diluye con Xilol y antes de que se seque colocar el cubre objeto tratando de que la muestra quede protegida
Algunas recomendaciones
Muestras citológicas hemorrágicas antes de proceder a tinción deben de sumergirse por 5 seg., en solución acuosa de ácido acético al 2% Extendidos citológicos cervicovaginal sin fijar se re hidrataran sumergiendo la laminilla en glicerina al 50% por 2 seg., y luego sumergir en alcohol al 95% .
