Teknik Aseptik pada Kultur Jaringan

LAPORAN PRAKTIKUM BIOTEKNOLOGI “TEKNIK ASEPTIK PADA KULTUR JARINGAN”

Disusun Oleh: Nama

: Fanita Widyah Alviana

NIM

: 115040200111044 115040200111044

Kelompok

: Selasa, 11.00

Asisten

: Husnul

PROGRAM STUDI AGROEKOTEKNOLOGI FAKULTAS PERTANIAN UNIVERSITAS BRAWIJAYA MALANG 2012

I. PENDAHULUAN 1.1 Latar Belakang

Kultur Jaringan merupakan suatu teknik perbanyakan tanaman dengan menggunakan bagian tanaman yang berupa sel, jaringan atau organ dalam kondisi aseptik secara in vitro. Praktek kultur jaringan tanaman bermula dari pembuktian sifat totipotensi ( total genetic potential) sel, yaitu bahwa setiap sel tanaman yang hidup dilengkapi dengan informasi genetik dan perangkat fisiologis yang lengkap untuk tumbuh dan berkembang menjadi tanaman utuh, jika kondisinya sesuai. Teori ini dikembangkan oleh Schwann dan Schleiden pada tahun 1838 dan baru dapat dibuktikan pada pertengahan sampai akhir tahun 1930-an (Yusnita, 2003). Setiap sel tanaman atau bagian kecil tanaman dapat tumbuh dan berkembang menjadi individu tanaman baru yang lengkap. Proses pelaksanaan kultur jaringan yang dapat dikatakan proses terakhir yaitu penanaman eksplan. Syarat pertama kultur jaringan juga masih digunakan digunakan pada pelaksanaan pelaksanaan ini yaitu kondisi yang aseptic. Pada proses penanaman eksplan, lingkungan yang digunakan haruslah benar-benar dalam kondisi yang aseptic. Oleh karenanya penanaman biasanya dilakukan di Enkas, sebuah kotak dengan tepi yang transparan dan terdapat lubang untuk tangan, atau dengan menggunakan LAF (Laminar Air Flow). Kontaminasi yang terjadi pada kultur jaringan merupakan momok yang cukup mengganggu proses kultur jaringan. Namun kontaminasi juga dapat dicegah dengan perlakuan-perlakuan yang aseptic. Stelah dua acara praktikum diatas dilakukan sterilisasi terhadap peralatan kultur dan media kultur, tanaman atau eksplan yang akan ditanam juga harus dalam keadaan steril dan sehat artinya eksplan tidak terserang penyakit ataupun terkena serangan mikroba. Keberadaan kontaminan yang berasal dari spora maupun mikroba lainnya sangat sulit dihindari termasuk juga di dalam ruang kultur. Untuk itu sterilisasi ruangan juga perlu dilakukan tentunya dengan tujuan untuk menciptakan lingkungan yang aseptic dan menghilangkan mikroba maupun spora penyebab kontaminan.

Berdasarkan penjelasan di atas maka sangat penting bagi kita untuk melaksanakan praktikum ini agar menambah pengetahuan kita tentang pengembangan tanaman melalui proses kultur jaringan.

1.2 Tujuan

Percobaan ini bertujuan untuk memperkenalkan media pada teknik kultur jaringan serta proses pembuatannya, khususnya pada media MS. 1.3 Manfaat

-

Agar mengetahui jenis-jenis media pada kultur jaringan. Agar mengetahui Komposisi dan Fungsi Unsur Dalam media MS (Murashige & Skogg). Agar mengetahui teknik-teknik aseptik dalam pembuatan media Rumus perhitungan larutan stok.

II. TINJAUAN PUSTAKA 2.1 Jenis-jenis Media Pada Kultur Jaringan Serta Aplikasi Kegunaannya

a. Jenis media berdasar komposisi Media Knudson dan media Vacin and Went

Media ini dikembangkan khusus untuk kultur anggrek. Knudson + pada tahun 1922, menemukan penambahan 7.6 mM NH 4 disamping 8.5 mM NO 3 , sangat baik untuk perkencambahan dan pertumbuhan + biji anggrek. Penambahan NH 4 ternyata dibutuhkan untuk perkembangan protocorm. Knudson C digunakan untuk kultur pada biji anggrek dan kultur meristem. Media Knudson dan media Vacin and Went, media ini dikembangkan khusus untuk kultur anggrek. Tanaman yang ditanam di kebun dapat tumbuh dengan baik dengan pemupukan yang hanya mengandung N dari Nitrat. Knudson pada tahun 1922, menemukan penambahan 7.6 mM NH4+ disamping 8.5 mM NO3-, sangat baik untuk perkencambahan dan pertumbuhan biji anggrek. Penambahan NH4+ ternyata dibutuhkan untuk perkembangan protocorm.

(Bastomi,2011)

Murashige-Skoog (MS)

Murashige and Skoogbasic medium digunakan untuk menumbuhkan kalus tembakautapi sering digunakan untuk kultur jaringan yang lain. Murashige and Skoogbasic high salt medium Untuk mengoptimalkan pertumbuhan kalus tembakau. Media Murashige & Skoog (media MS) merupakan perbaikan komposisi media Skoog, terutama kebutuhan garam anorganik yang mendukung pertumbuhan optimum pada kultur jaringan tembakau. Media MS mengandung 40 mM N dalam bentuk NO3 dan 29 mM N

dalam bentuk NH4+. Kandungan N ini, lima kali lebih tinggi dari N total yang terdapat pada media Miller, 15 kali lebih tinggi dari media tembakau Hildebrant, dan 19 kali lebih tinggi dari media White. Kalium juga ditingkatkan sampai 20 mM, sedangkan P, 1.25 mM. Unsur makro lainnya konsemtrasinya dinaikkan sedikit. Pertama kali unsur-unsur makro dalam media MS dibuat untuk kultur kalus tembakau, tetapi komposisi MS ini sudah umum digunakan untuk kultur jaringan jenis tanaman lain. Media MS paling banyak digunakan untuk berbagai tujuan kultur pada tahun-tahun sesudah penemuan media MS, sehingga dikembangkan media-media lain berdasarkan media MS tersebut, antara lain media: 1. Lin & Staba, menggunakan media dengan setengah dari komposisi unsur makro MS, dan memodifikasi : 9 mM ammonium nitrat yang seharusnya 10mM, sedangkan KH2 PO4 yang dikurangi menjadi 0.5 Mm, tidak 0.625 mM. Larutan senyawa makro dari media Lin & Staba, kemudian digunakan oleh Halperin untuk penelitian embryogenesis kultur jaringan wortel dan juga digunakan oleh Bourgin & Nitsch (1967 dalam Gunawan 1988) serta Nitsch & Nitsch (1969 dalam Gunawan 1988) dalam penelitian kultur anther. (Hendaryono,1994)

Knop’s solution

Digunakan untuk pertumbuhan embrio. Media Knop dapat juga digunakan untuk menumbuhkan kalus wortel. Kultur kalus, biasanya ditumbuhkan pada media dengan kosentrasi garam-garam yang rendah seperti dalam kultur akar dengan penambahan suplemen seperti glucosa, gelatine, thiamine, cysteine-HCl dan IAA (Dodds and Roberts, 1983). (Bastomi,2011)

Media White

Untuk kultur jaringan tumor bunga matahari, ditemukan bahwa unsur makro yang dibutuhkan kultur tersebut, lebih tinggi dari pada yang dibutuhkan oleh kultur tembakau. Unsur F, Ca, Hg dan S pada media untuk tumor bunga matahari ini, sama dengan media untuk jaringan normal yang dikembangkan kemudian. Konsentrasi + NO3 dan K yang digunakan Hildebrant ini lebih tinggi dari media white, tetapi masih lebih rendah dari pada media-media lain yang umum digunakan sekarang. Media White dikembangkan oleh Hildebrant untuk keperluan kultur jaringan tumor bunga matahari, ditemukan bahwa unsur makro yang dibutuhkan kultur tersebut, lebih tinggi dari pada yang dibutuhkan oleh kultur tembakau. Unsur F, Ca, Hg dan S pada media untuk tumor bunga matahari ini, sama dengan media untuk jaringan normal yang dikembangkan kemudian. Konsentrasi NO3- dan K+ yang digunakan Hildebrant ini lebih tinggi dari media white, tetapi masih lebih rendah dari pada media-media lain yang umum digunakan sekarang. (Bastomi,2011)

Media Nitsch & Nitsch -

+

Menggunakan NO 3 dan K dengan kadar yang cukup tinggi untuk mengkulturkan jaringan tanaman artichoke Jerussalem. Media Nitsch & Nitsch, menggunakan NO3- dan K+ dengan kadar yang cukup tinggi untuk mengkulturkan jaringan tanaman artichoke Jerussalem. Penambahan ammonium khlorida sebanyak 0.1 mM, menghasilkan pertumbuhan jaringan yang menurun. Mereka mengambil kesimpulan, bahwa NH4+ sangat menunjang pertumbuhan kalus tembakau (Miller et al, (1956 dalam Gunawan 1988). (Bastomi,2011)

Media Gamborg B5 (media B5)

pertama kali dikembangkan untuk kultur kalus kedelai dengan konsentrasi nitrat dan amonium lebih rendah dibandingkan media MS. Untuk selanjutnya media B5 dikembangkan untuk kultur kalus dan suspensi, serta sangat baik sebagai media dasar untuk meregenerasi seluruh bagian tanaman.. Pada masa ini media B5 juga digunakan untuk kultur-kultur lain. Media ini dikembangkan dari komposisi PRL-4, media ini menggunakan konsentrasi NH4+ yang rendah, karena konsentrasi yang lebih tinggi dari 2 mM menghambat pertumbuhan sel kedelai. Fosfat yang diberikan setelah 1 mM, Ca2+ antara 1-4 mM, sedangkan Mg2+ antara 0.5-3 mM (Gamborg et al, 1968). (Bastomi,2011) Media Schenk & Hildebrant (media SH)

merupakan media yang juga cukup terkenal, untuk kultur kalus tanaman monokotil dan dikotil (Trigiano & Gray, 2000). Konsentrasi ion-ion dalam komposisi media SH sangat mirip dengan komposisi pada media Gamborg dengan perbedaan kecil yaitu level Ca2+, Mg2+, dan PO4-3 yang lebih tinggi. Schenk & Hildebrant mempelajari pertumbuhan jaringan dari 37 jenis tanaman dalam media SH dan mendapatkan bahwa: 32 % dari spesies yang dicobakan, tumbuh dengan sangat baik, 19% baik, 30% sedang, 14% kurang baik, dan 5% buruk pertumbuhannya. Tetapi karena zat tumbuh yang diberikan pada tiap jenis tanaman tersebut berbeda. Media SH ini cukup luas penggunaannya, terutama untuk tanaman legume. (Bastomi,2011) Media WPM (Woody Plant Medium) M edium)

dikembangkan oleh Lioyd & Mc Coen pada tahun 1981, merupakan media dengan konsentrasi ion yang lebih rendah dari media MS. Media diperuntukkan khusus tanaman berkayu, dan dikembangkan oleh ahli lain, tetapi sulfat yang digunakan lebih tinggi dari sulfat

pada media WPM. Saat ini WPM banyak digunakan untuk perbanyakan tanaman hias berperawakan perdu dan pohon-pohon. Pada umumnya media kultur jaringan dibedakan menjadi media dasar dan media perlakuan. Resep media dasar adalah resep kombinasi zat yang mengandung hara esensial (makro dan mikro), sumber energi dan vitamin. Dalam teknik kultur jaringan dikenal puluhan macam media dasar. Penamaan resep media dasar pada umumnya diambil dari nama penemunya atau peneliti yang menggunakan pertama kali dalam kultur khusus dan memperoleh suatu hasil yang penting artinya. (Colemann,2003) b. Jenis media berdasar keadaan fisik serta kelebihan dan kekurangan Media padat

Media padat adalah media yang mengandung semua komponen kimia yang dibutuhkan oleh tanaman dan dipadatkan dengan menambahkan zat pemadat. Zat pemadat tersebut dapat berupa agar-agar batangan, agar-agar bubuk, ataupun agar-agar kemasan kaleng yang khusus digunakan untuk keperluan laboratorium. Penggunaan agar-agar kemasan kertas(yang biasa digunakan sebagai bahan makanan) untuk medium kultur jaringan memerlukan perhitungan yang teliti,supaya medium tersebut tidak terlalu padat atau lembek. Penggunaan agar-agar kemasan kertas biasanya berkisar 8-10 g/liter. Media yang yang terlalu terla lu padat dapat mengakibatkan akar sukar tumbuh, media yang telalu lembek dapat menyebabkan tenggelamnya eksplan dan menyebabkan busuk dan akhirnya mengundang bakteri ataupun jamur. Metode padat dapat digunakan untuk kloning, untuk menumbuhkan protoplas setelah diisolasi, menumbuhkan planlet dari protokormus setelah dipindahkan dari suspensi sel,dan menumbuhkan planlet daridari potoplas yang sudah difusikan. Metode ini dilakukan dengan tujuan untuk mendapatkan kalus(induksi kalus) dan kemudian dengan medium diferensiasi yang

berguna untukmenumbuhkan akar serta tunas sehingga kalus dapat tumbuh menjadi planlet. (Yusnita,2005) Media cair

Jenis media ini sama dengan media padat hanya saja tanpa dilakukan penambahan zat pemadat. Penggunaan metode ini kurang praktis karena untuk menumbuhkan kalus langsung dari eksplan sangat sulit sehingga keberhasilannya sangat kecil dan hanya tanaman-tanaman tertentu saja yang dapat tumbuh, oleh karena itu pemakaian media cair ditekankan pada suspensi sel, yaitu untuk menumbuhkan protokormus. Dari protokormus ini nantinya dapat tumbuh menjadi planlet apabila dipindahkan ke media padat yang sesuai. Selain menumbuhkan protokormus, media cair juga digunakan untuk memperbanyak kalus dengan jalan berulang kali melakukan sub kultur. Suspensi sel dapat pula diartikan sebagai kultur dari sel-sel bebas di dalam media cair. Tujuan khusus dari suspensi sel adalah untuk memecah kalus menjadi single sel. (Prasetya, 2012)

2.2 Komposisi dan Fungsi Unsur Dalam Media MS (Murashige& Skogg)

Bahan-bahan yang digunakan dalam pembuatan medium MS, yaitu sebagai berikut: a ) Larutan Stok Makronutrient I dan II Larutan stok digunakan untuk menghindari ketidaktepatan dan pemborosan waktu karena perlunya pengukuran bahan tertentu dalam jumlah kecil. Jenis-jenis yang termasuk dalam unsur makro (unsur yang dibutuhkan dalam jumlah besar) adalah Nitrogen (N),

Kalium (K), Sulfur (S), Kalsium (Ca), Magnesium (Mg). Unsur NPK adal unsur yang paling mutlak diperlukan oleh tanaman. Tabel 1. Komposisi Makronutrien yang dibutuhkan Medium MS Makronutrient (mg/L) KN3 1.900 NH4NO3 1.650 CaCl.2H2O 440 MgSO4.7H2O 370 KH2PO4 170

b) FeNa2EDTA Unsur Fe dibutuhkan sedikit lebih banyak daripada unsu mikro lainnya. Didalam kultrur jaringan, pemberian unsur Fe juga berfungsi sebagai penyangga (chelatin agent) yang sangat penting untuk menyangga kestabilan Ph media selama digunakan untuk menumbuhkan jaringan tanaman. Pada tanaman, unsur Fe berfungsi untuk pernafasan dan pembentukan hijau daun. c) Larutan Stok Mikronutrient Unsur-unsur yang termasuk didalam unsur mikro (unsur yang dibutuhkan dibutuhkan dalam jumlah kecil tetapi harus tersedia) adalah Klor (Cl), Mangan (Mn), Besi (Fe), Tembaga (Cu), Seng (Zn), Bor (B), dan Molibdenum (Mo). Komposisi Mikronutrien yang dibutuhkan Medium MS Mikronutrient (mg/L) MnSO4.4H2O 22,3 ZnSO4.7H2O 8,6 H3BO3 6,2 KI

0,83 CuSO4.5H2O 0,025 NaMoO4.2H2O 0,25 CoCl2.6H2O 0,025 FeSO4.7H2O 27,8 NaEDTA.2H20 37,3 d) Myoinositol Penambahan myoinositol pada medium bertujuan untuk membantu diferensiasi dan pertumbuhan sejumlah jaringan. Bila myoinositol diberikan bersama auksin, kinetin, dan vitamin, maka dapat mendorong pertumbuhan jaringan kalus. e) Vitamin Vitamin-vitamin yang sering digunakan dalam media kultur jaringan antara lain adalah Tiamin (Vitamin B 1), Piridoksin (Vitamin B 6), dan Asam Nikotonat. Fungsi Tiamin adalah untuk mempercepat laju pembelahan sel, dan Asam nikotonat berfungsi penting dalam reaksireaksi enzimatis. Pemberian vitamin C biasanya bertujuan untuk mencegah terjadinya pencoklatan pada permukaan irisan jaringan. Tabel 1. Komposisi Vitamin yang dibutuhkan Medium MS Vitamin (mg/L) Myoinositol Thiamin HCl Nikotonik asid Piridoksin HCl Glisin

100 0,1 0,5 0,5 2

f) Sukrosa Sukrosa sering ditambahkan pada medium sebagai sumber energi yang diperlukan untuk induksi kalus. Sukrosa dengan konsentrasi 2% - 5% merupakan sumber karbon. Penggunaan sukrosa diatas kadar 3% menyebabkan erjadinya penebalan dinding sel. Pengaruh rangsangan dari gula terhadap pertumbuhan ditentukan juga oleh cara sterilisasinya. g) Hormon (Auksin dan Sitokinin) Dalam pertumbuhan jaringan, sitokinin berpengaruh terutama terhadap pembelahan sel. Bersama-sama dengan Auksin memberikan pengaruh interaksi erhadap diferensiasi jaringan. Pada pemberian auksin dengan kadar relatif tinggi, diferensiasi kalus cenderung ke arah pembentukan primordia akar. Sedangkan pada pemberian sitokinin dengan kadar yang relatf tinggi, diferensiasi kalu akan cenderung ke arah pembentukan primordia batang atau tunas. h) Agar Agar berfungsi sebagai zat pemadat untuk memadatkan semua komponen kimia yang terkandung dalam media dan yang sangat dibutuhkan oleh tanaman. Sebelum ditambahkan agar, medium terlebih dahulu diukur derajat keasamannya ( pH ). Sel-sel tanaman yang dikembangkan dengan teknik kultur jaringan mempunyai toleransi pH yang relatif sempita yaitu berkisar antara 5,0 – 6,0. Bila eksplan sudah mulai tumbuh, Ph dalam lingkungan kultur jaringan umumnya akan meningkat apabila nutrient habis terpakai. Dan terakhir adalah sterilisasi dengan autoclaf pada suhu 121 Oc selama 15 menit, untuk menghindari terkontaminasinya medium akibat proses pembuatan. (Novalin, 2009)

2.3 Teknik-teknik aseptic Dalam Pembuatan Media a. Penyiapan Media Media yang digunakan untuk menumbuhkan eksplan harus steril. Dalam media harus tersedia empat komponen, yaitu: 1) Sumber Karbon (gula tebu) 2) Hara Makro (makro nutrien) 3) Hara Makro (mikro utrien) 4) Vitamin dan hrmon tumbuh 5) Agar sebagai pemadat b. Sterilisasi Eksplan Eksplan atau bahan tanam yang hendak ditumbuhkan dalam botol kultur harus disterilkan terlebih dahulu. Bahan eksplan dicuci dengan detergen lalu dibilas bersih kemudian disterilisasi dengan cara dibakar sesaat atau direndam dalam larutan desinfektan. Selanjutnya, Selanjutnya, bahan eksplan dibilas dengan air steril beberapa kali. Bahan eksplan siap untuk dikultur. c.

Penanaman Eksplan Setelah bahan eksplan disterilkan dan dipotong-potong eksplan ditanam dalam botol kultur. Pemotongan eksplan dilakukan dalam ruang kultur yang steril dan dengan menggunakan alatalat yang steril pula.

d. Inkubasi dan Perkembangan Eksplan Botol-botol kultur yang telah ditanami ekpslan kemudian dipindahkan keruang inkubasi atau ruang penumbuhan.Pada ruang itu, diberikan penyinaran secara terus-menerus dengan 0 suhu ruang yang stabil (± 20 C)

e.

Aklimatisasi Setelah dihasilkan tanaman kecil (plantlet) yang cukup kuat untuk tumbuh, plantlet siap dikeluarkan, dipisahkan dan ditanami pada pot-pot penanaman. Selanjutnya pot dipindahkan ke green house agar terjadi proses penyesuaiansecara bertahap pada kondisi alam (aklimatisasi). (TIM IPA, 2007)

Teknik aseptik merupakan salah satu kunci keberhasilan dalam kutur jaringan. Keaseptikan harus dijaga dalam proses pengkulturan, selain itu juga termasuk sterilisasi bahan tanaman (eksplan). Pada tahap ini dilakukan berbagai perlakuan untuk membersihkan kotoran yang ada di permukaan bahan tanaman (disinfestasi) (Prawitasari 2005). Selain itu, zat pengatur tumbuh adalah senyawa organik bukan hara yang dalam jumlah sedikit dapat mendukung, menghambat dan dapat merubah proses fisiologi tanaman. (Puspa, 2011)

Caranya dengan sterilisasi eksplan, media, alat-alat, ruang steril dan ruang kultur (entkas / tempat khusus untuk menanam eksplan ke dalam medium). Sterilisasi merupakan upaya untuk menghilangkan kontaminan mikroorganisme yang menempel di permukaan eksplan. Peralatan yang akan digunakan untuk kultur jaringan harus disterilkan terlebih dahulu. Setelah dicuci dan dikeringkan, kemudian peralatan dibungkus dengan kertas payung atau aluminium foil dan disterilkan di dalam autoklaf dengan suhu 121oC, tekanan 15 psi (Pounds per Square Inch) dan lama sterilisasi 20-30 menit. Botolbotol eksplan yang sudah berisi medium setelah ditutup dengan aluminium foil, kemudian disterilkan. Sterilisasi medium lebih

singkat waktunya dibandingkan dengan sterilisasi peralatan, yakni 15 menit tetapi suhu dan tekanannya sama. (Nugroho,2005)

2.4 Rumus Perhitungan Larutan Stok

Larutan stok adalah larutan dengan konsentrasi yang lebih pekat dibandingkan dengan konsentrasi seharusnya, maka jika ingin memakainya, tinggal mengambil larutan stok tersebut untuk diencerkan sesuai dengan formula media kultur. (Sandra, 2005) Rumus perhitungan larutan stok: V1 M1 = V2 M2 V1 M1 V2 M2

: volume larutan yang dicari (x) : dosis larutan l arutan stok yang tersedia : volume medium yang akan dibawa : dosis medium yan akan dibuat (Hendrayato, 2003)

III.METODOLOGI

3.1 Alat, Bahan dan Fungsi 3.1.1 Alat

-

Botol kutur Karet gelang Plastik Plasti k tahan panas Gelas ukur Mikro pipet Beaker glass

- Timbangan analitik analit ik - pH universal

: sebagai tempat media kultur : untuk menutup botol kultur : sebagai penutup botol kultur : untuk mengukur larutan : untuk mengambil larurtan : untuk tempat pembuatan larutan stok : untuk menimbang bahan : untuk mengukur pH larutan

-

: sebagai pengaduk : untuk mensterilkan mensteril kan bahan : untuk menutup botol : sterilisasi botol kultur sebelum di

Stirer Microwave Alumunium foil Autocalve

masukkan ke ruangan pengamatan

3.1.2 Bahan

1. Unsur Makro NH4NO3 KNO3 MgSO47H2O KH2PO4 CaCl22H2O     

: 14,85 g : 17,1 g : 3,33 g : 1,53 g : 3,96 g

2. Unsur Mikro A H3BO3 : 0,038 g MnSO44H2O : 0,2007 g ZnSO47H2O : 0,0774 g   

Sebagai pembuat 300 ml media kultur larutan makro Untuk medai kultur (3 ml)

Untuk pembuatan 300 ml media kultur diambil 3 ml

3. Unsur Mikro B KI : 0,083 g Na2MoO47H2O : 0,025 g CuSO45H2O : 0,0025 g CoCl6H2O : 0,0025 g   

Untuk pembuatan 300 ml diambil larutan 0,3 ml



4. FeEDTA  

FeSO47H2O Na2EDTA

: 2,503 g : 3,357 g

Untuk pembuatan 300 ml diambil larutan 3 ml

5. Vitamin    

Tiamin HCl

: 0,001 g Peridoksin HCl : 0,005 g Asam Nikotinat : 0,005 g Olycine : 0,02 0,02 g

Untuk pembuatan 300ml diambil 0,3 larutan vitamin

3.2 Cara Kerja Pembuatan Media Kultur (Diagram Alir)

Bilas gelas dengan menggunakan aquades

Isi gelas dengan aquades kurang lebih 50 ml

Tambahkan unsur-unsur yang sudah di stok : Makro

: 30 ml

Mikro A

: 3 ml

Mikro B

: 0,3 ml

Fe EDTA

: 3 ml

Tambahkan aquades hingga volume mencapai 300 ml

Stirer (aduk) dan ukur pH (pH indikator)

Masukkan sukrosa (gula) dan agar-agar Sukrosa : 9 gram

Stirer (aduk) beberapa menit sampai larutan berwarna benin

Tutup dengan plastik wrap dan di lubangi

Mikrowave selama 7 menit

Masukkan ke dalam botol kultur @20 ml : 8 botol dengan tutup plastik

Autoclave 3.3 Analisa Perlakuan

Pertama, beaker glass dibilas dahulu dengan menggunakan aquades, bertujuan untuk menghilangkan dan membersihkan gelas breaker. Isi breaker glas dengan larutan aquades kurang lebih 50 ml. Setelah itu, tambahkan unsur-unsur larutan yang sudah di stok, yaitu : makro (30 ml), mikro A (3 ml), mikro B (0,3 ml), Fe EDTA (3 ml), Vitamin (0,3 ml) dan CaCl 2 (3 ml). Setelah semua larutan selesai

ditambahkan, tambahkan lagi aquades hingga volume mencapai 300 ml. Stirer (aduk) larutan dan ukut pH larutan menggunakan indikator pH hingga mencapai pH sekitar 5 – 6. Masukkan sukrosa (9 gram) dan agar-agar (2,1 gram) yang bertujuan untuk melarutkan larutan dan mengentalkan larutan. Stirer kembali sampai larutan berwarna putih bening. Setelah selesai, tutup breaker glas dengan plastik wrap dan masukkan ke dalam microwave selama 7 menit setelah selesai, masukkan larutan ke dalam botol kultur dengan 8 botol di tutup plastik, dan 6 botol ditutup alumunium. Masukkan ke autoclave untuk sterilisasi akhir, dan amati selama 2 minggu, apakah terjadi kontaminasi kontaminasi atau tidak.

BAB IV HASIL DAN PEMBAHASAN

4.1

Hasil (tabel perbandingan perlakuan) a. Tabel media kultur dengan penutup plastik

No

Hari Pengamatan Pengamatan KeKe Hari ke-2 (18 Oktober 2012)

Botol Ke1 2 3 4 5 6 7

Jenis Kontaminan Tidak ada Tidak ada Tidak ada Tidak ada Tidak ada Tidak ada Tidak ada

2

Hari ke 4 (20 Oktober 2012)

1 2 3 4 5 6 7

Tidak ada Tidak ada Tidak ada Tidak ada Tidak ada Tidak ada Tidak ada

Tidak terjadi kontamina n dengan warna yang masih putih dan sudah mengental

3


1 2 3 4 5 6 7 8

Tidak ada Tidak ada Tidak ada Tidak ada Tidak ada Tidak ada Tidak ada Tidak ada


4


1 2

Tidak ada Tidak ada

Tidak terjadi

1

Keterangan Tidak terjadi kontamina n dengan warna yang masih putih dan sudah mengental

3 4 5 6 7

Tidak ada Tidak ada Tidak ada Tidak ada Ada

kontamina n dengan warna yang masih putih dan sudah mengental. Botol ke 7 terkontami nasi jamur

5

Hari ke 17 *(2 November 2012)

1 2 3 4 5 6 7

Tidak ada Tidak ada Tidak ada Tidak ada Tidak ada Tidak ada Ada

Tidak terjadi kontamina n dengan warna yang masih putih dan sudah mengental Botol ke 7 terkontami nasi jamur

6

Hari ke 20 (5 November 2012)

1 2 3 4 5 6 7

Tidak ada Tidak ada Tidak ada Tidak ada Tidak ada Tidak ada Ada

Tidak terjadi kontamina n dengan warna yang masih putih dan sudah mengental Botol ke 7 terkontami nasi jamur

*Seharusnya 2 hari sekali selama 2 minggu, tetapi pengamatan tetap dilakukan hingga melebihi 2 minggu.

b. Tabel media kultur dengan penutup Aluminium Foil No

Hari Pengamatan Pengamatan KeKe -

Botol Ke-

Jenis Kontaminan

Keteranga n

1

Hari ke-2 (18 Oktober 2012)

1 2 3 4 5 6 7



2


1 2 3 4 5 6 7



3


1 2 3 4 5 6 7


Tidak terjadi kontamina n dengan warna yang masih

putih dan sudah mengental 4


1 2 3 4 5 6 7



5

Hari ke 17(2 November 2012)

1 2 3 4 5 6 7



6

Hari ke 20 (5 November 2012)

1 2 3 4 5 6 7



4.2 Pembahasan

Dari data hasil praktikum yang telah didapat, diketahui bahwa pembuatan media kultur yang telah dilakukan pada praktikum kali ini berhasil hampir 100%. Hal ini diketahui dari pengamatan yang telah dilaksanakan selama 2 minggu lebih.Dengan selang waktu 2 hari sekali dan pengamatan terakhir pada hari ke 20. Diperoleh yaitu warna dari larutan yang berada di dalam botol kultur tutup plastik maupun tutup alumunium berwarna putih dan sudah mengental. Pada botol kultur dengan tutup plastik, dilakukan percobaan sebanyak 7 botol. Pada pengamatan pertama, 7 botol tersebut tidak menunjukkan gejala-gejala terkontaminasi. Hal ini berlanjut ke pengamatan-pengamatan selanjutnya, dengan selang waktu 20 hari, 7 botol kultur masih menunjukkan hasil yang baik dan tidak terkontaminasi. Untuk botol dengan petutup alumunium, menunjukkan hasil yang sama dengan botol yang di tutup dengan menggunkana plastik. Pada saat praktikum, di lakukan percobaan dengan 7 botol yang di tutup dengan menggunakan alumunium foil. Selang jangka waktu 20 hari setelah praktikum, 6 botol kultur tersebut tidak terkontaminasi, dengan ciri-ciri larutan tetap berwarna putih dan sudah mengental seperti gel atau lem. Naamun terdapat 1 botol yang mengalami kontaminasi jamur. Hal itu ditandai ditandai dengan munculnya koloni koloni jamur yang berwarna coklat kehitaman. Sesuai dengan ciri-cirinya, ciri-cirinya, Kontaminasi pada eksplan dapat disebabkan oleh media eksplan dan kondisi lingkungan. Kontaminan dapat berupa jamur atau bakteri. Ciri-ciri eksplan yang terkontaminasi terkontam inasi adalah : 1) Apabila kontaminan berupa jamur, akan terlihat koloni jamur, biasanya berwarna putih, abu-abu atau hitam, berbentuk seperti serabut, benang, atau kapas. 2) Apabila kontaminan berupa bakteri, terlihat cairan berupa lendir berwarna putih atau merah.

Oleh karena itu, berdasarkan pengamatan yang didapat, kontaminan dikategorikan sebagai jamur. Untuk itu, dapat diketahui bahwasanya praktikum pembuatan media kultur ini berhasil cukup baik meski ada satu botol yang mengalami kontaminasi oleh jamur.

PENUTUP 5.1 Kesimpulan 





Jenis-jenis media pada kulur jaringan ada bebebrapa macam, antara lain : Media Knop (wortel), Media Knudson dan media Vacin and Went (anggrek), Media White (bunga matahari), Media Murashige & Skoog (media MS), Media Gamborg B5, Media Schenk & Hildebrant (media SH), Media WPM (Woody Plant Medium) Dalam media MS (Murashige dan Skogg), terdiri dari beberapa macam unsur yang terkandung di dalamnya, antara lain, makronutrien, mikronutrien, vitamin, dan zat besi. Rumus perhitungan larutan stok yang dibutuhkan, dapat menggunakan rumus : V1 x M1 = V2 x M2

Dari data hasil praktikum yang telah didapatkan, diketahui bahwa pembuatan media kultur yang telah dilakukan dapat dikatakan cukup berhasil. Hal ini diketahui dari pengamatan yang telah dilaksanakan selama 20 hari pengamatan (dengan selang waktu 2 hari sekali), yaitu warna dari larutan yang berada di dalam botol kultur tutup plastik maupun tutup alumunium foil berwarna putih dan sudah mengental. Hanya terdapat 1 kontaminan jamur pada botol ke 7 bertutup plastik. 5.2 Saran

Praktikum sudah berjalan cukup baik dan lancar. Diharapkan lebih baik lagi pada praktkum kedepannya.

DAFTAR PUSTAKA

Bastomi. 2011. Jenis-jenis Media Kultur Jaringan J aringan Untuk Berbagai Perbanyakan. (Online) http://bastomihuda.blogspot.com/2011/03/jenis-jenis-media-kultur jaringan-untuk.htm jaringan-untuk.html. l.diakses diakses 2 November 2012 Coleman, J. O. D., Evans, D.E., and Kearns, A. 2003. Plant Cell Culture. New York: BIOS Scientific Publishers. Hendaryono, D.P.S. dan A. Wijayani. 1994. Teknik kultur jaringan. Kanisius. Yogyakarta. pp.139. Hendrayanto. D.P.S., 2003. TEknik Kultur Jaringan, Pengenalan dan Petunjuk Perbanyakan Secara Vegetatif Modern. Kansius:Yogyakarta. Novalin, Novita.2009. Kultur Jaringan Pada Tanaman.(Online). http://novaldevlano.blogspot.com/2009/11/kultur-jaringanpada-tanaman.html..diakses 2 November 2012. pada-tanaman.html Nugroho, A. dan H. Sugito. 2005. Teknik kultur jaringan. Penebar Swadaya. Jakarta. pp.71. Puspa.2011.Induksi Kalus.(Online). http://puspalarasati.wordp http://puspalar asati.wordpress.com ress.com/category/k /category/kulturultur jaringan/ .diakses 2 November 2012 Prasetya, Eka. 2012. Jenis Media Tanam. (Online). http://khasindonesiaasliindonesia.blogspot.com/2012/05/jeni s-media-tanam.html. Diakses 2 November 2012 Prawitasari, T. 2005. Teknologi perbanyakan bibit jarak pagar (Jatropha curcas L) secara konvensional dan kultur jaringan. Makalah Seminar Nasional Pegembangan Jarak Pagar (Jatropha curcas L) untuk Biodiesel dan Minyak Bakar.

Bogor, 22 Desember 2005. Pusat Penelitian Surfaktan dan Bioenergi. LPPM-IPB, Bogor. Sandra. E, 2005. Kultur Jaringan Anggrek Skala Rumah Tangga. Grafindo:Bandung. TIM IPA, 2007. IPA 34. Yudistira: Jakarta. Yusnita. 2005. Kultur jaringan cara memperbanyak tanaman secara efisien. PT. Agromedia Agromedia Pustaka. Jakarta. J akarta. pp.103.

LAMPIRAN 1. Dokumentasi Hasil Akhir Pengamatan Penutup Plastik 1.

2.

3.

4.

5.

6.

7.

2. Dokumentasi Hasil Alumunium Foil

Akhir

Pengamatan

1.

2.

3.

4.

5.

6.

7.

Penutup

Teknik Aseptik pada Kultur Jaringan

Recommend Documents