Teknik Pengambilan Sampel Mikrobiologi

 Teknik  Teknik Pengambilan Pengambilan Sampel Sampel yang representatif adalah sampel yang sebisa mungkin mencerminkan dan menggambarkan komposisi dari suatu bagian atau batch (partai) tertentu. Harus dipastikan bahwa terambil jumlah yang cukup pada saat pengambilan sampel dan dihindari segala bentuk kesalahan yang dapat menyebabkan sampel menjadi bias. Sebaiknya sebelum dilakukan pengambilan sampel terlebih dahulu diperhitungkan kemungkinan-kemu kemungkinan-kemungkinan ngkinan yang terjadi dengan bakteri pada sampel seperti nasib sel setelah dilakukan pengambilan sampel kemungkinan sel menjadi mati atau malah bertambah sehingga hal ini perlu diantisipasi. Selain itu perlu dipertimbangkan dipertimbangkan pula distribusi bakteri sehingga sampel yang diambil dapat mewakili sepenuhnya. Prinsip pengambilan sampel secara umum adalah! ". Suatu bagian tertentu (dapat digambarkan digambarkan sebagai batch) yang mengandung  jenis dan jumlah jumlah bakteri tertentu. tertentu. #. $ari batch tersebut diambil sebagian kecil %olumenya untuk diinterpretasikan sesuai dengan kebutuhan. &. Sebagian kecil yang diambil ini (sampel) harus sedapat mungkin menggambarkan menggambarkan dari batch (populasi) tersebut baik dari segi jumlah ataupun jenis bakteri yang ada. '. Pengambilan sampel harus memenuhi syarat secara statistik bila ditinjau dari %olume yang diambil dan perulangan yang dilakukan. . Pada saat pengambilan sampel diharuskan supaya bakteri yang masuk ke dalam wadah penampung sampel benar-benar berasal dari sumbernya bukan berasal dari lingkungan sekitar. . Sampel yang mengandung bakteri tersebut dijaga supaya tetap menggambarkan kondisi kondisi yang ada sebelum memasuki tahap analisa. Supaya tercapai tujuan diatas maka dibutuhkan beberapa syarat tertentu yaitu! ". Semua peralatan pengambilan sampel harus steril dan dilindungi dari kontaminasi sebelum dan sesudah pengambilan sampel dilakukan. #. $ikerjakan dengan prosedur kerja aseptik yang baik dan dengan senyawa desinfektan yang sesuai. &. $ipilih peralatan atau wadah sampel yang cocok dan metode pengambilan yang sesuai dengan jenis sampel.

'. Sebaiknya dilaksanakan pencegahan kontaminasi dari operator dengan memakai sarung tangan dan masker. Pengambilan sampel sebaiknya dilakukan pada tempat yang sedikit atau tidak terdapat aliran udara. . Setelah diambil sampel langsung dianalisa. Pencegahan pertumbuhan mikroba dapat disimpan pada suhu dingin. *ika perlu dapat ditambahkan suatu +at ke dalam sampel dengan tujuan melindungi mikroba dari kerusakan. . Pelabelan sampel harus mengandung nama sampel waktu pengambilan tempat pengambilan nama operator dan keterangan lain yang mendukung. Secara umum sampel dengan konsentrasi bakteri yang melimpah tidak begitu membutuhkan teknik aseptik yang tinggi. ,eberapa buah sel bakteri kontaminan dari udara tidak akan berpengaruh banyak pada sampel "ml air limbah rumah tangga tetapi akan sangat berpengaruh pada pengambilan sampel meja aminar /ir 0low dengan teknik 1ontact Plate.

/lat yang digunakan 1ontoh peralatan yang biasa dipakai diantaranya adalah botol kaca botol plastik pinset spatula pipet sendok pisau gunting dll. Peralatan yang berupa wadah penampung harus steril bagian dalamnya sedangkan bagian luarnya sebaiknya didisinfeksi dengan senyawa-senyawa antimikroba seperti etanol sodium hipoklorit dll sedangkan peralatan untuk mengambil harus disterilisasi dengan cara yang tepat. Peralatan jangan sampai mengandung sisa-sisa senyawa yang dapat menghambat mikroorganisme misalnya sisa deterjen pada botol dari pencucian rutin atau sisa karat yang ada pada spatula. Semua peralatan juga tidak boleh terdapat sisa bahan yang berpotensi menjadi nutrisi seperti sisa agar atau gula. ,otol sampel yang digunakan dapat terbuat dari kaca atau plastik tahan panas dengan ukuran yang cocok. *enis botol yang direkomendasikan adalah botol gelas ,orosilicate berpenutup ulir dan lebih baik jika bermulut botol lebar. *ika menggunakan botol plastik sebaiknya terbuat dari material yang tidak beracun seperti polypropilene yang tahan disterilisasi dengan autoklaf berulang-ulang. ,ila dirasa perlu tutup botol dapat dibungkus dengan aluminum foil agar bagian leher botol lebih terhindar dari kontaminasi. 2antong plastik juga bisa dipakai keuntungannya adalah mengurangi berat dan resiko botol pecah. Sebelum melakukan isolasi terlebih dahulu dilakukan pengambilan sampel. ,erikut merupakan prosedur pengambilan sampel. ". Sampel tanah  *ika mikroorganisme yang diinginkan kemungkinan berada di dalam tanah maka cara pengambilannya disesuaikan dengan tujuan dan kebutuhan. 3isal jika yang

diinginkan mikroorganisma rhi+osfer maka sampel diambil dari sekitar perakaran dekat permukaan hingga ujung perakaran.. #. Sampel air Pengambilan sampel air bergantung kepada keadaan air itu sendiri. *ika beerasal dari air sungai yang mengalir maka botol dicelupkan miring dengan bibir botol melawan arus air. ,ila pengambilan sampel dilakukan pada air yang tenang botol dapat dicelupkan dengan tali jika ingin mengambil sampel dari air keran maka sebelumya keran dialirkan dulu beberapa saat dan mulut kran dibakar.

4solasi $engan 1ara Pengenceran ($ilution) ". Teknik Preparasi Suspensi Sampel yang telah diambil kemudian disuspensikan dalam akuades steril. Tujuan dari teknik ini pada prinsipnya adalah melarutkan atau melepaskan mikroba dari substratnya ke dalam air sehingga lebih mudah penanganannya. 3acam-macam preparsi bergantung kepada bentuk sampel ! a. Swab (ulas) dilakukan menggunakan cotton bud steril pada sampel yang memiliki permukaan luas dan pada umumnya sulit dipindahkan atau sesuatu pada benda tersebut. 1ontohnya adalah meja batu batang kayu dll. 1aranya dengan mengusapkan cotton bud memutar sehingga seluruh permukaan kapas dari cotton bud kontak dengan permukaan sampel. Swab akan lebih baik jika cotton bud dicelupkan terlebih dahulu ke dalam larutan atraktan semisal pepton water. b. 5inse (bilas) ditujukan untuk melarutkan sel-sel mikroba yang menempel pada permukaan substrat yang luas tapi relatif berukuran kecil misalnya daun bunga dll. 5inse merupakan prosedur kerja dengan mencelupkan sampel ke dalam akuades dengan perbandingan " ! 6 (w7%). 1ontohnya sampel daun diambil dan ditimbang  g kemudian dibilas dengan akuades ' ml yang terdapat dalam beaker glass. c. 3aseration (pengancuran) sampel yang berbentuk padat dapat ditumbuk dengan mortar dan pestle sehingga mikroba yang ada dipermukaan atau di dalam dapat terlepas kemudian dilarutkan ke dalam air. 1ontoh sampelnya antar alain bakso biji buah dll. Perbandingan antar berat sampel dengan pengenceran pertama adalah " ! 6 (w7%). 8nutk sampel dari tanh tak perlu dimaserasi

". Teknik Pengenceran ,ertingkat

 Tujuan dari pengenceran bertingkat yaitu memperkecil atau mengurangi jumlah mikroba yang tersuspensi dalam cairan. Penentuan besarnya atau banyaknya tingkat pengenceran tergantung kepada perkiraan jumlah mikroba dalam sampel. $igunakan perbandingan " ! 6 untuk sampel dan pengenceran pertama dan selanjutnya sehingga pengenceran berikutnya mengandung "7" sel mikroorganisma dari pengenceran sebelumnya. 1ara 2erja ! a. Sampel yang mengandung bakteri dimasukan ke dalam tabung pengenceran pertama ("7" atau "-") secara aseptis (dari preparasi suspensi). Perbandingan berat sampel dengan %olume tabung pertama adalah " ! 6 dan ingat akuades yang digunakan jika memakai teknik rinse dan swab sudah termasuk pengencer "-". Setelah sampel masuk lalu dilarutkan dengan mengocoknya (pengocokan yang benar dapat dilihat pada gambar disamping) b. $iambil " ml dari tabung "-" dengan pipet ukur kemudian dipindahkan ke tabung "-# secara aseptis kemudian dikocok dengan membenturkan tabung ke telapak tangan sampai homogen. Pemindahan dilanjutkan hingga tabung pengenceran terakhir dengan cara yang sama hal yang perlu diingat bahwa pipet ukur yang digunakan harus selalu diganti artinya setiap tingkat pengenceran digunakan pipet ukur steril yang berbeda7baru. Prinsipnya bahwa pipet tidak perlu diganti jika memindahkan cairan dari sumber yang sama. &. Teknik Penanaman a. Teknik penanaman dari suspensi  Teknik penanaman ini merupakan lajutan dari pengenceran bertingkat. Pengambilan suspensi dapat diambil dari pengenceran mana saja tapi biasanya untuk tujuan isolasi (mendapatkan koloni tunggal) diambil beberapa tabung pengenceran terakhir. a.". Spread Plate (agar tabur ulas) Spread plate adalah teknik menanam dengan menyebarkan suspensi bakteri di permukaan agar diperoleh kultur murni. /dapun prosedur kerja yang dapat dilakukan adalah sebagai berikut ! 9 /mbil suspensi cairan senamyak " ml dengan pipet ukur kemudian teteskan diatas permukaan agar yang telah memadat. 9 ,atang  atau batang drugal diambil kemudian disemprot alkohol dan dibakar diatas bunsen beberapa saat kemudian didinginkan dan ditunggu beberapa detik.

9 2emudian disebarkan dengan menggosokannya pada permukaan agar supaya tetesan suspensi merata penyebaran akan lebih efektif bila cawan ikut diputar. 9 Hal yang perlu diingat bahwa batang  yang terlalu panas dapat menyebabkan sel-sel mikroorganisme dapat mati karena panas.

a.#. Pour Plate (agar tuang)  Teknik ini memerlukan agar yang belum padat (:'o1) untuk dituang bersama suspensi bakteri ke dalam cawan petri lalu kemudian dihomogenkan dan dibiarkan memadat. Hal ini akan menyebarkan sel-sel bakteri tidak hanya pada permukaan agar saja melainkan sel terendam agar (di dalam agar) sehingga terdapat sel yang tumbuh dipermukaan agar yang kaya ;# dan ada yang tumbuh di dalam agar yang tidak banyak begitu banyak mengandung oksigen. /dapun prosedur kerja yang dilakukan adalah sebagai berikut ! 9 Siapkan cawan steril tabung pengenceran yang akan ditanam dan media padat yang masih cair (:'o1) 9 Teteskan " ml secara aseptis.suspensi sel kedalam cawan kosong 9 Tuangkan media yang masih cair ke cawan kemudian putar cawan untuk menghomogenkan suspensi bakteri dan media kemudian diinkubasi.

/lasan diteteskannya bakteri sebanyak " ml untuk spread plate dan " ml untuk pour plate karena spread plate ditujukan untuk menumbuhkan dipermukaanya saja sedangkan pour plate membutuhkan ruang yang lebih luas untuk penyebarannya sehingga diberikan lebih banyak dari pada spread plate.

b. Teknik Penanaman dengan
9 *angan pijarkan loop lalu putar cawan "=o1 lanjutkan goresan sampai habis.
b.#
,.& uadrant) 1ara kerja ! Hampir sama dengan goresan T namun berpola goresan yang berbeda yaitu dibagi empat. $aerah " merupakan goresan awal sehingga masih mengandung banyak sel mikroorganisma.
1ara 2erja 4solasi ,akteri dari Sampel Tanah ! 9 Tanah seberat " g dimasukan ke dalam tabung pengenceran "-" secara aseptis dan selanjutnya dilakukan pengenceran bertingkat sampai "-= 9 Tiga pengenceran terakhir diambil " ml untuk ditanam secara spread plate pada medium ?/ setelah selesai diinkubasi pada &@o1 selama "A#' jam 9 2oloni akan tumbuh pada ketiga cawan tersebut kemudian dipilih koloni yang relatif terpisah dari koloni lain dan koloni yang mudah dikenali 9 2oloni yang terpilih kemudian ditumbuhkan atau dimurnikan ke ?/ baru dengan teknik streak kuadran 9 4nkubasi "A#' jam.

Populasi mikroorganisme yang ada di alam sekitar kita ini ssangatlah besar dan cukup kompleks. ,eratus spesies mikroba menguasai setiap bagian tubuh kita. 3ereka terdapat dalam jumlah yang cukup basar. Sebagai contoh sekali kita bersin dapat mnebarkan beribu- ribu mikroorganisme. Satu gram tinja dapat mengandung  jutaan bakteri. /lam di sekitar kita baik itu tanah air maupunudara juga dihuni oleh kumpulan mikroorganisme.Penelitian yang layak mengenai mikroorganisme dalam berbagai habitat ini memerlukan teknik untuk memisahkan populasi campuran yang rumit ini atau yang biasanya dikenal dengan istilah biakan campuran menjadi spsies yang berbeda- beda yang bikenal dengan istilah biakan murni. ,iakan murni in teerdiri dari satu populasi sel yang semuanya berasal dari satu sel induk (Pelc+ar "6=). 3ikroorganisme dapat diperoleh dari lingkungan air tanah udara suubstrat yang berupa bahan pangan tanaman dan hewan. *enis mikroorganismenya dapat berupa bakteri khamir kapng dan sebagainya. Populasi dari mikroba yang ada di linkungan ini sangatlah beraneka ragam sehinga dalam mengisolasi diperlukan beberapa tahap penanaman sehingga berhasil diperoleh koloni yang tunggal. 2oloni yang tunggal ini kemudian yang akan diperbanyak untuk suatu tujuan penelitian misalnya untuk menngisolasi $?/ mikroba yang dapat mendeteksi mikroba yang telah resisten terhadap suatu antibiotik. /tau untuk mengetahui mikroba yang dipakai untuk bioremediasi holokarbon (0erdia+ "66#). Pemindahan bakteri dari medium lama ke medium yang baru atau yang dikenal dengan istilah inokulasi bakteri ini memerluakn banyak ketelitian. Terlebih dahulu kita harus mengusahakan agar semua alat- alat yang akan digunakan untuk pengerjaan medium dan pengerjaan inokulasi benar- benar steril. Hal ini untuk menghindari terjadinya kkontaminasi yaitu masuknya mikrooba lain yang tidak diinginkan sehingga biakan yang tumbuh di dalam medium adalah benar- benar biakan murni ($widjoseputro "66). $i dalam keadaaan yang sebenarnya dapat dikatakan bahwa tidak ada bakteri yang hidup secara tersendiri terlepas dari spesies yang lainnya. 2erap kali bakteri patogen kedapatan bersama- sama dengan bakteri saprob. 8ntuk menyendirikan suatu spesies dikenal beberapa cara yaitu ($widjoseputro "66) ! ". $egan pengenceran 1ara ini pertama kali dilakukan oleh ister pada tahun "=. 4a berhasil memelihara Streptococcus lactis dalampiraan murni yang diisolasi dari sampel susu Bang sudah masam. Suatu sampel dari suatu suspensi yang berupa campuran bermacammacam spesies diencerkan dalam suatu tabung yang tersendiri. $ari hasil pengenceran ini kemudian di ambil kira- kira " m untuk diencerkan lebih lanjut.

 *ika dari pengenceran yang ketiga ini diambil " m untuk disebarkan pada suatu medium padat kemungkinan besar kita akan mendapatkan beberapa koloni yang akan tumbuh dalam mdium tersebut akan tetapi mungkin juga kita hanya akan memperoleh satu koloni saja. $alam hal yang demikian ini dapat kita jadikan piaraan murni. *ika kita belum yakin ,ahwa koloni tunggal yang kita peroleh tersebut merupakan koloni yang murni maka kita dapat mengulang pengenceran dengan menggunakan koloni ini sebagai sampel. #. $engan penuangan 5obert 2och ("='&- "6) mempunyai metode yang lain yaitu dengan mengambil sedikti sampel campuran bakteri yang mudah diencerkan dan sampel ini kemudian di sebar di dalam suatu medium yang terbuat dari kaldu dan gelatin encer. $engan demikian dia memperoleh suatu piaraan adukan. Setelah medium tersebut mengental maka selang beberapa jam kemudian nampaklah koloni- koloni yang masing- masing dapat dianggap murni. $engan mengulang pekerjaan di atas maka akhirnya akan diperoleh piaraan murni yang lebih terjamin. /da beberapa metode yang biasanya dilakukan untuk menanam biakan di dalam medium diantaranya adalah (ay "66') ! ". 3etode cawan gores 3etode ini mempunyai dua keuntungan yaitu menghemat bahan dan waktu. ?amun untuk memperoleh hasil yang baik diperlukan keterampilan yang lumayan yang biasanya diperoleh dari pengalaman. 3etode cawan gores yang dilakukan dengan baik kebanyakan akan menyebabkan terisolasinya mikroorganisme yang diinginkan. $ua macam kesalahan yang umum sekali dilakukan adalah tidak memanfaatkan permukaan medium dengan sebaik- baiknya untuk digores sehingga pengenceran mikroorganisme menjaC kurang lanjut dan cenderung untuk menggunakan inokulum terlalu banyak sehingga menyulitkan pemisahan sel- sel yang digores. #. 3etode cawan tuang 1ara lain untuk memperoleh biakan koloni murni dari populasi campuran mikroorganisme ialah dengan mengencerkan eksperimen dalam medium agar yang telah dicairkan dan didinginkan yang kemudian di cawankan. 2arena konsentrasi sel- sel mikroba di dalam eksperimen pada umumnya tidak diketahui sebelumnya maka pengenceran perlu dilakukan beberapa tahap sehingga sekurang- kurangnyya satu di antara cawan D cawan tersebut mengandung koloni- koloni terpisah baik di atas permukaan maupun di dalam agar. 3etode ini memboroskan waktu dan bahan namun tidak memerlukan keterampilan yang terlalu tinggi. Proses pemisahan7pemurnian dari mikroorganisme lain perlu dilakukan karena semua pekerjaan mikrobiologis misalnya telaah dan identiCkasi mikroorganisme memerlukan suatu populasi yang hanya terdiri dari satu macam mikroorganisme

saja. Teknik tersebut dikenal dengan 4solasai 3ikroba. Terdapat berbagai cara mengisolasi mikroba yaitu (/dmin #=) ! ") 4solasi pada agar cawan Prinsip pada metode isolasi pada agar cawan adalah mengencerkan mikroorganisme sehingga diperoleh indi%idu spesies yang dapat dipisahkan dari organisme lainnya. Setiap koloni yang terpisah yang tampak pada cawan tersebut setelah inkubasi berasal dari satu sel tunggal. Terdapat beberapa cara dalam metode isolasi pada agar cawan yaitu! 3etode gores kuadran dan metode agar cawantuang.3etode gores kuadran. ,ila metode ini dilakukan dengan baik akan menghasilkan terisolasinya mikroorganisme dimana setiap koloni berasal dari satusel. 3etode agar tuang. ,erbeda dengan metode gores kuadran cawan tuang menggunakan medium agar yang dicairkan dan didinginkan (o1) yang kemudian dicawankan. Pengenceran tetap perlu dilakukan sehingga pada cawan yang terakhir mengandung koloni-koloni yang terpisah di atas permukaan7di dalamcawan. #) 4solasi pada medium cair 3etode isolasi pada medium cair dilakukan bila mikroorganisme tidak dapat tumbuh pada agar cawan (medium padat) tetapi hanya dapat tumbuh pada kultur cair. 3etode ini juga perlu dilakukan pengenceran dengan beberapa serial pengenceran. Semakin tinggi pengenceran peluang untuk mendapatkan satu sel semakin besar. &) 4solasi sel tunggal 3etode isolasi sel tunggal dilakukan untuk mengisolasi sel mikroorganisme berukuran besar yang tidak dapat diisolasi dengan metode agar cawan7medium cair. Sel mikroorganisme dilihat dengan menggunakan perbesaran sekitar " kali. 2emudian sel tersebut dipisahkan dengan menggunakan pipet kapiler yang sangat halus ataupun micromanipulator yang dilakukan secara aseptis.