U N I VE R S ID A D D E C O N CE P C IÓ N FACULTAD DE MEDICINA VETERINARIA Departamento de Ciencias Pecuarias
ESTUDIO PRELIMINAR DEL VENENO DE TACHYMENIS CHILENSIS (SCHLEGEL, 1837) Y PHILODRYAS CHAMISSONIS (WIEGMANN, 1835) CAPTURADAS EN LA OCTAVA REGIÓN DEL BIOBÍO, CHILE.
MEMORIA DE TÍTULO PRESENTADA A LA FACULTAD DE MEDICINA VETERINARIA DE LA UNIVERSIDAD DE CONCEPCIÓN PARA OPTAR AL TÍTULO DE MÉDICO VETERINARIO
GUSTAVO ANDRÉ VALENZUELA DELLAROSSA CHILLÁN – CHILE 2006
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PÁGINA DE FIRMAS ESTUDIO PRELIMINAR DEL VENENO DE TACHYMENIS CHILENSIS (SCHLEGEL, 1837) Y PHILODRYAS CHAMISSONIS (WIEGMANN, 1835) CAPTURADAS EN LA OCTAVA REGIÓN DEL BIOBÍO, CHILE.
Profesor Patrocinante
______________________________ Daniel González Acuña Profesor Asistente Médico Veterinario Doctor en Medicina Veterinaria
Profesor Guía
______________________________ Fidelina González Muñoz Profesor Asistente Biólogo Marino Doctor en Ciencias Ambientales
Director Departamento de Ciencias Pecuarias
______________________________ Óscar Skewes Ramm Profesor Asociado Médico Veterinario Doctor en Ciencias Forestales
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PÁGINA DE FIRMAS ESTUDIO PRELIMINAR DEL VENENO DE TACHYMENIS CHILENSIS (SCHLEGEL, 1837) Y PHILODRYAS CHAMISSONIS (WIEGMANN, 1835) CAPTURADAS EN LA OCTAVA REGIÓN DEL BIOBÍO, CHILE.
Profesor Patrocinante
______________________________ Daniel González Acuña Profesor Asistente Médico Veterinario Doctor en Medicina Veterinaria
Profesor Guía
______________________________ Fidelina González Muñoz Profesor Asistente Biólogo Marino Doctor en Ciencias Ambientales
Director Departamento de Ciencias Pecuarias
______________________________ Óscar Skewes Ramm Profesor Asociado Médico Veterinario Doctor en Ciencias Forestales
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RECONOCIMIENTOS Primero que nada, deseo dedicar esta Tesis a mi madre, Sylvanna Dellarossa P., quien siempre depositó su confianza en mí y me apoyó incondicionalmente en todo momento durante mi carrera. Quiero agradecer a mi familia – mamá, hermanos, abuelos, tías – y a mis amigos por toda la ayuda y paciencia que me tuvieron durante este tiempo. También quiero extenderlo a mi Profesor Patrocinante, Dr. Daniel González Acuña, y a mi Profesor Guía, Dra. Fidelina González Muñoz, quienes acogieron mis ideas y se mantuvieron en todo momento a mi lado. Además, quiero agradecer a la profesora Fabiola Cerda (Fac. Medicina Veterinaria) por indicarme cómo y con quiénes recurrir para ayudar con mi Tesis. Al doctor Pedro Urrutia Ur rutia (Fac. Medicina Veterinaria) por facilitarme el Halotano para el mejor manejo de las culebras del estudio. Al doctor René Ortega (Fac. Medicina Veterinaria) por facilitarme el refrigerador del Laboratorio de Virología para congelar las muestras extraídas antes de enviarlas a Concepción y los marcadores para rotular los microtubos Eppendorf ®. A la doctora Juanita López (Fac. Medicina Veterinaria) por facilitarme las micropipetas para hacer las extracciones de veneno. Al doctor Armando Islas (Fac. Medicina Veterinaria) por facilitarme los microtubos Eppendorf ® y la puntas de micropipetas utilizadas. A la profesora Victoria Merino (Fac. Medicina Veterinaria) por facilitarme “ Ice-Pack ” y cajas de plumavit para el envío en frío de las muestras a Concepción. A Andrés Rodríguez, auxiliar del Departamento de Patología y Medicina Preventiva, quien siempre tuvo la buena disponibilidad de facilitarme a cualquier hora la entrada al Laboratorio de Virología para guardar las muestras obtenidas. Al doctor Manuel de Orúe por su indicación sobre la parte estadística del estudio realizado. A las doctoras Florence Hugues y Lucila Moreno, con quienes siempre
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pude contar para hacer los trámites de mi Tesis en Chillán cuando me era imposible estar ahí. Al doctor Waldo Venegas (Fac. Ciencias Biológicas), que fue quien me presentó con la doctora Fidelina González, mi Profesor Guía, para trabajar en mi Tesis. Al doctor Juan Francisco Gavilán (Fac. Ciencias Biológicas) por permitirme ocupar el Laboratorio de Genética para mis experimentos. Al doctor Giancarlo de Ferrari (Fac. Ciencias Biológicas) por los papers que me entregó para mi Tesis. Al doctor Ángel Oñate (Fac. Ciencias Biológicas) por sus comentarios que aportaron a mejorar el escrito de mi Tesis. A la doctora Amparo Uribe (Fac. Ciencias Biológicas) por su ayuda con la parte de Espectrofotometría. Al doctor Silvio Pantoja (Fac. Ciencias Naturales y Oceanográficas) por su ayuda con la parte del HPLC. A la señora Ruth Chávez y al profesor José Cabello por su gran apoyo y buenas intenciones durante mi trabajo en el Laboratorio de Genética. A Cecilia Oñate por su ayuda con el SDS-PAGE en el Laboratorio de Genética. A los proyectos DIC-UDEC 200.031.085-1.0 y 203.031.095-1.0, Grupo de Investigación 03.C1.01, que me entregaron material y reactivos. A José Fernández, bibliotecario de la sección Hemeroteca de la Facultad de Medicina (Universidad de Chile, Campus Medicina Norte) por su enorme gentileza cuando fui a buscar referencias bibliográficas a aquella biblioteca. A Andrea Caiozzi por su información sobre bioterios y biblioteca de la Pontificia Universidad Católica. Al doctor Charif Tala por su gestión para la autorización del SAG al estudio realizado en esta Tesis. Al doctor Óscar Skewes por su gestión para la autorización del Comité de Ética del campus Chillán de la Universidad de Concepción al estudio realizado en esta Tesis. A la doctora Rosemarie Wilckens por sus comentarios sobre la representación del SDS-PAGE de la Tesis.
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A Javier Martinović, quien me autorizó amablemente a ausentarme de mi trabajo para realizar trámites en Chillán. Y a la señorita Mª Gabriela Ávila y a la señora Teresa Moreira, quienes me ayudaron con la obtención de las becas y poder estudiar exitosamente la carrera que siempre quise, sin cuya ayuda, probablemente jamás hubiese podido cumplir este sueño; así como también a Rebeca Cares. A todos ustedes, MUCHAS GRACIAS. También quiero aprovechar de pedir disculpas por si acaso se me ha olvidado mencionar a alguien que haya tenido una importante significancia en el desarrollo de esta Tesis, pero tengan por seguro que se los agradezco desde lo más profundo de mi corazón.
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TABLA DE CONTENIDOS Capítulo I. RESUMEN:
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II. SUMMARY:
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III. INTRODUCCIÓN:
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IV. MATERIALES Y MÉTODOS:
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V. RESULTADOS:
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VI. DISCUSIÓN:
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VII. CONCLUSIONES:
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VIII. REFERENCIAS:
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IX. APÉNDICE:
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ÍNDICE DE FIGURAS Nombre Fig. 1. Tachymenis chilensis y Philodryas chamissonis : Fig. 2. Esquema de SDS-PAGE:
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ÍNDICE DE TABLAS Nombre
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Tabla 1. Pesos moleculares (kDa) de las proteínas encontradas en los venenos de culebras chilenas analizadas según SDS-PAGE:
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Tabla 2. Resultado del análisis porcentual de los aminoácidos obtenidos de las proteínas de los venenos analizados:
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Apéndice 1. Planilla de identificación de los ejemplares colectados:
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I. RESUMEN ESTUDIO PRELIMINAR DEL VENENO DE TACHYMENIS CHILENSIS (SCHLEGEL, 1837) Y PHILODRYAS CHAMISSONIS (WIEGMANN, 1835) CAPTURADAS EN LA OCTAVA REGIÓN DEL BIOBÍO, CHILE. PRELIMINARY STUDY OF TACHYMENIS CHILENSIS (SCHLEGEL, 1837) AND PHILODRYAS CHAMISSONIS (WIEGMANN, 1835) VENOM CAPTURED IN BIOBÍO’S EIGHTH REGION, CHILE. Las culebras de mayor distribución en Chile son la culebra de cola corta, Tachymenis chilensis (Squamata: Colubridae) y la culebra de cola larga, Philodryas chamissonis (Squamata: Colubridae). La toxicidad de un veneno es
directamente proporcional a la cantidad de proteínas que éste posee y el veneno de T. chilensis es más tóxico que el de P. chamissonis . Sobre esta base, se intentó identificar las proteínas del veneno de T. chilensis y de P. chamissonis , a través del uso de electroforesis en geles de poliacrilamida con dodecil sulfato de sodio (SDS-PAGE), así como también identificar y comparar el número de proteínas en ambos venenos, determinar y comparar la concentración de proteínas en ambos venenos, y determinar la composición de aminoácidos en bandas de proteínas del veneno de P. chamissonis . Para el estudio se utilizaron 20 individuos de P. chamissonis y 7 de T. chilensis . El veneno se extrajo mediante la técnica de Ferlan et al . (1983). Para el análisis se utilizó SDS-PAGE, espectrofotometría y cromatografía líquida de alta resolución (HPLC) reversa. Los resultados demostraron que ambos venenos poseen proteínas evidenciables con el uso de SDS-PAGE y sin diferencias entre la cantidad de bandas electroforéticas. La concentración de proteínas del veneno de P. chamissonis fue mayor que la del veneno de T. chilensis . El veneno de P. chamissonis es rico en alanina, histidina y treonina, pero pobre en leucina y lisina. Palabras claves: Colubridae, veneno, SDS-PAGE, espectrofotometría, HPLC.
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II. SUMMARY The snakes of widest distribution in Chile are the short-tailed snake, Tachymenis chilensis (Squamata:
Colubridae) and the long-tailed snake, Philodryas
chamissonis (Squamata: Colubridae). The toxicity of venom is directly proportional
to the quantity of proteins that it possesses and the T. chilensis venom is more toxic than that of P. chamissonis . On this base, it was attempted to identify the proteins of T. chilensis venom and P. chamissonis venom, through sodium dodecyl sulphate-polyacrylamide gel electrophoresis (SDS-PAGE), as well as to identify and compare the number of proteins in both venoms, to determine and to compare the concentration of proteins in both venoms, and to determine the composition of amino acids in protein bands of P. chamissonis venom. For the study 20 individuals of P. chamissonis and 7 of T. chilensis were used. The venom was extracted by means of the technique of Ferlan et al . (1983). The venoms were analyzed with SDS-PAGE, spectrophotometry and reverse high performance liquid chromatography (HPLC). The results demonstrated that both venoms possess proteins that can be proved through the use of SDS-PAGE and in a same range and without differences among the quantity of electrophoretic bands. The concentration of proteins of P. chamissonis venom was bigger of T. chilensis venom. The P. chamissonis venom is rich in alanine, hystidine and threonine but poor in leucine and lysine. Keywords: Colubridae, venom, SDS-PAGE, spectrophotometry, HPLC
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III. INTRODUCCIÓN Ofidios. Los ofidios son un grupo monofilético originado de ancestros lagartos, pertenecen al suborden Ophidia (= Serpentes), incluido en el orden Squamata de la clase Reptilia (Kochva, 1987). Los ofidios actuales están representados por unas 2400 especies, incluidas en unas 15 familias, de las cuales, las genuinamente venenosas son 3 (infraorden Alethinophidia; superfamilia Colubroidea): Colubridae, Elapidae y Viperidae (Rabb & Marx, 1973; Kochva, 1987). La familia Colubridae contiene alrededor del 75% de todas las especies vivas de ofidios (unas 1800) y está compuesta de, por lo menos, 6 subfamilias. Aún cuando éstas son consideradas inofensivas, alrededor de un tercio de ellas poseen colmillos capaces de inocular veneno, pudiendo algunas llegar a ser mortales para el hombre (McKinstry, 1978; Kochva, 1987; Weinstein & Kardong, 1994). Aparato venenoso de las serpientes. Según la disposición y la forma del aparato inoculador del veneno, las serpientes se dividen en 4 grupos: aglifas, opistoglifas, proteroglifas y solenoglifas. Las aglifas poseen dientes lisos y macizos (algunos géneros de Colubridae). Las opistoglifas poseen un par de colmillos en la extremidad posterior del maxilar con un surco para vaciar el veneno (algunos géneros de Colubridae). Las proteroglifas poseen un par de colmillos fijos en la extremidad anterior del maxilar con un surcoconducto para inyectar veneno (Elapidae). Las solenoglifas poseen un par de colmillos en la extremidad anterior del maxilar con una curvatura antero-posterior y un conducto central que lo atraviesa en toda su longitud, en reposo están en posición horizontal y en agresión se enderezan y se hacen verticales (Viperidae) (Gajardo-Tobar, 1947; 1958; Donoso-Barros, 1965; Kochva, 1987). El aparato venenoso de las serpientes está constituido por 6 estructuras: la glándula secretora de veneno, semejante a la parótida por su posición anatómica y estructura histológica; el músculo masetero, que funciona como aparato compresor automático de dicha glándula; los colmillos o dientes inoculadores; los
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dientes de repuesto, para reemplazar al colmillo cuando se inutiliza; un repliegue membranoso, que cubre los colmillos en reposo; y el hueso basilar, en solenoglifas, un huesecillo que pone al colmillo en posición vertical u horizontal automáticamente (Gajardo-Tobar, 1947; 1958). La glándula venenosa es acinar con epitelio cilíndrico y células altas, con núcleo basal y citoplasma con granulaciones, y secreción de tipo mixta (Gajardo-Tobar, 1947; 1958). El veneno es almacenado en el lumen de la glándula (extracelular) y no intracelular, a diferencia de las glándulas salivales (Oron & Bdolah, 1973). La glándula del veneno en Colubridae se llama glándula de Duvernoy, en honor al morfologista francés George Louis Duvernoy (1777-1855) (Kochva, 1987; Weinstein & Kardong, 1994). Está localizada sobre los dientes maxilares posteriores, por donde se vacía a la cavidad oral mediante un conducto sencillo (McKinstry, 1983; Kochva, 1987; Weinstein & Kardong, 1994). En la glándula de Duvernoy no hay grandes reservas de veneno y, en la mayoría de las especies, la glándula no recibe conexión muscular directa, a diferencia de Elapidae y Viperidae (Sakai et al ., 1984; Weinstein & Kardong, 1994). Esta glándula está presente en la mayoría de las especies de Colubridae (opistoglifas y algunas aglifas) (McKinstry, 1978; McKinstry, 1983; Weinstein & Kardong, 1994). El ducto de la glándula de Duvernoy no forma un sello hermético con los colmillos, abriéndose a un reflejo del epitelio oral que rodea al colmillo. Los colmillos pueden estar o no acanalados, pero nunca forman un canal cerrado. Restringida a Colubridae, la glándula de Duvernoy es homóloga a las verdaderas glándulas venenosas de proteroglifas y solenoglifas. Diferencias en inervación y embriología confirman que la glándula de Duvernoy no es homóloga a la glándula parótida de los mamíferos (Weinstein & Kardong, 1994). Muchos Colubridae usan una secreción oral producida por la glándula de Duvernoy para capturar a su presa (Rosenberg, 1992). Envenenamientos producidos por opistoglifas y aglifas nublan la separación entre serpientes venenosas y no venenosas; ocasionalmente, el envenenamiento en humanos produce sintomatología clínica, fluctuando desde asintomáticos hasta fatales, entre estos envenenamientos, se pueden citar Alsophis portorricensis (Heatwole &
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Banuchi, 1966), Hypsiglena
ochrorhyncha (Goodman,
1953), Heterodon
platyrhinos (Grogan, 1974), H. nasicus (Kapus, 1964), Thamnophis couchi (Vest,
1981), T. elegans (Vest, 1981), Philodryas baroni (Kuch & Jesberger, 1993), P. olfersii (Nickerson & Henderson, 1976; Silva & Buononato, 1983/84); Rhabdophis tigrinus (Mittleman & Goris, 1974), R. subminatus (Mather et al ., 1978), Thelotornis kirtlandii (FitzSimons & Smith, 1958). En total, se han señalado 50 especies de
Colubridae implicados en envenenamientos humanos que hasta hace poco eran consideradas inocuas o sólo remotamente peligrosas, de éstas, 3 especies han resultado letales para el hombre, Dispholidus typus (opistoglifa de África), Thelotornis kirtlandii (opistoglifa de África) y Rhabdophis tigrinus (aglifa de Japón)
(McKinstry, 1978; Rosenberg, 1992; Weinstein & Kardong, 1994). Así, aunque los envenenamientos humanos por opistoglifas son raros, el efecto potencial es similar al observado en algunas serpientes proteroglifas y solenoglifas. Estas observaciones enfatizan la necesidad para aumentar el estudio de la potencial toxicidad y farmacología de las secreciones de la glándula de Duvernoy (McKinstry, 1978; Rosenberg, 1992; Weinstein & Kardong, 1994). Las funciones de las secreciones de la glándula de Duvernoy son subyugar y lubricar a la presa para facilitar la alimentación y ayudar en su digestión, y también pueden neutralizar toxinas de los anfibios; siendo así parecidas a los venenos de Viperidae y Elapidae. En humanos, la mordedura puede o no producir reacciones de significancia médica (Weinstein & Kardong, 1994). En Colubridae, el indicador morfológico primario de toxicidad es la presencia de la glándula de Duvernoy y el indicador morfológico secundario de toxicidad es la presencia de colmillos (McKinstry, 1983).
Culebras chilenas. La herpetofauna chilena, considerablemente variada en lagartos, es muy pobre en lo que respecta a culebras (Donoso-Barros, 1962). Es así que, en Chile continental, sólo existe 1 familia (Colubridae) con 2 géneros ( Tachymenis y Philodryas ) y con un total de 5 especies ( T. chilensis , T. peruviana , P. chamissonis , P. tachymenoides y P. elegans ) que, comparado con las más de 80
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especies de lagartos, la fauna ofídica es totalmente exigua (Donoso-Barros, 1962; SAG, 2000). De éstas, las 2 especies que destacan en importancia, debido a su abundancia y distribución, siendo las únicas que habitan en el centro y sur de Chile, son la culebra de cola corta, T. chilensis (Schlegel, 1837) y la culebra de cola larga, P. chamissonis (Wiegmann, 1835) (Gajardo-Tobar, 1947; Schenone et al ., 1954; Gajardo-Tobar, 1958; Donoso-Barros & Cárdenas, 1962; Schenone &
Reyes, 1965; Strozzi, 1966; SAG, 2000). Todas las especies continentales son opistoglifas (Gajardo-Tobar, 1947; 1958; Donoso-Barros, 1962; Donoso-Barros & Cárdenas, 1962); sus glándulas de Duvernoy son de color blanquecino con pequeñas lobulaciones, de las cuales, parte un conducto que las comunica con los dientes posteriores, que presentan un ligero canal, muy poco pronunciado en Philodryas y proporcionalmente de mayor tamaño en Tachymenis . La secreción es de tipo serosa (McKinstry, 1983) y de color blanco-lechosa (Donoso-Barros & Cárdenas, 1962). Dada su característica de ser opistoglifas, no inyectan su veneno sino que éste fluye por encima del último diente de la maxila, por lo cual, pocas veces lo inoculan en el hombre, puesto que necesitan morder con toda la arcada dentaria. Por este motivo, muchas personas que han sido mordidas por estas culebras solamente presentan lesiones traumáticas ocasionadas por sus dientes (Schenone et al ., 1954; Schenone & Reyes, 1965). Hasta 1938 se consideraban completamente inofensivas para el hombre por no existir antecedentes de ofidismo (Gajardo-Tobar, 1947; Schenone & Reyes, 1965). Debido a que los casos de ofidismo por estas especies son escasos y con efectos moderados, se han realizado pocas investigaciones sobre la estructura de sus glándulas de Duvernoy (Strozzi, 1966). No obstante, la literatura médica chilena ha registrado variados casos de ofidismo. Los sujetos intoxicados muestran dolor intenso, edema frío y cianosis en el sitio de la mordedura, inflamación de los linfonódulos regionales, equimosis, sed, fiebre, fatiga o hipotermia, bradicardia, cefalea y astenia, pero con lucidez. Los enfermos se reponen en un plazo de 5 a 15 días, sin registrarse casos mortales (Johow, 1938; Rayo et al ., 1938; Schenone et al ., 1954; Gajardo-Tobar, 1947; 1958; Schenone et al ., 1954; Donoso-Barros,
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1962; Schenone & Reyes, 1965). Sin embargo, pese a lo señalado, este tipo de accidentes puede evitarse al no tomarlas ni dejarse morder por ellas, porque solamente en estas condiciones logran abrir lo suficiente la boca para alcanzar la piel con los colmillos y poder inyectar su veneno (Donoso-Barros, 1962). T. chilensis (Fig. 1a) se distribuye desde la III hasta la X Región (incluida la isla de
Chiloé) desde el nivel del mar hasta los 4000 msnm, prefiriendo hábitats más fríos y húmedos que P. chamissonis (Hellmich, 1937; Greene & Jaksi ć, 1992; Ortiz et al ., 1994). No sobrepasa los 60 cm de longitud, correspondiendo su cola a
alrededor de un 15% del largo total (de ahí su nombre vulgar de “cola corta”) (Schenone & Reyes, 1965; Greene & Jaksi ć, 1992; Ortiz et al ., 1994). Tiene una cabeza con contorno alargado, tonos café y 2 líneas negras a ambos lados de una banda occipital clara (Hellmich, 1937; Donoso-Barros, 1962). Tiene pupilas verticales y hemipenes en forma de maza con numerosas espinas cortas (Greene & Jaksić, 1992; Ortiz et al ., 1994). Las escamas dorsales forman 19 corridas al medio del cuerpo, siendo lisas, romboidales, subimbricadas y con sus vértices redondeados; las placas ventrales fluctúan entre 140 y 164; la placa anal está dividida y las placas subcaudales varían entre 35 y 54. La coloración de fondo puede variar desde un café grisáceo metálico oscuro hasta rojizo, sobre el cual hay, en la parte dorsal, una banda vertical angosta clara sobre un fondo café o gris, ribeteada por 2 cintas negras paravertebrales que se extienden hasta la cola; las partes laterales están recorridas por una cinta oscura, algo clara en el borde superior; la parte ventral está bordeada por una banda negra en su borde posterior, la cual, se puede prolongar hacia delante en la porción media (Hellmich, 1937; Schenone & Reyes, 1965; Ortiz et al ., 1994). Es una serpiente ágil que mata a sus presas mediante una mordida persistente en la que actúan secreciones venenosas. Posee dientes opistoglifos proporcionalmente alargados y grandes, que presentan un canal externo por donde inyecta el veneno; tiene un buen desarrollo de la glándula de Duvernoy. Se alimenta preferentemente de anfibios (Pleurodema , Eupsophus , etc.), aunque también de lagartijas ( Liolaemus ); sin mostrar un cambio ontogénico en dieta. Su reproducción es vivípara; el desarrollo embrionario se inicia a la salida de su letargo invernal y los nacimientos se pueden
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observar a partir de fines de octubre. La cantidad de crías varía de 6 a 10 (Greene & Jaksić, 1992; Ortiz et al ., 1994). Es más agresiva que P. chamissonis (Greene & Jaksić, 1992). T. chilensis es considerada especie vulnerable para toda su distribución en el territorio nacional (Ortiz et al ., 1994; SAG, 2000). P. chamissonis (Fig. 1b) se distribuye desde la III hasta la IX Región desde el nivel
del mar hasta los 1730 msnm, prefiriendo hábitats más cálidos y secos que T. chilensis , y ocasionalmente cercanos a las inmediaciones humanas (Hellmich,
1937; Greene & Jaksić, 1992; Ortiz et al ., 1994). Los adultos pueden alcanzar un tamaño de 150 a 200 cm de longitud, correspondiendo su cola a alrededor de un 30% del largo total (de ahí su nombre vulgar de “cola larga”) (Schenone & Reyes, 1965; Greene & Jaksić, 1992; Ortiz et al ., 1994). La cabeza es alargada (DonosoBarros, 1962). Tiene pupilas redondeadas y hemipenes considerablemente grandes con una doble hilera de espinas laterales (Greene & Jaksi ć, 1992; Ortiz et al ., 1994). El cuerpo es robusto, con escamas dorsales que forman 19 corridas al
medio del cuerpo, siendo lisas, hexagonales, imbricadas y alargadas; las escamas ventrales forman placas únicas en número de 180 a 190 a lo largo del cuerpo, desde la cabeza hasta la placa anal, que está dividida; las escamas del dorso de la cola son hexagonales y redondeadas; las placas subcaudales varían de 90 a 110. El diseño dorsal está formado por una banda ancha café oscuro; a los lados está bordeada de negro y, por fuera, por una faja blanco-amarillenta que se diluye con el color amarillo-ocre de los lados del cuerpo; en el vientre son blancogrisáceas bordeadas de negro. En algunos ejemplares se presentan caracteres melánicos, lo que hace que el dorso puede estar salpicado de negro, al igual que el vientre (Hellmich, 1937; Schenone & Reyes, 1965; Ortiz et al ., 1994). Es una especie que mata a sus presas fundamentalmente por constricción. Sus dientes, opistoglifos, son ligeramente acanalados o carecen de canal de veneno; tiene un buen desarrollo de la glándula de Duvernoy. Su alimentación consiste principalmente de lagartijas ( Liolaemus ) y sapos (Pleurodema ), pero también forman parte de su dieta algunos roedores ( Octodon ) e incluso gazapos y polluelos; existe un cambio ontogénico en la dieta, depredando los individuos jóvenes sólo presas ectotérmicas. Su reproducción es ovípara; las hembras
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depositan desde 6 hasta 18 huevos elipsoidales de cubierta pergaminosa, que miden de 3 a 4 cm y no requieren atención parental (Greene & Jaksi ć, 1992; Ortiz et al ., 1994). Es un especie poco agresiva y los síntomas de su mordida son más
atenuados que los producidos por T. chilensis (Greene & Jaksić, 1992). Es considerada especie rara para su distribución en la Zona Norte y especie vulnerable para las Zonas Central y Sur (Ortiz et al ., 1994; SAG, 2000). Otra especie que, si bien no pertenece estrictamente al territorio chileno continental, se señala en el área del Pacífico que incluye a la polinésica Isla de Pascua, es la serpiente marina Pelamis platurus (Elapidae: Hydrophiinae), ictiófaga, vivípara y de costumbres pelágicas. Sin embargo, jamás se ha registrado en las aguas de la costa de Chile continental (Donoso-Barros, 1962).
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Fig. 1. Tachymenis chilensis (a) y Philodryas chamissonis (b). Autores: Dr. Daniel González A. (a) y Dra. Fidelina González M. (b).
Estudios en venenos ofídicos. El veneno secretado por las glándulas de las serpientes tiene efectos variados. Los toxicólogos reconocen acciones como la digestión de los tejidos en el sitio de la mordedura, pudiendo llegar a quedar los huesos a la vista o producirse amputaciones completas por proteólisis. En otros casos, el veneno actúa sobre la sangre, con efectos coagulantes, anticoagulantes o hemolíticos. Sobre el sistema nervioso se pueden producir lesiones que determinan parálisis, muchas veces mortales, porque detienen los mecanismos respiratorios o de control sanguíneo.
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Algunas serpientes africanas son capaces de arrojar el veneno con excepcional puntería sobre los ojos, que al absorberse a través de la conjuntiva ocular origina severas intoxicaciones (Donoso-Barros, 1965). El estudio de la biosíntesis de los componentes del veneno a nivel molecular se inició a comienzos de la década del 1970 (Kochva, 1987). Los venenos de las serpientes son mezclas complejas de sustancias biológicamente activas, primariamente proteínas, las cuales, les permiten someter y digerir a su presa eficazmente, y reforzar la defensa contra potenciales depredadores. La farmacología, toxicología, bioquímica y otras propiedades de los venenos de Viperidae y Elapidae han sido estudiadas extensivamente; pero las características y propiedades de las secreciones producidas por la glándula de Duvernoy han recibido menor atención (Weinstein & Kardong, 1994). Según la especie, los venenos poseen distintos compuestos, principalmente fosfolipasas A, también proteasas, hemorraginas, citotoxinas, cardiotoxinas y neurotoxinas (Kochva, 1987). Los efectos in vivo e in vitro son similares (Mackay et al ., 1969). Cuando la glándula del veneno se vacía, tarda unas 2 semanas en reponerse, cambiando su composición al disminuir el porcentaje de agua y aumentar la concentración de las proteínas (Oron & Bdolah, 1973). La cantidad de veneno acumulado en la glándula es variable tanto a niveles intra- como interespecíficos; más bien parece haber una correlación entre el tamaño de la serpiente y la cantidad de veneno que produce (Kochva, 1987). Algunas muestras pueden contener una alta proporción de componentes no proteicos y pocos niveles de proteína, que pueden ser relativamente simples. La toxicidad de las secreciones de la glándula de Duvernoy es directamente proporcional al contenido proteico (Weinstein & Kardong, 1994). El veneno de proteroglifas y solenoglifas se ha estudiado bastante porque es fácil de obtener y tiene una clara significancia clínica. En cambio, obtener la secreción de la glándula de Duvernoy en cantidad suficiente es un proceso complejo y su importancia clínica es menor (Rosenberg, 1992; Hill & Mackessy, 1997). Caracterizar las propiedades y componentes de estas secreciones es difícil por la baja cantidad extraída, por la pobre recuperación de las fracciones proteicas y por
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el escaso apoyo económico para su investigación, las cuales, tienen una leve importancia médica y en salud pública (McKinstry, 1978; Weinstein & Kardong, 1994). Por lo tanto, el estudio del veneno de estas serpientes representaría una potencial fuente de nuevos compuestos a descubrir (Weinstein & Kardong, 1994; Hill & Mackessy, 1997). En serpientes proteroglifas y solenoglifas, la extracción se acompaña de una presión en los colmillos con el borde de un frasco y extracción manual y/o estimulación eléctrica de la glándula del veneno. Sin embargo, esta técnica no es apropiada en Colubridae, porque el ducto de la glándula de Duvernoy no forma un sello hermético con el colmillo y la musculatura estriada rara vez establece una inserción directa sobre la glándula. Tampoco hay una gran reserva extracelular en Colubridae, por lo que hay menos secreción lista para extraer. La obtención de muestras de la glándula de Duvernoy que sean significativamente grandes es compleja y es el principal obstáculo para la caracterización de la actividad biológica de estas secreciones. Por ello, para colectar secreciones de la glándula de Duvernoy se han descrito 4 métodos: (1) Lavado de las membranas orales, usando una micropipeta conectada a un frasco Erlenmeyer y éste a una fuente de vacío, la muestra se colecta en un tubo Eppendorf®, se congela y se liofiliza; (2) Directamente desde los colmillos, usando una micropipeta sobre el colmillo y la secreción se comienza a colectar lentamente en la pipeta, la secreción colectada se centrifugada y se filtrada, entonces se congela y se liofiliza; (3) Pipeta y estimulación parasimpaticomimética (Pilocarpina) combinadas con anestesia (Halotano o Isofluorano + Ketamina-HCl), posteriormente se une al sistema de la pipeta descrito anteriormente y (4) Maceración de la glándula posterior al sacrificio del animal, una vez removidas las glándulas deben mantenerse cuidadosamente en hielo y deben macerarse hasta homogenizarse en un frasco frío con hielo, entonces el macerado se extrae con suero fisiológico y se coloca en una solución tampón, luego se centrifuga, se filtra y se congela entre -30 y -70°C (Weinstein & Kardong, 1994).
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En Colubridae, el principal componente que muestra toxicidad y actividad enzimática es la fosfolipasa A2, además existen compuestos con propiedades coagulantes y neurotóxicos (Rosenberg et al ., 1985; Kochva, 1987). Entre las propiedades inmunológicas de la secreción de la glándula de Duvernoy está la obtención de sueros antiofídicos monovalentes. Hay una significativa inmunorreacción cruzada entre los venenos de Viperidae y Elapidae y algunas secreciones de Colubridae (Weinstein & Kardong, 1994). La mayoría de los estudios farmacológicos han investigado los efectos hemodinámicos de las secreciones coagulopáticas ( Dispholidus , Thelotornis , Rhabdophis ); pero casi no hay datos con respecto a la neurofarmacología de la
glándula de Duvernoy, salvo pocos estudios en Boiga . Aunque se le ha dado relativamente poca atención al estudio de sus secreciones, hay un gran potencial de identificar nuevas toxinas y herramientas farmacológicas para estudiar coagulopatías (Weinstein & Kardong, 1994). Además, algunos compuestos de la secreción pueden ayudar, mediante filogenia, a la organización taxonómica, al entregar una importante fuente de información con respecto a la evolución de la glándula del veneno (Strydom, 1973; Weinstein & Kardong, 1994). En las especies chilenas, el veneno es viscoso, lechoso y con granulaciones. Las temperaturas altas lo destruyen y el frío lo mantiene. Se produce con mucha lentitud, desde 15 días en verano hasta 1 mes en invierno (Gajardo-Tobar, 1947; 1958). Está demostrado que el veneno de T. chilensis es mucho más potente que el de P. chamissonis , ocasionando la muerte en una totalidad de ratones una dosis intraperitoneal de 0.5 mg en la primera versus 2.5 mg en la segunda (<3 horas). Para ambas especies, la sintomatología es similar, con disnea, decaimiento, ataxia y, finalmente, muerte. La histopatología demuestra lesiones hemorrágicas, congestivas e infiltrativas en diversos órganos y degeneración turbia en hígado. Además, en inoculación subcutánea hay mucho edema y hemorragia local. In vitro , el veneno de T. chilensis revela propiedades proteolíticas, coagulantes y
hemolíticas y el de P. chamissonis resulta ser proteolítico, pero sin efectos coagulantes ni hemolíticos (Donoso-Barros & Cárdenas, 1962).
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Hipótesis. El veneno de la culebra de cola corta ( Tachymenis chilensis ) posee mayor número de proteínas que el veneno de la culebra de cola larga ( Philodryas chamissonis ). Objetivos. Objetivo General. Identificar las proteínas del veneno de T. chilensis y del veneno de P. chamissonis a través del uso de electroforesis en geles de poliacrilamida con dodecil sulfato de sodio. Objetivos Específicos. Identificar y comparar el número de proteínas del veneno de T. chilensis y P. chamissonis en geles de poliacrilamida con dodecil sulfato de sodio. Determinar y comparar la concentración de proteínas del veneno de T. chilensis y P. chamissonis mediante espectrofotometría. Determinar la composición de aminoácidos en bandas de proteínas del veneno de P. chamissonis en cromatografía líquida de alta resolución reversa.
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IV. MATERIALES Y MÉTODOS Material Biológico. Para la investigación, se utilizaron 27 individuos, 7 T. chilensis y 20 P. chamissonis (Apéndice 1), los cuales, se atraparon mediante captura manual desde el 01 de Septiembre de 2004 hasta el 27 de Febrero de 2005 y se transportaron en recipientes plásticos con respiraderos hasta el Laboratorio de Zoología (Departamento de Ciencias Pecuarias, Facultad de Medicina Veterinaria, Universidad de Concepción, Campus Chillán), donde se mantuvieron dentro de terrarios colectivos (40x35x25 cm) en condiciones de luz, temperatura y humedad igual para todas, similar a las existentes en el exterior (condiciones ambientales) y agua ad libitum . Se midió la temperatura dentro y fuera del laboratorio a distintos horarios y en distintas estaciones, no existiendo diferencias de más de 5ºC entre éste y el exterior ([ 13ºC en primavera y
[
19.5ºC en verano). Se determinó la especie y
cada individuo se identificó con un número y una letra. Se sexaron, pesaron y midieron (longitud total y longitud de la cola) antes de depositarlas en los terrarios; también se registró la procedencia y fecha de captura (Apéndice 1). Todas se colectaron desde la Región del Biobío, Chile. Al momento de dejar a las culebras al laboratorio, se alimentaron con un macerado de hámsters ( Mesocricetus auratus ) lactantes con sonda orogástrica hasta el llenado del estómago, tiempo desde el cual, se comenzó a contar 15 días de ayuno para el completo llenado de la glándula de Duvernoy (Oron & Bdolah, 1973; Jansen & Foehring, 1983; Rosenberg et al ., 1985). El veneno se extrajo una sola vez mediante la técnica descrita por Ferlan et al . (1983). Luego, el contenido extraído se depositó en microtubos (Eppendorf®) y se almacenó a -20°C. A continuación, los individuos se liberaron en su lugar de origen. Éste es un estudio descriptivo, donde la cantidad de proteínas es constante y característica en cada especie (Oron & Bdolah, 1973; Kochva, 1987; Weinstein & Kardong, 1994), por lo tanto, no se puede utilizar estadística inferencial, dado que se carece de varianza.
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La investigación contó con la autorización del SAG (Resolución Nº 2073 de 2003) y del Comité de Ética de la Facultad de Medicina Veterinaria de la Universidad de Concepción, Campus Chillán.
Electroforesis en geles de poliacrilamida. Para el análisis de las proteínas de los venenos se realizó electroforesis en geles de poliacrilamida en presencia de dodecil sulfato de sodio (SDS-PAGE) en el Laboratorio de Genética (Departamento de Biología Molecular, Facultad de Ciencias Biológicas, Universidad de Concepción, Campus Concepción). Se utilizó el protocolo descrito por Laemmli (1970) y modificado por Sambrook et al . (1989), previa homogenización en solución salina al 0.9% y centrifugación a 2500 rpm durante 3 minutos. Antes de ser colocadas las muestras en el gel (10 μL de cada muestra con 4.7 μg de veneno de T. chilensis y 32 μg de veneno de P. chamissonis , aproximadamente), se le agregaron 60 µL de una mezcla con dodecil sulfato de sodio (SDS) al 10%, glicerol al 5%, Tris-HCl 2M pH 6.8, fenilmetilsulfonil fluórido (PMSF) al 1%, pepstatina al 0.1% y “Protease Inhibitor Cocktail Tablet” (Roche Diagnostics), además de azul de bromofenol al 0.25% como indicador para observar la migración de las proteínas. El gel concentrador de poliacrilamida al 15% contenía Tris 2M pH 8.8, SDS 10%, persulfato de amonio (PSA) al 10% y N-N,N’,N’ tetrametiletilendiamina (TEMED). El gel separador de poliacrilamida al 5% contenía Tris 2M pH 6.8, SDS 10%, PSA 10% y TEMED. La electroforesis se realizó en un tampón glicina 191 mM, Tris-HCl 24.7 mM pH 8.3 y SDS 0.13% a 15 mA, 100 V y 10 W durante 4 a 5 horas, usando como referencia de la migración que el indicador llegara a la base del gel. El proceso se realizó en un equipo Mini Protean II Slab Cell de la marca BIO-RAD (Bio-Rad Laboratories), con una fuente de poder LKB modelo 2197. Posteriormente, los geles se lavaron con agua destilada, se fijaron en una solución de ácido acético y metanol durante 30 minutos y se tiñeron con azul de Coomasie coloidal G-250 (sensibilidad de 0.1 μg de proteína) al 0.1% preparado en 100 mL de metanol al 34%, ácido acético glaciar al 0.5% y PSA 17% por toda
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la noche bajo agitación constante. Finalmente, los geles se destiñeron con agua estéril durante 1 semana. Una vez desteñidos los geles, se procedió a identificar las bandas electroforéticas de proteínas de ambas especies. Como marcador de pesos moleculares se utilizó un estándar de la marca Bench Mack (Invitrogen Laboratories). También se utilizó veneno liofilizado de serpiente de cascabel diamantina del Oeste ( Crotalus atrox ) de la marca V7000 (Sigma Laboratories) y sangre entera humana, para descartar contaminación por sangre en la muestra.
Determinación de proteínas. Se estimó la cantidad de proteínas de ambos venenos por espectrofotometría en el Laboratorio de Enzimología (Departamento de Biología Molecular, Facultad de Ciencias Biológicas, Universidad de Concepción, Campus Concepción). Se utilizó un equipo Smart Super 3000 de la marca BIO-RAD, se llegó a una absorbancia de 280 nm y se utilizó albúmina sérica bovina como estándar. Análisis de aminoácidos. Se escogieron 4 proteínas al azar desde los geles de SDS-PAGE de los venenos analizados, que se enviaron al Laboratorio de Geoquímica Orgánica Marina (Departamento de Oceanografía, Facultad de Ciencias Naturales y Oceanográficas, Universidad de Concepción, Campus Concepción) para el análisis de aminoácidos, mediante cromatografía líquida de alta resolución (HPLC) reversa en un detector de fluorescencia Shimadzu. Se trabajó con material de vidrio muflado y material de plástico lavado con HCl 10% y enjuagado con agua Milli-Q. Se utilizó acetato de sodio 50 mM pH 5.7 con tetrahidrofurano al 5% como solución tampón de corrida, o-ftaldialdehído (reactivo OPA) para derivación y HCl 7% con fenol al 0.1% y ácido trifluoroacético al 10% como solución de hidrólisis. La columna utilizada fue una Alltima C18 5 μm de 250 x 4.6 mm. El programa de la corrida fue de 87 minutos (presión inicial ≈3200 PSI).
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V. RESULTADOS En ambas especies de culebras estudiadas, P. chamissonis y T. chilensis , se obtuvieron de 2 a 7 proteínas con pesos moleculares, cuyos rangos variaron de 21 a 184.5 kDa (Tabla 1). Las proteínas estuvieron principalmente asociadas al rango entre 52.5 y 85.9 kDa (85.9 y 68.8 kDa en ambas, 82.4 kDa en P. chamissonis y 52.5 kDa en T. chilensis ) (Fig. 2). Hubo una proteína menor, de 21 kDa, y dos mayores, de 121.3 y 184.5 kDa. No hubo diferencias en cuanto al número de proteínas de los venenos entre ambas especies, pero sí fue evidente la mayor intensidad de la tinción en P. chamissonis que en T. chilensis . Tabla 1. Pesos moleculares (kDa) de las proteínas encontradas en los venenos de culebras chilenas analizadas (P. chamissonis y T. chilensis ) según SDS-PAGE. Nº Banda
P. chamissonis (n=20)
Nº Banda
T. chilensis (n=7)
1
184.5
1
184.5
2
121.3
2
121.3
3
85.9
3
85.9
4
82.4
5
68.8
5
68.8
6
52.5
7
28.4
8
24.2
9
21
9
21
kDa 184.5
1
2
3
4
5
6
7
8
9
10
121.3 68.8 52.5 40.0 28.4 21.0
Fig. 2. Esquema de SDS-PAGE (carril 1: marcador de pesos moleculares, carril 2: Crotalus atrox , carriles 3-8: P. chamissonis , carriles 9-10: T. chilensis ).
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La concentración de proteínas del total de veneno recolectado se estimó en 0.23 mg/mL de proteína para el veneno de T. chilensis y de 1.62 mg/mL de proteína para el veneno de P. chamissonis . El resultado obtenido del análisis de aminoácidos se muestra en la Tabla 2. Tabla 2. Resultado del análisis porcentual de los aminoácidos obtenidos de las proteínas de los venenos analizados (el número de la banda corresponde con el de la Tabla 1 y Fig. 2). Aminoácido (%)
Banda Nº1
Banda Nº3
Banda Nº4
Banda Nº5
Ácido aspártico
7
8
4
7
Ácido glutámico
2
2
3
2
Serina
4
4
3
4
Histidina
32
33
27
33
Glicina
2
2
3
3
Treonina
19
18
16
19
Arginina
6
6
5
6
Alanina
11
11
10
12
Tirosina
4
3
6
3
Metionina
5
1
5
2
Valina
1
6
5
1
Fenilalanina
3
1
5
3
Isoleucina
3
3
1
3
Leucina
1
1
4
1
Lisina
2
1
4
2
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VI. DISCUSIÓN En trabajos similares (SDS-PAGE) realizados con P. olfersii y P. patagoniensis (Colubridae: Xenodontinae) se encontraron 6 proteínas de pesos moleculares de 10 a 70 kDa (Assakura et al ., 1992; Peichoto et al ., 2003), similar a lo encontrado en este estudio. Según Donoso-Barros & Cárdenas (1962), quienes encontraron que el veneno de T. chilensis es más tóxico que el de P. chamissonis , se esperaba que el de T. chilensis presentara más número de proteínas que el de P. chamissonis , sin embargo, se encontró que ambos venenos presentan igual
número de proteínas. Lo que, también, resulta contrario a la proporcionalidad entre la toxicidad del veneno y su número de proteínas (Weinstein & Kardong, 1994). En otros estudios, Assakura et al . (1992; 1994) encontraron 1.0 mg/mL de proteína en el veneno de P. olfersii y Peichoto et al . (2003) encontraron 1.183 mg/mL de proteína en el veneno de P. patagoniensis . Similar a los resultados encontrados en este estudio para P. chamissonis . Analizar las proteínas del veneno de los ofidios es un proceso complejo que se ha estudiado muy poco, usando para este proceso sólo las fracciones del veneno que resultan más letales. Entre éstos, los venenos mejor estudiados corresponden a las neurotoxinas de la familia Elapidae (6-7 kDa), donde el aminoácido más abundante es treonina y los más escasos son alanina, metionina y fenilalanina (Botes & Strydom, 1969; Yang et al ., 1970; Botes, 1971; Mebs et al ., 1971; Nakai et al ., 1971; Strydom & Botes, 1971; Tu & Hong, 1971; Botes, 1972; Bon &
Changeux, 1977; Halpert & Eaker, 1976). En la familia Viperidae, se ha hecho con enzimas coagulantes (36-79 kDa), donde predominan el ácido aspártico y el ácido glutámico y escasean histidina, metionina y fenilalanina (Kisiel et al ., 1976; Kirby et al ., 1979; Mandelbaum et al ., 1982), y también con proteasas (24 kDa), donde
predominan leucina, ácido glutámico y ácido aspártico por sobre los otros aminoácidos (Takahashi & Ohsaka, 1970; Kurecki et al ., 1978). En la familia Colubridae, la especie más estudiada es Dispholidus typus , de la cual, se conoce la composición de una enzima coagulante de 67 kDa (fracción C), siendo los aminoácidos más abundantes los ácidos aspártico y glutámico, y los más escasos
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metionina, fenilalanina e histidina (Hiestand & Hiestand, 1979). Por lo tanto, parece que, en los venenos ofídicos, los aminoácidos más abundantes son los ácidos aspártico y glutámico y los menos representativos son metionina y fenilalanina; sin embargo, en el análisis realizado en esta investigación, los más abundantes fueron alanina, histidina y treonina, y los más pobremente encontrados leucina y lisina. Es probable que esto haya ocurrido porque las muestras analizadas no correspondan a las fracciones tóxicas o porque la composición del veneno sea distinta a las de las especies descritas en la literatura. Para comparar realmente los resultados encontrados con los citados se deberían analizar sólo las proteínas que resulten ser tóxicas in vivo y/o in vitro . A pesar de los diferentes experimentos realizados con el veneno de T. chilensis y P. chamissonis (SDS-PAGE, HPLC y espectrofotometría), aún faltan pruebas,
como
isoelectroenfoque,
actividades
proteolítica,
amidolítica,
coagulante,
hemorrágica, fibrinolítica, fibrinogenolítica, edematizante y fosfolipasa A, DL 50, tiempo de coagulación de la trombina, seroneutralización, agregación plaquetaria, y purificación de las proteínas del veneno (Assakura et al ., 1992; Peichoto et al ., 2003), además de depurar las técnicas utilizadas para una mejor caracterización. Recientemente, se ha caracterizado el veneno de P. olfersii y P. patagoniensis , pudiendo determinarse que el veneno de P. olfersii presenta metaloproteasas con actividad hemorrágica, edematogénica, fibrinogenolítica y fibrinolítica, pero sin enzimas coagulantes, procoagulantes, fosfolipasa A ni de agregación plaquetaria (Assakura et al ., 1992). Lo mismo sucede con P. patagoniensis , aunque no se comprobó la presencia de enzimas coagulantes, procoagulantes, fosfolipasa A ni de agregación plaquetaria (Peichoto et al ., 2003). Es probable que las especies estudiadas en esta investigación compartan aquellas características, al menos las proteínas con pesos moleculares de 30 a 60 kDa (metaloproteasas en P. olfersii y P. patagoniensis ). Sin embargo, esto seguirá siendo una interrogante hasta que se
realicen las pruebas necesarias para confirmarlo en futuros estudios.
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VII. CONCLUSIONES 1. El veneno de T. chilensis y el veneno de P. chamissonis están constituidos de diferentes proteínas que se evidencian a través del uso de electroforesis en SDS-PAGE. 2. No hay diferencia entre la cantidad de bandas electroforéticas entre el veneno de P. chamissonis y el veneno de T. chilensis en SDS-PAGE. 3. Las bandas electroforéticas de P. chamissonis y T. chilensis en SDS-PAGE corresponden a proteínas que se encuentran en el mismo rango de pesos moleculares (21-184.5 kDa). 4. La concentración de proteínas del veneno de T. chilensis es menor que la del veneno de P. chamissonis . 5. Los principales aminoácidos encontrados en proteínas del veneno de P. chamissonis son alanina, histidina y treonina, y los más escasos son leucina y
lisina.
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