Transformacion bacteriana 1º Dia ¿Qué es la transformacion bacteriana? bacteriana?
El
proceso
consiste
en
la
introducción
de
un
ADN
extraño
(heterólogo) a una bacteria. Este proceso se puede dar por tres métodos: ♦
Transformacion Transformacion con ADN desnudo en presencia de CaCl2.
♦
Transducción: Introducción Introducción de DNA mediada por un bacteriofago.
♦
Electroporación: El DNA se introduce en las bacterias forzandolo con una descarga eléctrica (se usa en gram + y células eucariotas vegetales o de hongos {que tienen pared celular}). Para las células eucariotas no vegetales ni de hongos, se usa la transfección, células
y
que
consiste
en
Ca3(PO4)2, también
se
precipitar usa
la
el
DNA
junto
microinyección,
con
las
donde
se
introduce el DNA directamente al núcleo de la célula. Para células vegetales otra forma de introducir DNA es através del llamado
cañón
génico,
que
impulsa
con
gas
comprimido
a
gran
presión microparticulas de tungsteno u oro (metales relativamente inertes
desde
el
pto.
de
vista
químico)
recubiertas
con
una
solución del DNA que se quiere introducir. El kit con el que vamos a trabajar, usa el primero de los métodos reseñados. Para
poder
estado
tomar
llamado
el DNA,
de
las
bacterias
“competencia”,
que
tienen
se
logra
que
estar
tratando
en un a
las
mismas con soluciones ricas en Ca2+ de manera tal que se le abren poros a la pared y
la membrana membrana celular por donde ingresará el
DNA. Una vez adentro, el DNA puede integrarse al material génetico de la
bacteria
(o
célula),
o
permanecer
autónomo
con
respecto
al
mismo (episómico)(en eucariotas es mas frecuente la integración a los cromosomas, pero hay ocasiones en las cuales es deseable la no
integración del DNA, asi que el fragmento se mantiene indep’te del DNA celular y se le llama transiente). En nuestro caso el material introducido, se mantendrá episómico. Asi, se replicará autonomamente. El
material
a
utilizar
se
llama
plásmido,
y
consiste
en
una
estructura circular de DNA dc (de entre 2600 a 6000 pb) que porta la siguiente información: 1. Un origen de replicación 2. Una secuencia de control de nº de copias 3. Un
gen
(con
su
correspondiente
promotor)
de
resistencia
a
un
antibiotico 4. Un promotor (gral’te inducible, derivado del operon Lac) 5. Un sitio múltiple de clonado (polilinker) Cada uno de estos elementos cumple una función específica. El 1º conocido como ORI permite la replicación autónoma del DNA. El
2º
controla
cuantas
copias
tendra
el
plásmido
dentro
de
la
bacteria (desde ~16/bact para pET, hasta ~600/bact para pUC18). El
3º
es
bacteria
un
gen
resistir
que la
produce acción
una
de
un
proteina
que
antibiótico
facilita
y
a
funciona
la
como
agente de selección, esto es, permite distinguir en presencia del agente selector (antibiótico)a las bacterias que hayan incorporado el DNA de aquellas que no lo hayan hecho. Antibióticos utilizados son
por
ejemplo:
ampicilina
(BLA),
kanamicina
(APT)
,
maquinaria
de
tetraciclina, cloramfenicol (CAT), etc. El
4º
sirve
para
trancripción y
de
poder
expresar,
biosintesis
de
usando
proteinas
la
de la bacteria, una
proteina de nuestro intéres. El
que
sea
inducible
me
permite
seleccionar
el
momento
más
adecuado para la expresión. El
5º
es
una
secuencia
de
DNA
que
tiene
muchos
sitio
de
reconocimiento de enzimas de restricción, donde uno puede clonar el gen de la proteina que interesa expresar.
sitio de enzima de restriccion
Proteina activadora arabinosa
Promotor Ara BAD
origen de replicacion
gen de resistencia antibiotico
green fluorescent protein
Este es el plásmido que usaremos en la experiencia.
El mismo plásmido más detallado. polilinker
La bacteria competente, al igual que el plásmido es provista por el kit. Generalmente,
son
cepas
(strain)
JM105, LE392, DH5α, BL21DE3, etc.
de
E.coli
tales
como:
HB101,
Este kit hace uso del sistema de regulación génica del operon ARA, promotor ARA BAD y gen de la proteina Ara C. La proteina GFP, extraida de una medusa, tiene la propiedad de fluorescer de color verde brillante, cuando es iluminada con luz UV. A este tipo de productos génicos, se los llama genes (proteinas) reporter,
ya
que
permiten
verificar
de
manera
sencilla
su
presencia ya que provocan algun efecto óptico o de otra naturaleza cuando se producen. Genes
reporter
son
p.ej.:
GFP,
β-galactosidasa,
β-glucoronico,
luciferina, etc. El
proceso
concretamente,
consiste
en
tomar
2
tubos
eppendorf
rotulados (–) DNA y (+) DNA donde se colocará solución de CaCl2 . Una vez hecho esto, de una placa de petri sembrada con la bacteria se toma una ansada y se disuelve en cada tubo. Una vez bien disueltas las bacterias en la solución, se tapa el tubo (-)DNA y al (+)DNA se le agrega una ansada de plásmido pGLO. Los dos tubos se colocan 10’ en hielo, y luego de 50” a 1’30” a 42ºC.
Se
recuperan
medio
LB
(caldo
de
las
bacterias
Luria-Bertani,
transformadas triptona
10
30’ g,
a
37ºC
extracto
con de
levadura 5g, NaCl 10 g, H2O csp 1000 mL). Por último se plaquearán las bacterias transformadas en cajas de petri, con agar LB (idem caldo LB + 1.5% agar) + arabinosa. Se ponen las cajas en estufa de 37ºC overnight.
2º Dia
Ver si crecieron las bacterias en las placas. Tomar la placa rotulada (+)DNA e iluminarla con luz UV, observar el resultado.
¿Como se elige donde transformar?
PROTEINA BLANCO C O N T IE N E H IID DRATOS DE CARBO NO?
SI
NO TIENEN IMPORTANCIA CLINICA?
SI
BACTERIAS CON
NO
METIONINA I N I C IIA AL L? ?
SI
NO
CELULAS Y P R O T E I N A D E F U S IO N
LEVADURAS C L O N A D O D IR E C T O
