TRANSFORMASI PLASMID
I.
TUJUAN
1.1 Praktikum ini bertujuan untuk melakukan transformasi pada sel E.coli . E.coli .
II.
PRINSIP
2.1 Pembuatan sel kompeten yang dapat disisipi vektor DNA rekombinan. E.Coli E.Coli dibiakkan dalam suspensi media,pada saat midlog phase diambil dengan cara sentrifugasi dan inkubasi dalam es dengan penambahan larutan CaCl2 dingin. 2.2 Transformasi E.Coli E.Coli dengan plasmid rekombinan ditambahkan ke dalam sel kompeten disertai dengan kontrol.Campuran sel kompeten dan DNA plasmid diinkubasi dalam es kemudian diberi kejut panas (heat-shock) pada suhu 42ºC dam selanjutnya diinkubasi pada suhu 37ºC. 2.3 Seleksi koloni E.Coli yang E.Coli yang telah disisipi DNA plasmid rekombinan dengan menggunakan cawan LB/Amp/X-Gal/IPTG.
III.
TEORI
Dalam
perkembangannya,
istilah
transformasi
telah
didefinisikan secara lebih luas lagi yaitu pengambilan molekul DNA oleh setiap jenis sel tanpa memandang apakah pengambilan molekul DNA tersebut menyebabkan adanya perubahan dalam sel yangdapat dideteksi atau tidak dan objek dari transformasi ini tidak terbatas pada bakteri saja,tetapi termasuk juga fungi, hewan, dan tumbuhan. Transformasi merupakan teknik transfer molekul DNA ke dalam sel inang bakteri misalnya bakteri E.coli. Fenotif Strain E. coli coli hasil
transforman akan berubah karena mendapatkan gen-gen penyandi baru yang dibawa oleh molekul DNA tersebut. Molekul DNA ini biasanya dikemas dalam suatu vektor, misalnya plasmid. Pemasukkan molekul DNA rekombinan ke dalam sel inang disebut transformasi apabila vektor
yang
transformasi
digunakan karena
berupa
plasmid
plasmid.
dapat
Peristiwa
mengubah
sifat
ini sel
disebut inang.
Keberhasilan plasmid masuk dan bertahan di dalam sel umumnya dideteksi berdasarkan ekspresi gen marka yang dibawa oleh plasmid tersebut(Brown, 1991). Transformasi memiliki arti penting dan sangat berguna dalam penelitian – penelitian genetik bakteri di laboratorium laboratorium terutama bagi pemetaan kromosom bakteri. bak teri. Hal ini terjadi karena frekuensi terjadinya transformasi antara dua gen pada waktu yang samamerupakan petunjuk jarak antara gen – gen ini pada kromosom. Plasmid adalah molekul DNA sirkuler berukuran relatif kecil di luar kromosom yang terdapat di dalam sel prokariot, khususnya bakteri. Gen-gen yang terdapat di dalam plasmid pada
umumnya
tidak
esensial bagi pertumbuhan
dan
kelangsungan hidup individu bakteri, tetapi sering kali menyandi sintesis protein untuk resistensi terhadap antibiotik. Dalam rekayasa genetika plasmid sering digunakan sebagai vektor untuk membawa gengen tertentu yang diinginkan ke dalam suatu sel inang. Gen-gen tersebut selanjutnya akan mengekspresikan produk komersial tertentu seperti insulin, interferon, dan berbagai enzim(Pelczar dan Chan, 1986). Transformasi merupakan teknik transfer molekul DNA ke dalam sel inang bakteri misalnya bakteri E.coli. E.coli. Fenotif Strain E. coli coli hasil transforman akan berubah karena mendapatkan gen-gen penyandi baru yang dibawa oleh molekul DNA tersebut. Molekul DNA ini biasanya
dikemas dalam suatu vektor, misalnya plasmid. Proses transformasi merupakan proses yang tidak efisien walaupun sel telah dibuat kompeten. Bagian sel yang berhasil menyerap DNA plasmid sangat rendah, sehingga diperlukan metode untuk membedakan antara sel transforman dan sel nontransforman. Sel transforman adalah sel yang berhasil menyerap DNA plasmid, sedangkan sel nontransforman adalah sel yang tidak membawa DNA plasmid. Seleksi transforman umumnya berdasarkan adanya marka seleksi 18 yang disisipkan pada plasmid. Marka seleksi merupakan gen yang memberi karakterisrik baru pada sel transforman yang tidak dimiliki oleh sel bukan transforman. Sel inang yang telah mengandung DNA rekombinan dibiakkan dalam medium padat, sehingga membentuk koloni. Koloni yang terbentuk merupakan sekumpulan sel yang identik karena hasil pembiakan sebuah sel. Koloni yang dapat tumbuh pada media seleksi ini adalah koloni yang berasal dari bakteri transforman saja ( Wibowo, 2002). Tahap berikutnya dalam eksperimen pengklonan gen setelah molekul DNA rekombinan berhasil dikonstruksi adalah memasukkan molekul DNA rekombinan tersebut ke dalam sel hidup yang disebut sel inang. Sel inang yang paling umum digunakan adalah Escherichia coli. Tidak semua sel secara alami memiliki kemampuan untuk menyerap DNA asing. Setiap sel memiliki efisiensi yang berbeda dalam menyerap molekul DNA. Beberapa spesies yang dapat menyerap DNA secara efisien adalah Bacillus dan Streptococcus. Sel yang tergolong tidak efisien dalam menyerap DNA adalah Escherichia coli. Sel ini memiliki kemampuan alami menyerap DNA asing yang rendah. Sel E. coli secara alami memiliki kemampuan transformasi yang rendah. Peningkatan kemampuan transformasi secara alami dilakukan dengan memanen sel
pada fase stasioner dan penumbuhan kembali pada media. Sel yang kompeten diperoleh pada fase lag dan menghilang pada fase log (eksponensial). Laju transformasi meningkat seiring dengan jumlah plasmid hingga mencapai fase plateau. Sel E.coli yang kompeten diberi perlakuan kejut panas untuk membuka pori pada dinding sel bakteri. Inkubasi dengan plasmid akan menyebabkan masuknya plasmid ke dalam sel. Penambahan media LB setelah perlakuan kejut panas berfungsi untuk memenuhi kebutuhan nutrisi dari bakteri setelah mengalami perlakuan yang ekstrem(Tsen,2002). Salah satu cara untuk menyeleksi klon yang benar adalah dengan menggunakan media tumbuh yang mengandung antibiotik.Cairan suspensi
dalam
pekerjaan
transformasi
(campuran
antara
bakteri,plasmid,dan DNA asing yang telah di perlukan dalam rangka trasformasi) di sedarkan pada media yang mengandung tetasiklin. Koloni bakteri yang tumbuh adalah koloni sel 1 dan koloni sel 2 (koloni adalah kumpulan sel yang sama yang semula berasal dari satu sel). Sel bakteri yang tidak mengandung plasmid tidak mampu tumbuh. Masingmasing koloni yang tumbuh pada media + tetrasklin kemudian di pindahkan pada media + ampisilin. Koloni yang tidak tumbuh pada media + ampisilin adalah koloni yang di inginkan (sel-sel bakterinya mengandung plasmid rekombinasi). Bakteri ditumbuhkan pada medium yang mengandung ampisilin. Dengan adanya ampisilin, maka sel E. coli yang dapat tumbuh hanya sel transforman atau sel yang telah memasukkan plasmid(Wibowo, 2002). DNA rekombinan (rDNA) adalah bentuk DNA buatan yang dibuat dengan menggabungkan dua atau lebih sekuens yang tidak akan biasanya terjadi bersama-sama.Dalam hal modifikasi genetik, itu adalah
diciptakan melalui pengenalan DNA yang relevan ke dalam DNA organisme yang ada, seperti plasmid bakteri, untuk kode untuk atau mengubah sifat berbeda untuk tujuan tertentu, seperti resistensi antibiotik.Ini berbeda dari rekombinasi genetika dalam hal itu tidak terjadi melalui proses alam dalam sel, tetapi direkayasa.Sebuah protein rekombinan adalah protein yang berasal dari DNA rekombina(Pelcza, 1986). Teknologi DNA Rekombinan telah memberikan banyak manfaat bagi perkembangan ilmu pengetahuan maupun bagi kehidupam manusia sehari-hari. Beberapa jenis obat-obatan, vaksin, bahan pangan, bahan pakaian dan lainnya telah diproduksi dengan memanfaatkan teknologi DNA Rekombinan.Dalam kehidupan kita sehari-hari, secara langsung maupun tidak langsung, sebagian dari kita pernah berhubungan dengan hasil penggunaan teknologi DNA Rekombinan. Contoh: insulin telah digunakan untuk mengobati penyakit diabetes. Penyakit diabetes pada manusia diobati dengan insulin manusia.Saat ini insulin manusia telah berhasil diproduksi secara masal dengan menggunakan bakteri. Kemampuan bakteri untuk memproduksi insulin manusia ini adalah karena manusia telah berhasil memasukkan dan mengintegrasikan gen yang menyandikan insulin manusia kedalam genom bakteri(Wibowo, 2002). pCAMBIA vektor backbone berasal dari vektor pPZP (dibangun oleh Hajdukiewicz, Svab& Maliga, lihat References21). Sementara keterbatasan teknis dan IP tidak sempurna dan memiliki (lihat BioForge GUSPlus Project 22, di mana kita meningkatkan gen reporter dan metode seleksi untuk lebih lengkap kebebasan untuk beroperasi), vektor pCAMBIA menawarkan:
jumlah salinan tinggi dalam E.coli untuk hasil DNA tinggi
pVS1 replicon untuk stabilitas tinggi dalam Agrobacterium
ukuran kecil, 7-12kb tergantung pada plasmid
situs restriksi dirancang untuk modifikasi plasmid modular dan kecil tapi memadai poli-linker untuk memperkenalkan DNA Anda minati
Pilihan bakteri dengan kloramfenikol atau kanamisin
Pilihan tanaman dengan higromisin B atau kanamisin (seleksi fosfinotrisin dihentikan di permintaan pemilik IP, Bayer, setelah distribusi awal tahun 1997)
cara sederhana untuk membangun fusi translasi gen reporter gusA.
Gambar 1: pCAMBIA Nomenklatur vektor pCAMBIA: Digit pertama - mengindikasikan pemilihan tanaman: 0 untuk ketidakhadiran, 1 untuk resistensi higromisin, 2 untuk kanamisin, dan 3 untuk fosfinotrisin (vektor yang mengandung gen resistensi fosfinotrisin tidak lagi tersedia dari Cambia atas permintaan Bayer, yang memiliki paten membatasi penggunaannya dalam beberapa negara).
Digit kedua - menunjukkan seleksi bakteri: 1 untuk spektinomisin / streptomisin resistensi, 2 untuk kloramfenikol, 3 untuk kanamisin, 4 untuk spek / radang dan kanamisin. Ketiga digit - menunjukkan polylinker digunakan: 0 untuk pUC18 polylinker, 8 untuk pUC8 polylinker, 9 untuk pUC9 polylinker. Keempat digit - menunjukkan gen pelapor (s) hadir: 0 untuk tidak ada gen pelapor, 1 untuk E.coli gusA, 2 untuk mgfp5; 3 untuk gusA: mgfp5 fusi, 4 untuk mgfp5: gusA fusi, 5 untuk Staphylococcus sp. gusA (GUSPlus). Kelima digit - mencatat beberapa fitur khusus lainnya. Sejauh ini telah digunakan hanya dengan: pCAMBIA1305.1 dan plasmid berasal darinya, di mana 0,1 menunjukkan tidak adanya peptida sinyal dari GUSPlus
tersebut
protein,
dan
pCAMBIA1305.2
mana
0,2
menunjukkan adanya sinyal peptida GRP dalam planta sekresi protein GUSPlus. Lagging surat - X menunjukkan bahwa gen pelapor kekurangan nya kodon start sendiri dan vektor adalah untuk menciptakan fusi kepada reporter, Z menunjukkan adanya lacZa fungsional untuk skrining biru putih, a / b / c menunjukkan bingkai membaca untuk fusi dengan Fuse dan Penggunaan vektor. (Tsen et al. 2002). Gus
vektor
Seleksi
Intron
(pCAMBIA1201;
pCAMBIA1301,
pCAMBIA2201; pCAMBIA2301) Peneliti ingin versi terbaru harus melihat pCAMBIA 1.305,1, pCAMBIA1105.1 atau Pcambia 1305.2103, yang dapat diminta melalui BioForge GUSPlus Project104. Informasi tentang tua vektor pCAMBIA di sini untuk kenyamanan.Vektor ini mengandung berfungsi penuh gusA reporter membangun untuk analisis sederhana dan sensitif gen
fungsi atau kehadiran di tanaman diregenerasi dengan GUS assay. Konstruk menggunakan E.coli gusA (N358Q
– untuk menghindari
glikosilasi N-linked) dengan intron (dari biji jarak gen katalase) dalam pengkodean urutan untuk memastikan bahwa ekspresi aktivitas glukuronidase berasal dari sel-sel eukariotik, bukan dari ekspresi oleh sel A. tumefaciens sisa. Gen reporter gusA adalah kloning dalam format modular baru. Ini plasmid cocok untuk penyisipan gen lain yang menarik yang mengandung promotor mereka sendiri dan terminator. Peneliti dapat cukai gen gusA dan masukkan gen mereka sendiri bunga di tempatnya atau menggunakan vektor ini untuk membuat fusi dari gusA dengan gen minat mereka (jika Anda telah membuat sebuah pCAMBIA derivatif vektor bahwa peneliti lain akan menemukan berguna dan ingin berbagi, silahkan beritahu kami tahu). Vektor ini berisi pUC18 polylinker-lacZa dan seleksi bakteri dan tanaman yang sama gen sebagai sesuai Minimal Vektor Pemilihan mereka(Tsen,2002).
IV.
PROSEDUR
Dalam percobaan ini strain E.coli Top 10 yang dikulturkan semalaman ke media LB cair 25 ml dengan cara memindahkan satu koloni strain E.coli Top 10 ke media LB cair. Kemudian diinkubasi di dalam shakerincubator dengan kecepatan rotasi 125rpm pada suhu 37°C selama 16 jam(semalaman).Setelah itu Hasil inkubasi semalaman dipindahkan ke media LB cair 25ml, dilakukan dengan cara mengambil 250µl kultur E.coli Top 10 ke dalam media LB cair 25 ml, atau dikatakan perbandingan anatara volume media dan volume kultur 10:1.Kemudian kultur tersebut diinkubasi dalam shaker incubator dengan kecepatan rotasi 125 rpm selama 120 menit yaitu selama 2 jam pada suhu 37°C.
Setelah sebanyak 1,5 ml kultur diinkubasi selama 2 jam, kultur tersebut diambil dan dimasukkan ke dalam tadung sentrifuga dan dengan kecepatan 5.700 x g dilakukan sentrigfigasi selama 5 menit. Setelah disentrifugasi supernatan yang terhasil dibuang dan ditambahkan 500µl CaCl2 yang dingin,diresuspensi kemudian disentrifugasi pada kecepatan 5.700 x g selama 5 menit. Supernatan dibuang kembali dan
ditambahkan kembali 200 μl CaCl2dingin ke dalam tabung, diresuspensi dan diinkubasi dalam es. Dalam perlakuan ini terdapat lima tabung mikrosentrifuga, dua diantaranya diinkubasi 2 jam dan 3 lainnya untuk diinkubasi 16 jam. Tabung mikrosentrifuga hasil inkubasi 2 jam yang masing-masing
berisi 200 μl selkompeten, salah satunya atau tabung
nomor 1 ditambah dengan
10 μl palsmid pUC19sirkuler, sedangkan
tabung nomor 2 tidak ditambah dengan plasmid. Kedua tabung diinkubasi lebih lanjut dalam es selama 20 menit, kemudian diberi kejut panas (heat-shock) selama 90 detik dengan suhu 42°C dan segera dipindahkan ke dalam es dan diinkubasi kembali selama 10 menit. Tabung mikrosentrifuga ditambahkan media LB hingga 1 ml setelah diinkubasi 10menit, dilanjutkan dengan inkubasi dalam shakerincubator pada suhu 37°C dengan kecepatan rotasi 150 rpm selama 1,5
jam. Sebanyak 100 μl hasil inkubasi ditumbuhkan dengan cara plating ke media cawan LB/Amp untuk kedua tabung. Selain itu, sebanyak 50
μl hasil inkubasi pada tabung nomor 2 ditumbuhkan juga pada media LB tanpa ampisilin. Diinkubasiksn selama 16 jam pada suhu 37°C. Sementara itu, ke dalam tabung mikrosentrifuga hasil inkubasi 16 jam yang masing-masing
berisi 200 μl sel kompeten, ditambahkan 10 μl
vektor pUC19 sirkuler untuk penentuan efisiensi transformasi (tabung
nomor 3), 2 μl vektor pUC19 rekombinan(tabung nomor 4) dan tidak
ditambahkan apapun (tabung nomor 5). Ketiga tabung mikrosentrifuga diinkubasi lebih lanjut dalam es selama 20 menit dan diberi kejut panas (heat-shock) selama 90 detik pada suhu 42°C dan segera dipindahkan ke es untuk diinkubasi kembali selama 10 menit. Tabung mikrosentrifuga selanjutnya ditambahkan dengan media LB hingga 1 ml,dilanjutkan dengan inkubasi dalam shaker-incubator selama 1,5 jam pada suhu 37°C. Disiapkan media cawan LB/Amp/X-Gal/IPTG dengan cara
menambahkan 50 μl X-Gal dan 100 μl IPTG ke media cawan LB/Amp, lalu diinkubasi pada suhu 37°Cselama lebih kurang 30 menit. Hasil inkubasi tabung nomor 3 ditumbuhkan dengan cara plating ke media cawanLB/Amp/X-Gal/IPTG
sebanyak 100 μl. Tabung nomor 4
disentrifugasi dengan kecepatan 5.700 x g selama 5 menit.Supernatan
dibuang hingga tersisa 100 μl, dan kemudian ditumbuhkan dengan cara plating ke media LB/Amp/X-Gal/IPTG.Hasil inkubasi pada tabung no.5 ditumbuhkan dengan cara plating ke media cawanLB/Amp sebanyak
100 μl dan ke media cawan LB sebanyak 50 μl, dilanjutkan dengan inkubasi selama 16 jam pada suhu 37°C. Dilakukan penjumlahan untuk cawan yang berisi E. coli dengan pUC19 sirkuler koloni untuk diketahui efisiensi transformasinya.Efisiensi transformasi dihitung dengan cara
sebagai berikut, Dimana,Σkoloni= jumlah koloni putih (dalam cfu)[pUC19] = konsentrasi pUC19 (dalam ng).
V.
ALAT DAN BAHAN
Alat:
5.1 Beaker glass 20mL
5.2 Bunsen
5.3 Inkubator
5.4 Lemari es
5.5 Mikro pipet
5.6 Mikrosentrifuga
5.7 Pengocok orbital
5.8 Sarung tangan
5.9 Tabung Eppendrof
Bahan 5.1 Aquabides 5.2 Etanol 95% 5.3 GeneJET
™ plasmid minprep kit (fermentas life sciences):
Resuspension solution, Lysis solution, Neutralization solutiom, Wash solution, RNase A, Elution Buffer (10mM Tris-HCL, pH
8.5), GeneJET ™ Spin Colums dan tabung kolektor 2mL
5.4 Kloramfenikol/ kanamisin 100 µg/mL dalam medium LB cair 5.5 Medium lurea bertani (LB) cair (Biogen) 5.6 Plat biakan bakteri E.coli Top 10 berumur 18-24jam 5.7 pCambia 1201 VI. DATA PENGAMATAN
No.
1.
2.
Cawan Petri
Kontrol (+)
Kontrol ()
Hasil Pertumbuhan Hasil Pengamatan Ada Pertumbuhan
Tiada pertumbuhan
√
√
A 3.
(Ada
√
pChambia 1201)
B 4.
(Tanpa pChambia 1201)
√
VII. PEMBAHASAN
Praktikum bioteknologi ada beberapa tahap yang harus dikerjakan sebelum kitamendapatkan hasil murni dari isolasi DNA dan isolasi Kromosom. Pada awal praktikum kita melakukan Transformasi, transformasi disini bertujuan untuk melakukan transformasi pada sel E. Coli. Transformasi disini memiliki prinsip diantaranya pembuatan sel kompenten yang dapat disisipi vektor DNA rekombinan, transformasi E. Coli dengan plasmid rekombinan dan menyeleksi koloni E.coli yang telah disisipi DNA plasmid rekombinan dengan menggunakan
cawan
LB/kloramfenikol/X-Gal/IPTG.
Pada
praktikum
transformasi genetic ini dilakukan pembuatan sel kompeten E.coli Top 10 dan transformasi plasmid DNA. Transformasi genetic adalah proses introduksigen dari satu organism ke organisme lain yang memungkinkan untuk memunculkan sifat harapan tanpa mengubah sifat lain. Transformasi genetic merupakan salah satu metode yang dapat dimanfaatkan untuk mempelajari regulasi gen, identifikasi fungsi gen, pengujian metabolisme, mempelajari fisiologi serta perkembangan tanaman. Sebelumnya telah dilakukan pembuatan sel kompeten oleh asisten sehingga pada praktikum kali ini praktikan tinggal melakukan transformasi DNA plasmid. Sel Kompeten(Competent Cells, CC, C-Cells) adalah sel (bakteri atau yeast) yang telah mengalami perubahan dalam hal tingkat permeabilitasnya. Artinya membrane sel dari bakt eri atau yeast tersebut mampu dilewati oleh plasmid DNA, sehingga DNA yang telah masuk tersebut akan bertambah dan bertambah seiring pembelahan sel mikroba tersebut. Pembuatan sel kompeten dimulai dengan mengkultur semalaman strain E.coli Top 10 ke media LB cair 10 ml dengan cara memindahkan satu koloni stran E.coli Top 10
ke media LB cair. Setelah itu diinkubasi dalam shaker-inductor dengan kecepatan rotasi 125 rpm dengan suhu 37⁰C selama 16 jam hingga 18 jam.Kultur sel sendiri merupakan metode dimana suatu sel dari suatu jaringan diambil danditumbuhkan pada kondisi yang terkontrol dan aseptik. Sel yang digunakan untuk dikultur biasanya diambil dari jaringan eukariot. Sel tersebut akan tumbuh dan bertambah banyak dalam kondisi in vitro.Setelah dikultur dan diinkubasi selama 16 jam, kultur dipindahkan ke media LB cair 10 mL dengan cara mengambil 250 mikro liter E.coli Top 10 ke dalam media LB cair steril 5 mL,lalu diinkubasi kembali dengan shaker – incubator dengan kecepatan 125 rpm selama 2 jam pada suhu yang sama. Tahap ini dilakukan agar sel semakin memperbanyak
diri
sehingga
jumlahnya
dibanyak
sehingga
untuk
mendapatkan sel transforman cukup mudah melalui media tersebut. Kemudian 1,5 ml kultur hasil inkubasi 2 jam dimasukkan dalam tabung eppendorf, Kultur hasil inkubasi 2 jam ini diperkirakan telah mengalami fase log. Fase log diperlukan agar jumlah bakteri yang terisolasi untuk pembuatan sel kompeten optimal. Setelah itu kultur diambil kembali dan untuk selanjutnya dimasukkan tabung mikrosentrifuga dan dilakukan sentrifugasi dengan kecepatan 5700 x g selama 5 menit hal ini dilakukan untuk memisahkan bakteri dengan medium pertumbuhannya.Supernatan yang dihasilkan dibuang dan kedalam tabung ditambahkan 100 mikro liter CaCl2 dingin. DNA plasmid merupakan wadah yang digunakan untuk mengcloning gen. Proses transformasi bakteri diawali denga pembuatan sel kompeten. Pencampuran sel kompeten dan DNA insert diinkubasi bersama dengan larutan kalsium klorida (CaCl2) yang terdapat pada TFB, fungsi larutan ini adalah megganggu keseimbangan kalsium dalam membran sehingga membran berhasil terbuka dan DNA insert dapat masuk. Cara kerja larutan ini adalah membantu terbukanya protein integral sebagai kanal ion. Proses selanjutnya yaitu
dikejutpanaskan (heat shock) pada suhu 42°C selama 45 detik dengan maksud membran sel akan tertutup kembali karena terjadi perubahan suhu yang mendadak dari suhu rendah ke suhu tinggi. Proses pengerjaan transformasi dapat dilakukan di dalam laminar ataupun di luar laminar. Perbedaannya hanya pada kesterilan kerja dan resiko kontaminasi pada pekerjaan di luar laminar. Supernatan tersebut mengandung DNA plasmid sehingga harus dipisahkan dari DNA kromosom. DNA plasmid mempunyai ukuran yang jauh lebih kecil daripada DNA kromosom sedangkan fungsi penambahan CaCl2 sendiri akan mempengaruhi dinding sel dan mungkin berperan dalam pengikatan DNA pada permukaan sel. Literatur yang sama menyebutkan bahwa penyerapan DNA secara nyata sebenarnya dipengaruhi oleh perlakuan kejut panas(Utomo,2005).Setelah dilakukan penambahan CaCl2 dingin, kemudian diresuspensi dandisentrifugasi lagi dengan kecepatan yang sama dan waktu yang sama seperti sebelumnyaSupernatan dibuang kembali ditambahkan lagi CaCl2 dingin di resuspensi lagi danselanjutnya diinkubasi dalam es. Sentrifugasi dilakukan berulang – ulang bermaksud agar DNA plasmid benar – benar sudah tidak bercampur lagi dengan DNA kromosom. Sedangkan penginkubasian dalam es bertujuan untuk membuat suhu di dalam media menjadi ekstrem halini akan berpengaruh dengan tahap selanjutnya yaitu
“heat
– shock’. Sel E.coli yang kompeten diberi perlakuan kejut panas untuk membuka pori pada dinding sel bakteri.Inkubasi dengan plasmid akan menyebabkan masuknya plasmid kedalam sel. Penambahan media LB setelah perlakuan kejut panas berfungsi untuk memenuhi kebutuhan nutrisi dari bakteri setelah mengalami perlakuan yang ekstrem.Untuk mengetahui sel yang telah mengalami
transformasi
maka
dilakukan
seleksi
transforman
dengan
memanfaatkan sifat yang dibawa sebagai markaseleksi. Bakteri ditumbuhkan pada medium yang mengandung kloramfenikol.
Dengan adanya kloramfenikol,maka sel E. coli yang dapat tumbuh hanya sel transforman atau sel yang telah memasukkan plasmid. Inkubasi selama 18 jam akan menumbuhkan koloni bakteri yang berasal dari sel tunggal. Semua bakteri yang tumbuh dalam koloni tersebut akan memiliki sifat yang sama sebagai bakteri transforman.Tabung mikro sentrifuga hasil inkubasi 2jam yang masing-masing berisi 50μl sel kompeten, salah satunya atau tabung nomor
A ditambah dengan 5μl plasmid p CAMBI A 1201, sedangkan tabung nomor B tidak ditambah dengan p CAMBIA. Kedua tabung diinkubasi lebih lanjut dalam es selama 20 menit, kemudian diberi kejut panas (heat-shock)selama 90 detik dengan suhu 42 c dan segera dipindah kan kedalam es untuk diinkubasi kembali selama 20 menit. Tabung mikro sentrifuga ditambahkan media LB hingga 1 ml setelah inkubasi 10menit, dilanjutkan dengan inkubasi 10 menit, dilanjutkan o
dengan inkubasi dalam shaker-incubator pada suhu 37 c dengan kecepatan rotasi 150 rpm selama 1,5 jam.
Sebanyak 100 μl hasil diinkubasi ditumbuhkan
dengan cara plating ke media cawan LB/Kloramfenikol untuk kedua tabung.
Selain itu, sebanyak 50 μl hasil inkubasi pada tabung nomor B ditumbuhkan juga pada media LB kloramfenikol . Selain itu dilakukan kontrol positif dan kontrol negative. Kontrol positif digores dengan E.Coli manakala kontrol negative hanya mengandungi LB agar Inkubasi dilakukan selama 18jam /over o
night pada 37 C.
pCAMBIA adalah sesuatu vektor yang digunakan dalam bidang bioteknologi. pCAMBIA yang digunakan adalah pCAMBIA 1201. Ciri ciri pCAMBIA adalah :
asal copy rendah-replikasi menghasilkan rendah preps DNA hasil;
replikan tidak stabil, menyebabkan hilangnya variabel plasmid selama propagasi;
saiz gedik
kurangnya situs restriksi nyaman untuk manipulasi
terbatas pilihan untuk kedua bakteri dan tanaman
kurangnya cara sederhana untuk membangun fusi gen pelapor
pCAMBIA digunakan dalam praktikum ini karena pCAMBIA mempunyai kemampuan memproduksi nomor tinggi dalam E.coli untuk hasil DNA tinggi. Ciri lain vektor ini adalah
pVS1 replicon untuk stabilitas tinggi dalam Agrobacterium
size kecil, 7-12kb plasmid yang sesuai
situs restriksi dirancang untuk modifikasi plasmid modular dan kecil tapi memadai poli-linker untuk memperkenalkan DNA Anda minati
pemilihan bakteri untuk chloramphenicol or kanamycin seleksi tanaman dengan higromisin B atau kanamisin (seleksi fosfinotrisin dihentikan atas
permintaan pemilik IP, Bayer, setelah
distribusi awal tahun 1997)
cara sederhana untuk membangun fusi translasi gen reporter gusA
Perbedaan pCAMBIA 1201 dan pCAMBIA 2201 adalah: pCAMBIA Rgene
R-gene
Polylinker Reporter T-DNA
bacteria
Lac-
Vector
gene
size(BP) Z
family
plants 2201
nptII
cmr
pUC18
gusA
5391
-
GIS
1201
hptII
cmr
pUC18
gusA
5606
-
GIS
Perbedaan antara kedua vector tersebut adalah size. Gus A merupakan reporter gene untuk kedua-dua vektor tersebut. Fungsi kedua vektor adalah untuk
meningkatkan produksi E.coli . Basa pasang kedua vektor berbeda. pCAMBIA 2201 dan pCAMBIA 1201 terdiri dari Gus intro selection vectors pCAMBIA.
Gambar 2: Struktur pCAMBIA
Dari hasil pengamatan menunjukkan bahwa cawan petri yang dibuat kontrol positif yang telah digores dengan E.Coli terdapat pertumbuhan manakala kontrol negatif yang hanya mengandungi LB agar tidak terdapat pertumbuhan mikroorganisme. Manakala cawan petri A yang mengandungi pCAMBIA dan diletakkan antibiotik kloramfenikol didapati tidak ada pertumbuhan.Cawan petri B yang tanpa pCambia tapi tapi mengandungi kloramfenikol juga tidak mengandungi pertumbuhan mikroorganisme. Dari hasil yang didapati , sepatutnya cawan petri A akan terdapat pertumbuhan koloni ini kerana hal ini dikarenakan bahwa E.coli tersebut
mengandung gen resisten kloramfenikol yang di transformasi dari pCAMBIA yang mengandung gen resisten kloramfenikol. Kesalahan yang mungkin dilakukan oleh kami yang memungkinkan mempengaruhi result adalah, dimungkinkan kloramfenikol telah rusak karena kepanasan, atau mungkin disebabkan karena dalam berkerja kurang aseptis atau kurang steril. Bakteri ditumbuhkan pada medium yang mengandung kloramfenikol. Dengan adanya kloramfenikol, maka sel E. coli yang dapat tumbuh hanya sel transforman atau sel yang telah memasukkan plasmid. Inkubasi selama 18 jam akan menumbuhkan koloni bakteri yang berasal dari sel tunggal. Semua bakteri yang tumbuh dalam koloni tersebut akan memiliki sifat yang sama sebagai bakteri transforman. VIII. KESIMPULAN
Dari hasil percobaan kali ini cawan petri yang dibuat kontrol positif yang telah digores dengan E.Coli terdapat pertumbuhan manakala kontrol negatif yang hanya mengandungi LB agar tidak terdapat pertumbuhan mikroorganisme. Manakala cawan petri A yang mengandungi pCAMBIA dan diletakkan antibiotik kloramfenikol didapati tidak ada pertumbuhan. Cawan petri B yang tanpa pCambia tapi tapi mengandungi kloramfenikol juga tidak mengandungi
pertumbuhan
mikroorganisme.
Daripada
percobaan
ini
sepatutnya cawan petri A akan terdapat pertumbuhan koloni ini kerana hal ini dikarenakan bahwa E.coli tersebut mengandung gen resisten kloramfenikol yang di transformasi dari pCAMBIA yang mengandung gen resisten kloramfenikol.
Kesalahan
yang
mungkin
dilakukan
oleh
kami
yang
memungkinkan mempengaruhi result dimungkinkan kloramfenikol telah rusak karena kepanasan, atau mungkin disebabkan karena dalam berkerja kurang aseptis atau kurang steril.
IX.
LAMPIRAN
DAFTAR PUSTAKA
Brown, T.A. 1991. Pengantar cloning Gena. Yayasan Essentia Medica. Yogyakarta. Pelczar, M.J. dan E.C.S. Chan, 1986. Dasar _ Dasar Mikrobiologi Jilid I . Universitas Indonesia. Jakarta. Tsen et al. 2002. Natural plasmid transformation in Escherichia coli. Journal of Biomedical Science 9:246-252. Wibowo.2002.
Tranformasi
Fragmen
Dna
Kromosom
Xanthomonas
Campestris Ke Dalam Escherichia Coli. MAKARA, SAINS, VOL. 6, NO. 1
