UJI CEMARAN MIKROBA PADA MAKANAN DAN MINUMAN (SUSU, DAGING, IKAN)
1.1 Definisi Uji Cemaran Bakteri Pada Makanan dan Minuman
Pengawasan mutu dan keamanan produk makanan dan minuman sangat penting dilakukan guna memberikan jaminan kepada masyarakat bahwa produk-produk yang mega gunakan dan konsumsi memenuhi persyaratan yang telah ditentukan. Pengujian cemaran bakteri dilakukan pada sediaan obat, obat tradisional, makanan, minuman, kosmetika, dan alat kesehatan. pengujian cemaran bakteri mencakup berbagai cara, seperti: 1. Angka lempeng total (ALT) 2. Metode filtrasi 3. Angka kapang-khamir (AKK) 4. Pemeriksaan bakteri patogen
1.2 Manfaat Pengujian Bakteri
Tingkat konsumsi masyarakat terhadap obat, obat tradisional, makanan, dan minuman cenderung terus bertambah seiring dengan perubahan pola konsumsi masyarakat. Namun demikian, masih banyak masyarakat yang belum menyadari risiko dan dampak mengonsumsi suatu produk yang tidak memenuhi kuaitas secara mikrobiologis terhadap kesehatan. oleh karena itu tujuan pemeriksaan dan pengawasan terhadap mutu produk secara mikrobiologis adalah untuk mejamin keamanan, keselamatan, dan kesehatan masyarakat dalam mengonsumsi atau menggunakan produk-produk produk-produk tersebut.
1.3 Jenis-Jenis Pengujian Bakteri Patogen Pada Makanan 1. Uji Indol
Uji Indol bertujuan untuk menentukan kemampuan bakteri dalam memecah asam amino triptofan. Media ini biasanya digunakan dalam indetifikasi yang cepat. Hasil uji indol yang diperoleh negatif karena tidak terbentuk lapisan (cincin) berwarna merah muda pada permukaan biakan, artinya bakteri ini tidak membentuk indol dari tryptopan sebagai sumber karbon, yang dapat diketahui dengan menambahkan larutan kovacs. Asam amino triptofan merupakan komponen asam amino yang lazim terdapat pada protein, sehingga asam amino ini dengan
mudah dapat digunakan oleh mikroorganisme akibat penguraian protein (Sugianto, 2012). 2. Uji TSIA
Pada uji TSIA warna media slant berubah menjadi merah karena bakteri bersifat basa ini menandakan bahwa bakteri ini tidak memfermentasi laktosa dan sukrosa. Pada media daerah butt media berubah berwarna kuning ini menandakan bakteri memfermentasi glukosa. Pembentukan gas positif ini hasil dari fermentasi H2dan CO2 dapat dilihat dari pecahnya dan terangkatnya agar.Pembentukan H2S positif ditandai dengan adanya endapan berwarna hitam. TSIA agar mengadung laktosa dan sukrosa dalam konsentrasi 1%, glukosa 0,1% dan phenol red sebagai indikator yang menyebabkan perubahan warna dari merah orange menjadi kuning dalam suasana asam. TSIA juga mengandung natrium trisulfat, yaitu suatu substrat untuk penghasil H2S, ferro sulfat menghasilkan FeS (precipitat), bewarna hitam untuk membedakan bakteri H2S dengan bakteri-bakteri lainnya (Sugianto, 2012).
3. Uji urease
Uji urease digunakan untuk mengetahui kemampuan mikroba menghidrolisis urea menjadi amonia. Enzim urease akan menguraikan urea menjadi amonia. Uji urease menunjukkan hasil positif jika terjadi perubahan warna dari kuning menjadi merah keunguan.Hasil uji urease negatif jika tidak terjadi perubahan warna dari kuning menjadi merah keunguan ke unguan (Sugianto, 2012). 4. Uji Dekarboksilasi Lysin
Uji Dekarboksilasi Lysin menggunakan media Xylose-Lysine- Desoxycholate Agar medium digunakan untuk isolasi Salmonella dan memilah organisme lain
dengan cara memfermentasi xylose, dekarboksilasi lysine dan produksi H2S. Fermentasi xylose sangat lazim bagi kebanyakan organisme enterik kecuali, Shigella, Providencia,Edwardsiella. Pada media ini, Salmonella akan membentuk koloni merah dengan inti hitam, sedang Pseudomonas dapat tumbuh dengan warna merah dan Eschericia berwarna kuning. Mikroba lain yang dapat tumbuh pada media ini antara lain Arizona, Proteus, Aerobacter, Klebsiella, Citrobacter. Begitu banyak mikroba yang dapat tumbuh, sehingga media ini kurang dapat memilah Salmonella pada tahap awal. Lebih baik digunakan untuk tahap konfirmasi kontaminan Salmonella (Sugianto, 2012). 5. Uji β-galaktosidase β-galaktosidase
Uji β-galaktosidase β-galaktosidase digunakan utuk identifikasi beberapa jenis bakteri seperti Salmonella. Enzim β-galaktosidase β-galaktosidase merupakan enzim yang dapat mengubah laktosa menjadi glukosa dan galaktosa. Beberapa mikroorganisme seperti E. coli, dapat menggunakan laktosa sebagai sumber karbon.Selain laktosa, substrat alamiah dari enzim, adalah bahan yang sangat penting, ONPG (o-nitro-phenyl- β-Dgalactopyranoside), galactopyranoside), dapat digunakan pula.Β-galaktosidase pula.Β -galaktosidase dapat mengkatalisis ONPG menjadi galaktosa dan o-nitrofenol. ONPG tidak berwarna tetapi setelah hidrolisis menjadi o-nitrofenol, akan timbul warna kuning pada larutan yang alkali. beberapa jenis bakteri yang mampu melakukan fermentasi terhadap karbohidrat Streptococcus,
Lactobacillus,
Zygomonas,
Saccharomycetes,
Escherichia,
Enterobacter, Salmonella (Sugianto, 2012). 6. Uji Serologi
Uji serologi tidak terjadi aglutinasi pada penambahan antisera polivalen O, H, dan Vi. 7.
Uji Voges Proskauer
Uji Voges Proskauer bertujuan untuk mengidentifikasi jenis bakteri Untuk membedakan bakteri Escherichia bakteri Escherichia coli dengan Enterobacter dengan Enterobacter aerogenes aerogenes.. Hasilnya uji ini negatif, karena tidak terbentuk warna merah pada medium setelah ditambahkan á-napthol dan KOH, artinya hasil akhir fermentasi bakteri ini bukan asetil metil karbinol (asetolin).Salmonella (asetolin).Salmonella positif positif jika pada uji biokimia yang dilakukan hasilnya sebagai berikut:
Glucose + O2
Acetic acid
2,3-butanediol acetylmethylcarbinol
CO2 + H2
Tahap 1 CH 3
C
OH
O
CH
OH
CH 3
40% KOH
C
NH 2
O
+
Oxidation
CH 3
C
O
CH 3
acetylmethylcarbinol
C
NH
+
Diacetyl
alpha-naphthol
NH
R
Guanidine group of peptone
Tahap 2
Uji Voges-Proskauer positif ditandai dengan warna biakan menjadi merah muda sampai merah menyala setelah ditetesi larutan alfa naftol dan KOH 40 % (3:1). Pada uji ini terjadi pembentukan asetimetilkarbinol dari dekstrosa. 8. Uji Sitrat
Uji sitrat positif ditunjukkan oleh perubahan warna biakan dari hijau menjadi biru karena terbentuknya natrium karbonat hasil reaksi enz imatis yang mengubah indikator bromtimol biru pada media.
1.4 Prosedur Pengujian Bakteri Patogen Pada Makanan Makanan
1.4.1 E . co coli 1. Uji indol
Dari biakan murni nutrient agar miring, diinokulasikan 1 sengkelit biakan ke dalam media methyl red-voges proskauer (MR-VP), kemudia diinkubasi pada suhu 37 0C selama 48 jam. Dengan menggunakan pipet, 5 mL biakan dipindahkan kedalam tabung reaksi, ditambahkan 5 tetes methyl red dan dikocok sampai homogen. Warna kuning menunjukkan reaksi negatif dan warna merah menunjukkan hasil positif.
2. Uji voges proskauer
Dari biakan murni nutrient agar miring, diinokulasikan 1 sengkelit biakan ke dalam media methyl red-voges proskauer (MR-VP), kemudia diinkubasi pada suhu 370C selama 48 jam.
Dengan menggunakan 1 mL biakan dipindahakan kedalam tabung reaksi, ditambahkan 0,5 mL larutan
-naftol da 0,2 mL larutan kalium hidroksida, kemudian
dikocok sampai homogen dan didiamkan selama 2-4 jam. Warna merah muda hingga merah tua menunjukkan reaksi positif, sedangkan warna tidak berubah menunjukkan reaksi negatif.
3. Uji sitrat
Dari biakan murni nutrient agar miring, diinokulasikan 1 sengkelit biakan ke dalam media simmon citrat kemudian diinkubasi pada suhu 37 0C selama 48-96 jam. Warna biru menunjukkan reaksi positif, sedangkan sedangkan warna hijau menunjukkan hasil negatif.
1.4.2 Clostridium perfringers 1. Uji Pada Urea Agar
Koloni dugaan salmonella digoreskan pada permukaan media agar miring, kemudian diinkubasi pada suhu 370C selam 24 jam. Timbulnya warna merah muda mennjukkan reaksi positif, sedangkan tidak ada perubahan reaksi negatif. 2. Uji Dekarboksilasi Lisin
Koloni
dugaan
salmonella
diinokulasikan
pada
pembenihan
dekarboksilase broth kemudian diinkubasi pada suhu
cair
lisyn
37 0C selama 48 jam.
Timbulnya warna ungu menunjukkan reaksi positif. 3. Uji Serologi
Koloni dugaan salmonella diambil sebanyak 1 sengkelit dan disuspensikan dengan 1 tetes larutan NaCl fisiologis pada kaca objek. Selanjutnya, suspensi diteteskan dengan antiserum salmonella polivalen O dan dihomogenkan dengan menggoyangkan kaca objek atau menggunakan sengkelit. Pengamatan dilakukan selaa 5 menit. Salmonella positif jika terjadi aglutinasi.
1.4.3 Staphylococcus aureus Sampel yang akan diperiksa dihomogenkan dan diencerkan dengan larutan peptone dilution fluid (PDF) hingga didapatkan pengenceran 10-1. Sebanyak 2,0 ml larutan sampel hasil pengenceran 10-1 diambil dan dimasukkan ke dalam tabung reaksi yang berisi 18,0 ml media trypticase soy broth (TSB) lalu diikubasi pada suhu 37 oC selama 24-48 jam. Biakan dalam TSB kemudian diinokulkasikan dengan menghunakan ose pada lempeng media baird parker agar (BPA).
Perlakuan
yang
sama
diberlakukan
juga
pada
kontrol
positif
dengan
menggoreskan Staphylococcus aureus pada media yang sama. Semua biakan diinkubasi pada suhu 37 oC selama 24-48 jam dengan posisi cawan terbalik. Koloni yang diduga merupakan staphylococcus aureus adalah koloni spesifik yang berwarna hitam mengkilat dengan lingkaran cerah disekelilingnya. Selanjutnya koloni dugaan yang spesifik dipilih dari biakan BPA untuk dilakukan uji konirmasi, yaitu uji koagulase. Kurang lebih 10 koloni dugaan staphylococcus dipilih dari biakan BPA dan diinokulasikan ke dalam media brain heart infusion broth (BHIB). Biakan diinkubasi pada suhu 37 oC selama 20-24 jam. Sebanyak 0,1 ml dari setiap biakan dalam BHIB dipipet dan dipindahkan ke dalam tabung reaksi steril. Selanjutnya ditambahkan 0,3 ml plasma penguji pada masing-masing tabung. Tabung kemudian diinkubasi pada suhu 37 oC selama 4-6 jam. Diamati adanya reaksi penggumpalan plasma. Penggumpalan menunjukkan koagulase Staphylococcus aureus positif.
1.4.4 Salmonella typhi 1. Penanaman Penanaman pada media triple sugar iron agar (TSIA)
Koloni dugaan salonella dipindahakna ke pembenihan miring TSIA dengan cara menggores pada bagian miring dan menusuk pada bagian tegak pembenihan, kemudian diinkubasi pada suhu 37 oC selama 24-48 jam. Perubahan yang terjadi diamati : Pada bagian tegak, salmonella tegak, salmonella akan : -
Memfermentasi glukosa, warna media tetap ungu.
-
Tidak memfermentasi sukrosa, warna media tetap ungu.
-
Membentuk H2S, warna media berubah dari warna ungu menjadi hitam.
Pada bagian miring, salmonella miring, salmonella akan: -
Memfermentasi laktosa atau sakarosa, warna media menjadi kuning
-
Tidak memfermentasi laktosa dan sakarosa, warna media tetap merah atau tidak berubah.
2. Uji pada urea agar
Koloni dugaan salmonella digoreskan pada permukaan media urea agar miring. Kemudian diinkubasi pada suhu 37 oC selama 24 jam. Timbulnya
warna merah muda menunjukkan reaksi positif, sedangkan tidak ada perubahan warna menunjukkan reaksi negatif.
3. Uji dekarboksilasi lisin
Koloni dugaan salmonella diinokulasikan pada pembenihan cair lysine decarboxylase broth, kemudian diinkubasi pada suhu 37 oC selama 48 jam. Timbulnya warna ungu menunjukkan reaksi positif. 4. Uji voges proskauer
Koloni dugaa salmonella dimasukkan masing-masing 1 ose ke dalam 2 tabung reaksi yang msing-masing berisi 0,2 mL pembenihan voges proskauer (VP). Tabung ke-1 diinkubasi pada suhu kamar dan tabung ke-2 diinkubasi pada suhu 37oC selama 24-48 jam. Selanjutnya, pada setiap tabung, diteteskan 2 tetes larutan kreatin, 3 tetes larutan α-naftol, dan 2 tetes pereaksi KOH. Pengocokan dilakukan tiap kali pereaksi ditambahkan. Pengamatan dilakukan selama 15 menit, terbentuknya warna merah jambu sampai merah tua menunjukkan hasil positif, sedangkan jika tidak berubah, menunjukkan reaksi negatif.
5. Uji indol
Koloni dugaan salmonella diinokulasikan sebanyak 1 sengkelit ke dalam media indol dalam tabung, kemudian diinkubasi pada suhu 37oC selama 24 jam. Selanjutnya, ditambahkan 1 ml pereaksi indol. Terbentuknya gelang merah menunjukkan reaksi positif, sedangkan bila tidak berwarna atau kuning kecoklatan, menunjukkan reaksi negatif.
6. Uji serologi
Koloni dugaan salmonella diinokulasikan sebanyak 1 sengkelit dan disuspensikan dengan satu tetes larutan NaCL fisiologis pada kaca objek. Selanjutnya, suspensi ditetesi dengan antiserum Salmonella polivalein O dan dihomogenkan dengan menggoyangkan kaca objek atau menggunakan sengkelit. Pengamatan dilakukan selama 5 menit, Salmonella positif jika terjadi aglutinasi.
1.4.5 Vibrio cholera 1. Penanaman Penanaman pada media triple sugar iron agar (TSIA ) Satu ose biakan diambil dari biakan nutrien agar miring dan diinokulasikan pada media TSI agar, kemudian diinkubasi pada suhu 37oC selama 24 jam. Biakan vibrio cholera akan berwarna kuning dipermukaan dan di dasar tabung tanpa pembentukan gas H2S. 2. Uji oksidase
Kertas saring (6x6 cm) disiapkan di dalam cawan petri. Bagian tengah kertas diberi tiga tetes pereaksi tetra metil paraphenilendiamin. Selanjutnya, satu ose biakan diambil dari biakan nutrien agar miring dan ditotolkan pada bagian kertas saring yang sudah jenuh dengan peraksi sepanjang 3-6 mm. Pembentukan warna ungu tua yang cepat menunjukkan reaksi positif. Vibrio cholera memberikan reaksi oksidase positif. 3. Uji fermentasi karbohidrat
Satu ose biakan diambil dari biakan nutrien agar miring dan diinokulasikan pada sejumlah media peptone sugar broth yang masing-masing ditambahkan glukosa, sukrosa, manosa, manitol. Selanjutnya diinkubasi pada suhu 37oC selama 4-5 hari dan diamati setiap hari. Mumculnya warna kuning menunjukkan terbentuknya asam, yang berarti terjadi proses fermentasi. Vibrio cholera dapat memfermentasi glukosa, sukrosa , manosa, dan manitol. 4. Uji motilitas
Satu ose biakan diambil dari biakan nutrien agar miring dan diinokulasikan dengan cara ditusukkan kedalam media motilitas, kemudian diinkubasi pada suhu, 37oC selama 18-24 jam. Adanya pertumbuhan menyebar diamati disekitar tusukan. Vibrio cholera menunjukkan motilitas positif. 5. Pewarnaan gram
Vibrio cholera merupakan bakteri gram negatif yang berbentuk batang bengkok.
