Validacion de metodos analiticos.pdf

13/09/2013

CENTRO NACIONAL DE METROLOGÍA

Validación de Métodos Analíticos 02 al 04 de Octubre del 2013 Bogotá, Colombia. Instructores: Q. en A. Aura Bibiana García Alcántara [email protected] Dirección de Análisis Inorgánico

I.Q. Carlos E. Carbajal Alarcón [email protected] Dirección de Análisis Orgánico


Programa 02 de Octubre Bienvenida y presentación del curso

0h45

Introducción

01h15

Herramientas estadísticas básicas

02h15

Parámetros de la Validación de métodos

02h15

Comida

01h00

Recesos

00h30

Validación de Métodos Analíticos

Octubre del 2013, Diapositiva 2

1

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Programa 03 de Octubre Parámetros de la validación

03h45

Ejercicios

02h30

Comida

01h00

Recesos

00h30




Programa 04 de Octubre Documentación de métodos validados

00h45

Parámetros de la validación. Ejemplos

02h30

Comentarios y cierre de curso

01h00

Comida

01h00

Recesos

00h30



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Objetivo General ü Al

final

del

curso

el

participante

comprenderá el concepto de validación, así como los parámetros de desempeño del método para evaluar su cumplimiento con el uso propuesto, con lo que podrá obtener y demostrar la confiabilidad en los resultados de las mediciones. Validación de Métodos Analíticos



Objetivos particulares • Obtener los conocimientos básicos que apoyen a desarrollar un plan general de validación de métodos de análisis cuantitativo. • Identificar los parámetros de validación que deben evaluarse de acuerdo a una aplicación particular. • Conocer algunas herramientas estadísticas básicas que apoyen al proceso de evaluación de resultados en la validación de métodos analíticos. • Incorporar una visión panorámica que permita al profesional afrontar con éxito la problemática asociada a la validación de métodos analíticos en el laboratorio. • Comprender la importancia de validar un método de análisis cuantitativo de acuerdo a las exigencias de un sistema de gestión de calidad. Validación de Métodos Analíticos


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Validación de Métodos analíticos 1. INTRODUCCIÓN þ El concepto de validación þ Importancia y necesidad de la validación de métodos analíticos þ Grados de validación


El concepto de Validación Ø Confirmación mediante la aportación de evidencia objetiva de que se han cumplido los requisitos para una utilización o aplicación específica prevista. [ISO 9000:2005]

Ø Verificación de que los requisitos especificados son adecuados para un uso previsto. [VIM, 3ª. Ed. http://www.cenam.mx/publicaciones/gratuitas/]



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Requisito analítico, de acuerdo con el problema que se pretende resolver






Datos de experimentos planeados.


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Evidencia de que el método es adecuado para el propósito.



El concepto de Validación Validación de un Método Ø Proceso de establecer las características de desempeño (de un método), las limitaciones, la identificación de las variables de influencia y la confirmación de que dichas características son adecuadas al propósito propuesto. [NMX-CH-152-IMNC-2004]



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Jerarquía de la metodología analítica Definición

Ejemplo

Técnica

Base científica de la medición (Técnica de Espectrofotometría de absorción medición). atómica con sistema de atomización electrotérmica.

Método

Descripción genérica de la secuencia lógica Método de calibración externa para de operaciones utilizadas en una medición la medición de arsénico

Procedimiento

Protocolo

Descripción detallada de una medición conforme a uno o más principios de medida y a un método de medida dado, basado en un modelo de medida y que incluye los cálculos necesarios para obtener un resultado de medida. Conjunto de instrucciones que deben seguirse sin excepción, si los resultados analíticos serán aceptados para un propósito en particular.

ASTM (American Society for Testing and Materials) AOAC (Association of Analytical Communities) Método de calibración externa para la medición de arsénico en carne de bovino Ensayos de Aptitud Asuntos regulatorios (NMX, EPA, etc.) [VIM 3ª. Edición]




Requisitos Competencia técnica

Calificación

Instrumentos

Analista

Validación de métodos analíticos


Desarrollo del método


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Requisitos Calificación de equipo: • Proceso general que asegura que un instrumento es apropiado para el uso propuesto y que su desempeño está de acuerdo a las especificaciones establecidas por el usuario y el proveedor.

[P. Bedson, M. Sargent, The Development and application of guidance on equipment qualification of analytical instruments, J. of Accr. Qual. Ass., 1996, 265-274.] http://www.cenam.mx/publicaciones/gratuitas Validación de Métodos Analíticos



Requisitos Calificación de Equipo Calificación de Diseño (CD)

Define las especificaciones funcionales y operacionales del instrumento y detalla las decisiones en la selección del proveedor.

Calificación de Instalación (CI)

Establece que el instrumento es recibido como se diseñó y especificó, que está instalado adecuadamente en el ambiente seleccionado y que este ambiente es apropiado para la operación del mismo.

Calificación de Operación (CO)

El proceso en donde se demuestra que un instrumento funcionará de acuerdo a la especificación operacional en el ambiente seleccionado

Calificación de Desempeño (C de D)

Proceso para demostrar que un instrumento se desempeña de acuerdo a las especificaciones apropiadas a su uso rutinario. http://www.cenam.mx/publicaciones/gratuitas



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Requisitos Competencia técnica • El operador que realiza la validación de método debe ser técnicamente competente en el campo de trabajo bajo estudio. • Debe poseer suficiente conocimiento sobre el trabajo a realizar para poder tomar decisiones adecuadas. • La habilidad del analista constituye un factor crítico en el proceso de medición. Validación de Métodos Analíticos



Requisitos Desarrollo del método • La validación del método solo puede ocurrir después de que éste ha sido desarrollado y optimizado. • La optimización es el paso donde se requiere mayor tiempo y dedicación. • Es muy difícil separar el desarrollo y la optimización de la validación, ya que generalmente se traslapan. Validación de Métodos Analíticos


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Selección de métodos analíticos 1. 2.

Planteamiento del problema. Definición de la información analítica requerida. ü Información cualitativa, cuantitativa o ambas. ü Elemental, de grupos funcionales, de especies químicas. ü Los niveles de concentración de los analitos. ü Exactitud requerida. ü El grado de validación de los métodos disponibles. ü La exigencia legal de utilizar métodos oficiales. ü La disponibilidad de la instrumentación. ü La complejidad del método y la competencia técnica del personal. ü El tiempo disponible para la obtención de resultados. ü El costo. ü La seguridad del personal y el efecto medio ambiental.




Selección de métodos analíticos 3. Búsqueda en literatura. 4. Selección de un método. 5. ISO IEC-17025 “Requisitos generales para la competencia de los laboratorios de ensayo y de calibración”


PROBLEMA

MÉTODO

INFORMACIÓN ANALÍTICA

CARACTERÍSTICAS DE DESEMPEÑO


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Selección de métodos analíticos MÉTODOS DE ENSAYO Y CALIBRACIÓN Y VALIDACIÓN DEL MÉTODO

Generalidades. El laboratorio debe aplicar métodos y procedimientos apropiados para todos los ensayos o calibraciones dentro de su alcance.

Métodos y procedimientos apropiados Documentos actualizados y fácilmente disponibles para el personal.

þ Muestreo

þ Preparación

þ Manipulación

þ Incertidumbre

þ Transporte

þ Técnicas estadísticas

þ Almacenamiento [ISO IEC-17025]





Selección de métodos. El laboratorio debe utilizar métodos que satisfagan las necesidades del cliente y sean apropiados para los ensayos o calibraciones que se realicen.

Métodos y procedimientos apropiados þ Preferentemente deben usarse los métodos publicados en normas internacionales, regionales o nacionales

[ISO IEC-17025] Validación de Métodos Analíticos


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Métodos desarrollados Podrán usarse los métodos desarrollados o adoptados por el laboratorio para su propio uso...

... si son apropiados para el uso pretendido y si han sido validados





Debe ser una actividad þ Planeada

La implantación de métodos de ensayo o calibración desarrollados por el laboratorio

þ Asignada a personal calificado þ Equipado con recursos apropiados



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Métodos no normalizados. Cuando sea necesario usar métodos que no han sido normalizados, éstos deben ser tema de un acuerdo con el cliente incluyendo una clara especificación de los requisitos del cliente y el propósito del ensayo o calibración. Los métodos deben ser validados apropiadamente antes de su uso. [ISO IEC-17025] Validación de Métodos Analíticos



¿Por qué es necesaria la validación de un método? 2. El deber profesional del químico

1. Importancia de las mediciones analíticas 3. Requisito para acreditación del laboratorio



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¿Por qué es necesaria la validación de un método?

1. Importancia de las mediciones analíticas – Número de mediciones analíticas – Propósito de las mediciones • • • •

Fines comerciales Evaluación de la calidad de los productos Evaluación de la inocuidad de los productos Toma de decisiones




¿Por qué es necesaria la validación de un método?

2. El deber profesional del químico analítico – La validación del método permite al analista demostrar que el método es adecuado para su propósito y por lo tanto: • • •

Es posible soportar sus mediciones. Emite resultados confiables para resolver un problema particular. Prestigio para el laboratorio. $$$



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¿Por qué es necesaria la validación de un método? 3. Requisito para la acreditación del laboratorio El laboratorio debe validar: þ Métodos no normalizados. þ Métodos diseñados o desarrollados por el laboratorio. þ Métodos normalizados propuesto. þ Ampliaciones y normalizados. Validación de Métodos Analíticos

usados

modificaciones

fuera

de

del

los

alcance

métodos [ISO IEC-17025]



¿Cuándo deben validarse los métodos? ü Método nuevo para un problema específico. ü Método ya establecido revisado para incorporar mejoras o extenderlo a un nuevo problema. ü Método ya establecido que cambia con el tiempo. ü Método establecido usado en un laboratorio diferente o con diferentes analistas o con diferente instrumentación. ü Para demostrar la equivalencia entre dos métodos, por ejemplo, entre un método nuevo y uno de referencia. [H. Holcombe (Editor),The fitness for purpose of analytical methods, Eurachem Guide, LGC, 1998.] Validación de Métodos Analíticos


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¿Quién realiza la validación del método? • Validación interna • El proceso se lleva a cabo en un único laboratorio. • Es el laboratorio que ha desarrollado un nuevo método analítico o ha adoptado algún método con ciertas modificaciones.

• Validación externa • El método analítico es objeto del interés de diversos laboratorios. • La validación se lleva a cabo mediante estudios de colaboración. • EPA, AOAC, etc.




Proceso de validación interna Problema que requiere análisis químico: Definición de la necesidad analítica

Desarrollar método SI SI

Identificar un método existente o desarrollar un nuevo método

Evaluar el método - ¿Es adecuado al propósito de uso en el laboratorio?

NO

¿Desarrollo adicional factible?

NO

Replantear la necesidad analítica

NO SI

Método Validado

Procede el trabajo analítico Registro de validación (Declaración de validación del método) Necesidad analítica replanteada en términos de lo que se ha cumplido


No existe capacidad para hacer el trabajo: ¿subcontratar?

FIN Octubre del 2013, Diapositiva 26

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Grados de validación Costo Tiempo Clientes Experiencia

Grado de validación

• La validación debe ser tan amplia como sea necesaria para satisfacer las necesidades del tipo o campo de aplicación .

[ISO IEC-17025]

• Nota 3. La validación es siempre un equilibrio entre los costos, los riesgos y las posibilidades técnicas.




Grados de validación GRADO DE VALIDACIÓN

SITUACIÓN Desarrollo de un método para un problema en particular

Completo

Existe un método evaluado para aplicarlo en un problema en particular

Completo

Un método establecido, realizar una revisión para incorporar innovaciones

Parcial o completo

Un método establecido, extenderlo o adaptarlo a un problema nuevo

Parcial o completo

Cuando el control de calidad indica que un método establecido Parcial o cambia con el tiempo completo Establecer un método con diferente: laboratorio instrumentación u operador

Parcial

http://www.cenam.mx/publicaciones/gratuitas/ [Guía técnica sobre trazabilidad e incertidumbre en EAA, ICPAES, ema] Validación de Métodos Analíticos


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Grados de validación • Validación completa – – – – – – – – – –

• Validación parcial

Recuperación Sensibilidad Selectividad Robustez Límite de detección y de cuantificación Intervalo lineal y de trabajo Reproducibilidad Repetibilidad Veracidad Incertidumbre

– Recuperación

– Límite de detección y de cuantificación – Intervalo de trabajo – Reproducibilidad – Repetibilidad – Veracidad – Incertidumbre

[Guía técnica sobre trazabilidad e incertidumbre en EAA, ICPAES, ema] http://www.cenam.mx/publicaciones/gratuitas/ Validación de Métodos Analíticos



Resumen: Proceso de validación Propósito

•La parte central del proceso es el propósito del ejercicio.

Parámetros de desempeño

•Necesita establecerse de manera clara el alcance del método analítico.

Planeación

Interpretación


•Es útil considerar si la evaluación del método se requiere para demostrar su desempeño contra un requisito particular para un uso específico (validación) o contra un requisito previamente identificado (verificación)


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Resumen: Proceso de validación •¿Cuáles parámetros de desempeño son los críticos? El uso final del método ayudará a definir los requisitos de desempeño. •¿Qué valores deberán tener? De acuerdo al uso final será posible establecer una guía para constituir las especificaciones iniciales de desempeño.

Propósito

•La parte central del proceso es el propósito del ejercicio.


•Necesita establecerse de manera clara el alcance del método analítico.

Planeación

Interpretación


•Es útil considerar si la evaluación del método se requiere para demostrar su desempeño contra un requisito particular para un uso específico (validación) o contra un requisito previamente identificado (verificación)



Resumen: Proceso de validación Propósito


Planeación

•Como se va a medir el desempeño del método? •A partir de las especificaciones (características de desempeño y sus criterios) será posible planear un conjunto de pruebas para establecer si el desempeño del método es adecuado. •Cuanta experimentación se requiere?

Interpretación


•El número de pruebas requerido podrá ser estimado estadísticamente o siguiendo las recomendaciones publicadas en guías sectoriales. Octubre del 2013, Diapositiva 32

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Resumen: Proceso de validación Propósito •¿Cómo se van a interpretar los datos? •Mediante la comparación de los datos de desempeño contra las especificaciones establecidas, con ayuda de pruebas estadísticas. •Es posible que sea necesaria la evaluación por parte de un tercero.


Planeación

•Como se va a medir el desempeño del método? •A partir de las especificaciones (características de desempeño y sus criterios) será posible planear un conjunto de pruebas para establecer si el desempeño del método es adecuado. •Cuanta experimentación se requiere?

Interpretación

•Documentación de los resultados obtenidos

•El número de pruebas requerido podrá ser estimado estadísticamente o siguiendo las recomendaciones publicadas en guías sectoriales.




Bibliografía –

ISO 9000:2005 Sistemas de Gestión de la calidad-Fundamentos y vocabulario.

–

Vocabulario Internacional de Metrología Conceptos fundamentales y generales, y términos asociados (VIM), JCGM 200:2012 Traducción al español del VIM-3ª. (Versión de 2008 con correcciones menores). http://www.cenam.mx/publicaciones/gratuitas/descarga

–

H. Holcombe (Editor),The fitness for purpose of analytical methods. A laboratory guide to method validation and related topics, Eurachem Guide, LGC, Teddington, 1998. http://www.cenam.mx/publicaciones/gratuitas/

–

ISO IEC-17025:2005, Requisitos generales para la competencia de los laboratorios de ensayo y de calibración, ISO-2005.

–

NMX-CH-152-IMNC-2004, Metrología en Química-Vocabulario, Proyecto de norma, Instituto Mexicano de Normalización y Certificación, A.C.

–

J. K. Taylor, Validation of analytical methods, documento basado en la plática presentada en el 184th ACS National Meeting, Sept. 12-17, 1982, Kansas City.

–

P. Bedson, M. Sargent, The Development and application of guidance on equipment qualification of analytical instruments, J. of Accr. Qual. Ass., 1996, 265-274.

–

ISO GUIDE 33 “Uses of certified reference materials”, 2000.

–

Guías técnicas de trazabilidad e incertidumbre en las mediciones analíticas que emplean las técnicas de espectrometría de absorción atómica y de emisión atómica con plasma acoplado inductivamente, EMA-CENAM, 2004, México, D.F. http://www.cenam.mx/publicaciones/gratuitas/descarga/default.aspx?arch=/pdf-ensayos/ANALITICA%20EAAICP%20v01.pdf

–

John K. Taylor, Anal. Chem., 1983, 55 (6), pp 600A–608A, DOI: 10.1021/ac00257a001, May 1983. “Validation of analytical methods”



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Validación de Métodos analíticos

2. HERRAMIENTAS ESTADÍSTICAS BÁSICAS


Introducción


Julio del 2013, Diapositiva 2

1

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Introducción Datos (expresión)

Proceso

Interpretación

Toma de decisiones

_

Estadística descriptiva : cálculo de parámetros ( x, s) Estadística inferencial (inductiva): pruebas de hipótesis, t Student, u, etc. Validación de Métodos Analíticos



Aplicación en la validación

1

Método a validar

-Diseño - Realización de ensayos

Datos

Análisis estadístico

Requisitos de uso (previsto)

Método validado

Sí

No

1 Validación de Métodos Analíticos


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Definiciones. I. Medición. Proceso que consiste en obtener experimentalmente uno o varios valores que pueden atribuirse razonablemente a una magnitud. [VIM 3ª Ed. 2012]

II. Magnitud. Propiedad de un fenómeno, cuerpo o sustancia, que puede expresarse cuantitativamente mediante un número y una referencia. [VIM 3ª Ed. 2012] III. Mensurando. Magnitud que se desea medir.

[VIM 3ª Ed. 2012]

Ejemplo.Masa de la pesa D: 1.053 kg Concentración de masa de Ca en leche entera de 6.3 mg/L Validación de Métodos Analíticos



Medición Asignación de valor numérico

Objetos / eventos • Propiedades

Reglas específicas • Principios científicos

Escalas numéricas manipulables estadísticamente 1. Nominal 852365 2. Ordinal 3. Intervalo 4. Relación Validación de Métodos Analíticos


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Proceso de medición

Objeto/ escala

Población

-Diseño - Muestreo Tratamiento de muestras -Medición

Características del desempeño (precisión / exactitud)

Análisis estadístico Resultado




Estadística Inferencial • Los analistas necesitan tomar decisiones basadas en los resultados de sus mediciones analíticas y el soporte de éstas es la aplicación de técnicas estadísticas. Técnicas de medición

Mensurando

y = f ( x 1 , x 2 ,.....,

x

n

)

y

Interpretación Tratamiento de muestra Validación de Métodos Analíticos


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Proceso de medición

Objeto/ escala

Población

-Diseño - Muestreo Tratamiento de muestras -Medición

Características del desempeño (precisión / exactitud)

Análisis estadístico Resultado




Estadística Inferencial Muestreo Tipos de Muestreo 1. Muestreo no aleatorio: conocimiento y opinión personal para seleccionar los elementos de la muestra. 2. Muestreo Aleatorio: todos los elementos tienen la misma oportunidad de ser seleccionados

2.1 Muestreo aleatorio simple. Todos los elementos tienen la misma probabilidad 2.2 Muestreo sistemático. Intervalos uniformes, respecto a tiempo, orden o espacio 2.3 Muestreo estratificado. La población se divide en grupos homogéneos. Validación de Métodos Analíticos


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Estadística Inferencial

Muestreo

Distribución muestral x1 Muestra 1 Muestra 2 . . . Muestra n

x2

X1 X2

xn

Xn

s1 Muestra 1 Muestra 2 . . . Muestra n

. . .

Población

Distribución muestral de medias

Población

s2

S1 S2

sn

Sn

. . .

Distribución muestral de desviaciones estándar

Población Muestreo representativo (gde)


Distribución Normal



Estadística Inferencial Distribución normal Propiedades de la distribución normal. 1. Aproximadamente el 68 % de los valores caen dentro de ± 1 de la media

m m - 1s m - 2s m - 3s


m + 1s m + 2s m + 3s

2. Cerca del 95 % de los valores caen dentro de ± 2 de la media 3. Aproximadamente el 99.7 % de los valores se encuentran dentro de ± 3 de la media


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Estadística Inferencial Definiciones Medidas de tendencia central –Media (µ, x) Establece la posición de la distribución en una escala. Promedio aritmético. –Desviación estándar (s, s) Representa la dispersión de los valores individuales alrededor de la media. En análisis químicos nos basamos en el comportamiento de la distribución normal para propósitos prácticos. Estos valores son estimados a partir de las mediciones de la muestra.




Estadística Inferencial Definiciones Media Población

Muestra n

N

m=

åx i =1

N

åx

i

i

x=

i =1

n

• Propiedades: – Unicidad: solo un valor para cada conjunto de datos. – Simplicidad.

unicidad. (Del lat. unic tas, -!tis). 1. f. Cualidad de único.

– Sensible a todos los valores extremos.

[Real Academia Española ©]



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Estadística Inferencial Definiciones Medidas de dispersión • Evalúan la variación de los datos. • Hay poca dispersión si los datos son similares.




Estadística Inferencial Definiciones Varianza Es el promedio del cuadrado de la variabilidad de los datos con respecto a la media. Para una población

å (x -m) i

s =

i=1

N

_2

n

2

N 2

Para una muestra

å (x -x) i

2

s =

i=1

n-1

La varianza es teórica y aritméticamente más conveniente en muchas aplicaciones. Validación de Métodos Analíticos


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Estadística Inferencial Definiciones Desviación estándar La desviación estándar nos dice cuánto tienden a alejarse los valores individuales del promedio. Específicamente la desviación estándar es "el promedio de lejanía de los valores respecto de la media". Para una población 2

N

å (xi -m) i=1

s=

N

Para una muestra _2

n

å (x -x) i

s= Validación de Métodos Analíticos

i=1

n-1 Julio del 2013, Diapositiva 17


Estadística Inferencial Definiciones Coeficiente de variación El coeficiente de variación es la razón de la desviación estándar a la media aritmética, expresada como porcentaje:

% CV = Ejemplo.-

Muestra

s (100 ) x A

B

Media

48

124

Desv. est.

5.9

7.53

% CV

12

6

También se le conoce como desviación estándar relativa (DER) o (RSD por sus siglas en inglés).



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Estadística Inferencial Toma de decisiones (estadística)

Pruebas de hipótesis


Intervalos y límites de confianza Julio del 2013, Diapositiva 19


Estadística Inferencial Pruebas de hipótesis, pruebas de significación • Permiten comparar dos (o más) grupos de resultados de medición en forma objetiva. • Permiten obtener información sobre la exactitud de cada uno de los grupos de datos (métodos).



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Estadística Inferencial Pruebas de hipótesis, pruebas de significación Para muestras grandes (n > 30) Pruebas de hipótesis

Para muestras pequeñas 1. Comparación entre dos grupos de datos – Prueba t – Prueba F

1. Prueba de hipótesis de una cola

µ1 › µ0

2. Comparación para más de dos

2. Prueba de hipótesis de dos colas

grupos de datos – Prueba ANOVA

µ1 ! µ0 Validación de Métodos Analíticos



Estadística Inferencial Pruebas de hipótesis, pruebas de significación Hipótesis de una cola Una prueba es de una cola cuando la hipótesis alterna, H1, establece una dirección, como: – H0 : el ingreso medio de las mujeres es igual al ingreso medio de los hombres. – H1 : el ingreso medio de las mujeres es mayor que el de los hombres. Validación de Métodos Analíticos


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Estadística Inferencial Pruebas de hipótesis, pruebas de significación Hipótesis de dos colas Una prueba es de dos colas cuando no se establece una dirección específica de la hipótesis alterna H1, como: -H0 : el ingreso medio de las mujeres es igual al ingreso medio de los hombres. -H1 : el ingreso medio de las mujeres no es igual al ingreso medio de los hombres. Validación de Métodos Analíticos



Estadística Inferencial Pruebas de hipótesis, pruebas de significación Prueba t de Student • Es un procedimiento estadístico para comparar valores de medias muestrales. • Para decidir si la diferencia entre la media muestral y poblacional es significativa se formula una hipótesis nula H0 y una hipótesis alterna H1, las cuales serán aprobadas o rechazadas, al comparar una estimación contra un valor crítico (tablas) para la prueba t.

Zona de aceptación

1-a

Zona de rechazo Validación de Métodos Analíticos


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Estadística Inferencial Pruebas de hipótesis, pruebas de significación Prueba t de Student.- Situaciones de aplicación Situación Ecuación Comparación de la media x-m n experimental de una población con t= s un valor de referencia. Comparación de las medias de dos x1 - x 2 poblaciones. Ej. Una muestra t= 1 1 analizada por dos métodos, o bajo sc + dos condiciones experimentales n1 n2 diferentes Prueba t por pares. Ej. Al usar dos métodos analíticos x n t = d para medir muestras con sd contenidos sustancialmente diferentes del analito.

(

Hipótesis

)

H H

0

:m = x

1

:m ¹ x

g.L. n–1

H 0 : x1 = x2 H 1 : x1 ñ o á x2 sc =

n1 + n2 -2

s12 (n1 - 1) + s22 (n2 - 1) (n1 + n2 - 2 )

H0:d = 0 n-1

H1: d ! 0




Estadística Inferencial Pruebas de hipótesis, pruebas de significación Prueba t de Student.- Valor crítico de t Para observar el valor de t es necesario: crit

• Definir la dirección de la diferencia de los dos promedios – Prueba de una cola. – Prueba de dos colas (solo nos interesa saber si hay diferencia entre medias)

• Estimar los grados de libertad (gl)

gl = n - 1

gl = 2 muestras independientes

gl =

n

1

+

n

2

-2

• Seleccionar un nivel de confianza, en la práctica general de mediciones analíticas el nivel de confianza es 95 %. Validación de Métodos Analíticos


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Estadística Inferencial Pruebas de hipótesis, pruebas de significación Prueba t de Student.- Valor crítico de t

• Debemos observar: – Si tcal < tcrit la hipótesis nula es aceptada, es decir no hay diferencia significativa al nivel de confianza especificado. – Ejemplo xls.




Estadística Inferencial Pruebas de hipótesis, pruebas de significación Prueba F •

Los estadísticos que hemos visto se utilizan para comparar medias, por tanto para detectar errores sistemáticos. Pero para comparar los errores aleatorios se utilizan las varianzas de dos conjuntos de datos.

•

Este análisis puede tomar dos formas: 1. 2.

Se puede probar que el método A es mas preciso que el método B (de una cola). Los métodos A y B difieren en su precisión (dos colas).



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Estadística Inferencial Pruebas de hipótesis, pruebas de significación Prueba F •

Para probar si es significativa la diferencia entre dos varianzas muestrales, se plantea la hipótesis nula H0 : s12 = s22

•

Se calcula el estadístico F

F = s12 / s22 •

Esta prueba se utiliza para responder a la pregunta: ¿Son los 2 métodos igual de precisos?




Estadística Inferencial Pruebas de hipótesis, pruebas de significación Prueba F • Después se obtiene el valor de Fcrítico usando tablas; gl = (n1-1) y (n2-1) • Debemos observar: – Si Fcal < Fcrit la dispersión de los resultados en los 2 grupos de datos, no tiene una diferencia significativa. – Es decir, se acepta H0 – Ejemplo xls.



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Estadística Inferencial Pruebas de hipótesis, pruebas de significación Análisis de Varianza •

Es una herramienta estadística que permite comparar simultáneamente más de dos medias muestrales.

•

Es una herramienta muy poderosa que se utiliza para separar y estimar las diferentes causas de variación.

•

También se puede emplear en situaciones donde hay mas de una fuente de variación aleatoria.

•

ANOVA de un factor; es cuando se quiere probar el efecto de un factor controlado sobre la variación de una serie de mediciones.

•

Las muestras se comparan para establecer si son todas iguales (H0), o si al menos una de ellas es distinta de las demás (H1).




Estadística Inferencial Pruebas de hipótesis, pruebas de significación Condiciones para aplicar una ANOVA • Se requieren las siguientes condiciones: – Que la población que se muestrea tenga una distribución normal. – Que las poblaciones tengan varianzas iguales. – Que las muestras sean seleccionadas al azar y sean independientes.



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Estadística Inferencial Pruebas de hipótesis, pruebas de significación ANOVA Hipótesis nula (Ho): las medias muestrales no difieren significativamente. Hipótesis alterna (H1): al menos una de las medias muestrales difiere significativamente. Resumen de suma de cuadrado y grados de libertad Fuente de variación

Suma de cuadrados

Grados de libertad

Entre muestras

h-1

Dentro de muestras

h(n-1)

Total

hn-1




Estadística Inferencial Pruebas de hipótesis, pruebas de significación ANOVA Análisis Muestra No. 1

1-1

Submuestras

Mediciones (réplicas, lecturas)

1-1-1

1-1-2

Muestra No. n

….

1-2

1-1-3

1-2-1

1-2-2

n-1

1-2-3

n-1-1

n-1-2

n-2

n-1-3

n-2-1

n-2-2

n-2-3

Determinar: • Variación entre muestras • Variación dentro de muestras



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Estadística Inferencial Pruebas de hipótesis, pruebas de significación ANOVA.- Valor F Estadístico de prueba: F =

(Suma de cuadrados entre muestras) (Suma de cuadrados dentro de muestras) nå i

Fcal =

(x

i-

x

)

2

/ (h - 1 )

å å ( x ij - x j ) i

2

/ h ( n - 1)

j

Regla de decisión:

Si Fcal < Fcrit se acepta la hipótesis nula H0 Ejemplo xls. Validación de Métodos Analíticos



Estadística Inferencial Pruebas de hipótesis, pruebas de significación Utilidad Para un nivel de confianza del 95 % P= 0.05 se tiene un riesgo del 5% de que una hipótesis nula sea rechazada incluso cuando sea verdadera. Error tipo I.

Es posible mantener una hipótesis nula, aun cuando sea falsa. Error tipo II Validación de Métodos Analíticos

Tipo II

Tipo I

3,00

3,05

xc


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Bibliografía ü J.C. Miller & J.N. Miller, Analytical Chemistry, 1992, Ellis Horwood. ü J.C. Miller, J.N. Miller, Statistics for analytical chemistry, 3ra. Edición, Ellis Horwood PTR Prentice Hall, 1992, England. ü R.E. Walpole, R.H. Myers, probabilidad y estadística, 3ra edición en español, McGRAW-HILL, 1992, Edo. de México. ü G.T. Wernimont, use of statistics to develop and evaluate analytical methods, AOAC International, 1993, AOAC ü Técnica Administrativa, guía de estadística http://www.cyta.com.ar/biblioteca/bddoc/bdlibros/guia_estadistica/index.htm ago 2006. ü Instituto Tecnológico de Chihuahua http://www.itch.edu.mx/academic/industrial/estadistica1/toc.html, mayo 2007 ü D.C. Montgomery, Design and Analysis of experiments,1997, 5ª edición,Jhon Wiley and soons,USA. ü D.L. Massart y col. Chemometrics: A text book. Elsevier, Amsterdan, 1990, 3ª edición. ü P. Dux Handbook of quiality assurance for the analytical chemistry laboratory, 2ª edición. Van nostrand, 1990, USA. ü Casal J., Mateu E., “Tipos de muestreo”, Rev. Epidem. Med. Prev. (2003), 1: 3-7 ü Vocabulario Internacional de Metrología Conceptos fundamentales y generales, y términos asociados (VIM), JCGM 200:2012, VIM-3ª. http://www.cenam.mx/publicaciones/gratuitas/ Validación de Métodos Analíticos


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Validación de Métodos analíticos

3. PARÁMETROS DE LA VALIDACIÓN DE MÉTODOS ANALÍTICOS


Fuentes de Métodos Analíticos l

Métodos normalizados

l

Métodos de literatura

l

Métodos desarrollados por el laboratorio

l

Métodos publicados por organizaciones reconocidas a nivel mundial



1

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¡ CUIDADO ! En los procedimientos: L Extracción de elementos traza en sedimentos. Ø “A temperatura ambiente, agite durante 16 h en un agitador mecánico”

L Contenido de humedad de suelo. 1. Pesar un bote vacío con su tapadera 2. Pesar en el mismo bote una muestra de cuando menos 25 g de suelo seco al aire, cribado por un tamiz de 2 mm de diámetro 3. Registrar el peso del bote más suelo seco al aire 4. Colocar el bote y su contenido en la estufa y secar durante 24 horas a 105 °C, hasta peso constante 5. Registrar el peso del bote más suelo seco a la estufa. Validación de Métodos Analíticos



¡ CUIDADO ! • No suponga que solo porque el método es normalizado, o tiene datos de validación, sus analistas automáticamente serán capaces de llevarlo a cabo en su laboratorio.


???


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¿Cuáles parámetros deben evaluarse?


L. Detec.



Parámetros de la validación

• Confirmación de la identidad – Selectividad / especificidad • Límite de detección • Límite de cuantificación • Intervalo de trabajo / intervalo lineal • Sensibilidad • Exactitud – Veracidad – Precisión (repetibilidad, precisión intermedia y reproducibilidad) – Incertidumbre • Pruebas de Robustez • Recuperación [The Fitness for Purpose of Analytical Methods, Eurachem Guide, LGC, Teddington, 1998] Validación de Métodos Analíticos


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¿¿¿¡¡¡Todos los parámetros!!!??? Robustez

ü Siempre n Si es relevante û No necesario

Selectividad/Especificidad Intervalo Lineal Límite de cuantificación Límite de detección Reproducibilidad Repetibilidad Exactitud

Método Nuevo

ü

Normalizado

ü

Modificado

ü

ü

n

n

n

ü

ü

ü

ü

n

n

û

û

û

ü

ü

n

n

û

û

û

ü



Necesidades analíticas vs. Parámetros de desempeño Elementos de las necesidades analíticas


Parámetros de desempeño relacionadas

¿Qué clase de respuesta se requiere – cualitativa Selectividad/especificidad, límite de detección y o cuantitativa? de cuantificación ¿Se tiene interés en el analito extraíble, libre o Recuperación total? ¿Cuáles son los analitos de interés y en que Límite de detección niveles probables están presentes (%, mg g-1, Límite de cuantificación, Intervalo de trabajo y mL/L, etc.)? lineal ¿Qué grado de incertidumbre se permite y como Recuperación, Exactitud/ veracidad, Precisión de debe expresarse? repetibilidad y de reproducibilidad

[The Fitness for Purpose of Analytical Methods, Eurachem Guide, LGC, Teddington, 1998] Validación de Métodos Analíticos


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Necesidades analíticas vs. Parámetros de desempeño


Tipo de análisis Parámetro

Cualitativo

Precisión Especificidad/ selectividad

ü

Sesgo Robustez

ü

Intervalo lineal y de trabajo Límite de detección Límite de cuantificación

Análisis de trazas

Propiedades físicas

ü

ü

ü

ü

ü

ü

ü

ü

ü

ü

ü ü

ü [“Introduction to method validation”, VAM, LGC]




Herramientas para la validación de métodos Definiciones • Blancos: permiten evaluar que tanto de la señal medida es atribuida al analito o a otras causas. – Blancos analítico o de reactivos: Agua reactivo o matriz equivalente que no contiene, por adición deliberada, la presencia de ningún analito o sustancia por determinar, pero que contiene los mismos disolventes, reactivos y se somete al mismo procedimiento analítico que la muestra problema. • La señal de medición del analito en la muestra puede ser corregida por el contenido del analito en los reactivos. [NMX-CH-152-IMNC-2005, Metrología en química-Vocabulario] Validación de Métodos Analíticos


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Herramientas para la validación de métodos Definiciones

• Blancos: – Blancos de muestra: Esencialmente son matrices sin el analito de interés. • Son difíciles de obtener.

[The Fitness for Purpose of Analytical Methods, Eurachem Guide, LGC, Teddington, 1998]




Herramientas para la validación de métodos Definiciones • Muestras /materiales de prueba: – Muestras reales • Útiles para evaluar el efecto de las interferencias.

• Materiales / disoluciones fortificadas – Materiales o disoluciones que han sido fortificados con el analito de interés. • Considerar el contenido natural del analito. • La adición de una cantidad conocida de analito permite incrementar su respuesta y es posible conocer su concentración en términos de la cantidad agregada.



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Herramientas para la validación de métodos Definiciones • Materiales de referencia Material suficientemente homogéneo y estable con respecto a propiedades especificadas, establecido como apto para su uso previsto en una medición o en un examen de propiedades cualitativas. No es posible establecer trazabilidad [VIM 3ª Ed. 2012] Validación de Métodos Analíticos



Herramientas para la validación de métodos Definiciones

• Material de referencia certificado DMR

Material de referencia acompañado por la documentación emitida por un organismo autorizado, que proporciona uno o varios valores de propiedades especificadas, con incertidumbres y trazabilidades asociadas, empleando procedimientos válidos.

Valor certificado Incertidumbre

[VIM 3ª Ed. 2012] Validación de Métodos Analíticos


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Herramientas para la validación de métodos • Estadística: – Herramientas estadísticas básicas. • • • • • • •

Medidas de tendencia central Medidas de dispersión Pruebas de hipótesis Gráficas Método de mínimos cuadrados Análisis de residuales Diseño de experimentos

– Útil para el análisis de los resultados.




Parámetros de la Validación de Métodos Analíticos



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Parámetros de la validación • Confirmación de la identidad – Selectividad / especificidad • Límite de detección • Límite de cuantificación • Intervalo de trabajo / intervalo lineal • Sensibilidad • Exactitud – Veracidad – Precisión (repetibilidad, precisión intermedia y reproducibilidad) – Incertidumbre • Pruebas de Robustez • Recuperación [The Fitness for Purpose of Analytical Methods, Eurachem Guide, LGC, Teddington, 1998] Validación de Métodos Analíticos



Parámetros de la validación Límite de Detección (L.D.) l “La menor concentración del analito en una muestra que puede detectarse, pero no necesariamente cuantificarse bajo las condiciones establecidas de la prueba.” [Guía Técnica sobre trazabilidad e incertidumbre….,CENAM-ema, revisión 01, 2008]

l “El mínimo contenido que puede medirse con una certeza estadística razonable”

YL = Y bl + ksbl Ybl = Media de las mediciones del blanco K = Factor numérico de acuerdo al nivel de confianza deseado Sbl = Desviación estándar de las mediciones del blanco [The Fitness for Purpose of Analytical Methods, Eurachem Guide, LGC, Teddington, 1998] Validación de Métodos Analíticos


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Parámetros de la validación Límite de Detección (L.D.) Se refiere a la señal más pequeña de una magnitud medida, YL, ( o al valor de la concentración xL que se deriva de ésta) para un método analítico definido, que puede distinguirse de la señal de fondo a un nivel de confianza específico. [NMX-CH-152-IMNC-2005]

YL = Y bl + ksbl Ybl = Media de las mediciones del blanco k = Factor numérico de acuerdo al nivel de confianza deseado Sbl = Desviación estándar de las mediciones del blanco Validación de Métodos Analíticos



Parámetros de la validación Límite de Detección (L.D.) Importancia

Medición (Y ) = Yu - Ybl Yu ¹ Ybl Yu - Ybl ¹ 0

El analista se enfrenta a dos problemas: 1. Falsos positivos: declarar la presencia de un analito, cuando en realidad está ausente. Error tipo I o tipo a. 2. Falsos negativos: declarar la ausencia de un analito, cuando en realidad está presente. Error tipo II o tipo b. Validación de Métodos Analíticos


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Parámetros de la validación Límite de Detección (L.D.)

Significado

Analito Presente (a)

Analito Ausente (b)

Límite de decisión

YL = Y bl + 3sbl 99.87% de confianza

Ybl

A

Límite de detección B

C Q

P Y Sbl 3Sbl Validación de Métodos Analíticos



Parámetros de la validación Límite de Detección (L.D.) l

Valor medido, obtenido mediante un procedimiento de medida dado, con una probabilidad b de declarar erróneamente la ausencia de un constituyente en un material, dada una probabilidad a de declarar erróneamente su presencia. [VIM, 3ra. edición]

• Nota 1: La IUPAC recomienda por defecto los valores de a y b iguales a 0.05. • Nota 2. En inglés algunas veces se usa la abreviatura LOD. • Nota 3. No debe utilizarse el término “sensibilidad” en lugar de “límite de detección”. Validación de Métodos Analíticos


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Parámetros de la validación Límite de Detección (L.D.) Referencia rápida ¿Qué se analiza ?

¿Qué calcular de los resultados ?

a)10 blancos de muestra Desviación estándar de la muestra de a) independientes, medidos una vez cada valores de los blancos de muestra, o b) uno. valores de blancos de muestra fortificados. LD se expresa como la concentración del b) 10 blancos de muestra analito correspondiente a a) promedio de independientes, fortificados a la menor los valores del blanco + 3s o b) 0 + 3s. concentración aceptable, medidos una vez cada uno. El inciso a) sólo es útil donde el blanco da una desviación estándar diferente de cero. Obtener un blanco “verdadero” puede ser difícil.




Parámetros de la validación Límite de Detección (L.D.) ¡¡¡ Importante !!! Note que la media y la desviación estándar del blanco son dependientes de la matriz del blanco. Consecuentemente, el límite de detección, será dependiente de la matriz.

Ø



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Parámetros de la validación Límite de Detección (L.D.)

Ejemplo.-

Blancos. Intensidad 163 179 165 172 160 175 161 170 172 160 180 181 178 164 176 Ybl=

1. Con los datos proporcionados calcular el límite de detección del método?

Concentración (ng Se / mL)

Intensidad

0.625 1.25 1.875 2.5 3.125 Ordenada al origen

185 198 218 225 245

Pendiente

Ej. Xls.

Sbl= Validación de Métodos Analíticos



Parámetros de la validación Límite de Cuantificación (L.C.) § Concentración mínima del analito en una muestra que puede determinarse con un nivel de incertidumbre aceptable. [Guía Técnica sobre trazabilidad e incertidumbre…, CENAM-ema, revisión 01, 2008 NC-2005]

§ “Es una característica de desempeño que señala la habilidad de un proceso de medición química, para cuantificar adecuadamente un analito” [IUPAC en The fitness for purpose of analytical methods. Eurachem]



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Parámetros de la validación Límite de Cuantificación (L.C.)

YQ = Y bl + ksbl Ybl = Media de las mediciones del blanco sbl = Desviación estándar de las mediciones del blanco k = Factor numérico de acuerdo al Coeficiente de Variación (CV) permitido Si k=10 el CV máximo permitido es de 10 % Si k= 6 el CV máximo permitido es de 16.7 % Si k= 5 el CV máximo permitido es de 20 % Validación de Métodos Analíticos



Parámetros de la validación Límite de Cuantificación (L.C.)

Referencia rápida ¿Qué se analiza ?

¿Qué calcular de los resultados ?

10 blancos de muestra independientes medidos una vez cada uno

Desviación estándar de los valores del blanco LC se expresa como la concentración del analito correspondiente al valor del blanco más : i)5s, ii)6s, iii)10s

b) Fortificar alícuotas del blanco de muestra a varias concentraciones del analito cercanas al L. D. Medir, una vez. Preparar 10 réplicas independientes a cada nivel de concentración.

Calcular la desviación estándar de los valores del analito a cada concentración. Graficar s contra la concentración y asigne un valor al L. C. mediante inspección. L. C. se expresa como la concentración mínima del analito que puede ser determinada con un nivel aceptable de incertidumbre.

Normalmente L. C. forma parte del estudio para determinar el intervalo de trabajo. Éste no deberá determinarse por extrapolación debajo de la concentración más baja del blanco fortificado. Si las mediciones se han realizado bajo condiciones de repetibilidad, también se obtiene una medida de la precisión de repetibilidad a esta concentración. [The Fitness for Purpose of Analytical Methods, Eurachem Guide, LGC, Teddington, 1998] Validación de Métodos Analíticos


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Parámetros de la validación Límite de Cuantificación (L.C.) 25 RSD (%)

20 15 10 5 0 0 L.C. 2

4

6

8

10

12

Concentración, mg/L




Parámetros de la validación Intervalo Lineal • Linealidad Ø Define la capacidad del método para obtener resultados proporcionales a la concentración del analito en la prueba .

• Intervalo lineal Ø Es el intervalo de concentraciones del analito de interés sobre las cuales el método proporciona resultados de pruebas proporcionales a la concentración del analito.

[Guía Técnica sobre trazabilidad e incertidumbre…, CENAM-ema, revisión 01, 2008] Validación de Métodos Analíticos


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Parámetros de la validación Intervalo de trabajo Ø

Conjunto de valores de las magnitudes de una misma naturaleza que un instrumento o un sistema de medida dado puede medir con una incertidumbre especificada, en condiciones determinadas. [VIM 3ra. Edición]

Ø

Intervalo de las concentraciones analíticas o los valores de las propiedades sobre los cuales el método va a ser aplicado. ü

Nota: Se refiere al intervalo de concentraciones o valores de las propiedades en las disoluciones medidas realmente, no a las muestras originales. [Guía Técnica sobre trazabilidad e incertidumbre…, CENAM-ema, revisión 01, 2008]




Parámetros de la validación Intervalo Lineal

Importancia

• La calibración en química es uno de los pasos más importantes en los análisis químicos. • Los métodos instrumentales generalmente dependen de la comparación de la señal de una muestra de concentración desconocida contra la de otra de concentración conocida (material de referencia). • Establece una relación teórica entre la señal del sistema de medición y la concentración. • Función de calibración: y = f(x), se obtiene mediante el ajuste de los datos experimentales a un modelo matemático adecuado. • La función de calibración más conveniente es la lineal. Validación de Métodos Analíticos


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Parámetros de la validación Intervalo Lineal El propósito de la calibración, es establecer una relación cuantitativa entre varias concentraciones conocidas (valores de materiales de referencia certificados, MRC) y sus señales correspondientes.

y = f(x) 0.040 0.035

y = 0.0004x - 0.002 R2 = 0.9983

0.030 A bs orb anc ia

0.025 0.020 0.015 0.010 0.005 0.000 0

20

40

60

80

100

w Hg, ng/kg




Parámetros de la validación Intervalo Lineal Método de mínimos cuadrados.• Describe la relación entre la señal y la concentración.

y = f (x, a, b1, . . . bm) donde: a, b1, . . . bm = son los parámetros de la función. x= variable independiente o controlada (concentración). y= variable dependiente (respuesta). Validación de Métodos Analíticos


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Parámetros de la validación Intervalo Lineal Método de mínimos cuadrados (MMC).• La relación entre cada par de observaciones (xi, yi), puede ser representada por:

\ L = ˞ + ˟ [ L + HL • Encontrar los estimados a (intercepto) y b (pendiente) de los valores reales a y b. • Calcular los valores de a y b para los cuales ei = residuales. Validación de Métodos Analíticos

åe

2 i

es mínima.



Parámetros de la validación Intervalo Lineal Método de mínimos cuadrados (MMC).ei = yi - yˆ i yˆ = a + bx i \

(x3, y3)

y

e3

(x1, y1) e1

e2

(x2, y2)

e4

(x4, y4)

ei = yi - a - bxi

a y b se encuentran minimizand o R R = å ei2 = ( yi - a - bxi ) 2

x Validación de Métodos Analíticos


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Parámetros de la validación Intervalo Lineal Método de mínimos cuadrados (MMC).Parámetros de la función

å (x - x )( y - y ) b= å (x - x ) i

i

a = y - bx

i

2

i

i

r=

å {(x

i

- x )( yi - y )}

i

ìé 2 ùé 2 ùü í ê å (xi - x ) ú ê å ( yi - y ) ú ý ûë i ûþ îë i


1

2




Método de mínimos cuadrados (MMC).Intervalo de confianza de a y b 1

sy x sy x

ì å ( yi - yˆi ) 2 ü 2 ï ï =í i ý ï ï n-2 þ î

sy/x: Desviación estándar de los residuales.

1

ì 2 ü2 íå (xi - x ) ý î i þ

ì å xi2 ü2 ï ï i sa = s y x í 2ý ï n å (xi - x ) ï î i þ

sb : Desviación estándar de la pendiente

sa : Desviación estándar del intercepto

sb =

1

I.C. Pendiente:

b ± tsb

I.C. Confianza ordenada al origen:

a ± tsa


n-2 grados de libertad


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Método de mínimos cuadrados (MMC).- Confirmación del modelo lineal • Análisis de residuales: – Detección de falta de ajuste. – Que las suposiciones del modelo son correctas.

Linealidad, homocedasticidad

No Linealidad, homocedasticidad

Linealidad, heterocedasticidad

No Linealidad, heterocedasticidad




Parámetros de la validación Intervalo Lineal y de Trabajo Referencia rápida Analizar 1.Blanco más materiales de referencia o blancos de muestra fortificados a varias concentraciones. Se necesitan al menos 6 concentraciones, más el blanco.

Repet.

¿Qué calcular de los datos ?

1

Grafique la respuesta de medición (eje y) contra la concentración medida (eje x) . Visualmente examinar para identificar el intervalo lineal aproximado y los límites superiores e inferiores del intervalo de trabajo.

Comentarios Idealmente las diferentes concentraciones deberán prepararse independientemente, y no de alícuotas de la misma disolución maestra. Esto dará una confirmación visual si el intervalo de trabajo es lineal o no.

Después vaya a 2



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Respuesta instrumental

Parámetros de la validación Intervalo Lineal y de Trabajo

Concentración del analito Validación de Métodos Analíticos



Parámetros de la validación Intervalo Lineal y de Trabajo Linealidad de Cd a 226.502 nm 14000 12000 10000

Cts/s

8000 6000 4000 2000 0 -2000 0

10

20

30

40

50

60

70

80

wCd (mg/kg) Validación de Métodos Analíticos


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Parámetros de la validación Intervalo Lineal y de Trabajo Disminución de la sensibilidad

Medición del intervalo lineal de Cd en disolución acuosa 0.95 0.90 0.85 0.80 0.75 0.70 0.65

(228.8 nm)

0.60 0.55 0.50 0.45 0.40 0.35 0.30 0.25 0.20 0.15 0.10 0.05 0.00

0

2

4

6

8

10

12

14

16

18

20

22

24

26

28

30

32

34

36

38

40

42

44

46

48

Fracción!de!masa!(µg/kg) Validación de Métodos Analíticos



Parámetros de la validación Intervalo Lineal y de Trabajo MEDICIÓN DE CADMIO POR EAA-AT 0.1800 0.1600

0.1400 0.1200

y = 0.0652x + 0.0018 R² = 0.9996

(228.8 nm)

0.1000 0.0800

0.0600 0.0400

0.0200 0.0000 0.00

0.50

1.00

1.50

2.00

2.50

3.00

FRACCION! DE!MASA!(µg/kg) Validación de Métodos Analíticos


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Parámetros de la validación Intervalo Lineal y de Trabajo Medición de Arsénico en media resolución (ICP-MASAS) 7000000

6000000

Intensidad (cps)

5000000

4000000

y = 2997.9x - 660.39 R² = 0.9999

3000000

2000000

1000000

0 0

250

500

750

1000

1250

1500

1750

2000

2250

2500

Fracción de masa (µg/kg)




Parámetros de la validación Intervalo Lineal y de Trabajo

Referencia rápida Analizar 2. Materiales de referencia o blancos fortificados al menos a 6 diferentes concentraciones dentro del intervalo lineal. Repeticiones: 3

¿Qué calcular de los datos ? Grafique la respuesta de medida vs. la concentración. Visualmente examine los puntos anómalos los cuales pueden no estar reflejados en la regresión. Calcule el coeficiente de regresión apropiado. Calcule y grafique los valores residuales (diferencia entre el valor actual de “y” y el valor predicho por la línea recta, para cada valor de “x”). La distribución aleatoria de la línea recta confirma la linealidad. Tendencias sistemáticas indican la no-linealidad Después vaya a 3…

Comentarios En esta etapa es necesario probar un intervalo de trabajo que se piensa que es lineal y donde se pretende usar un sólo punto de calibración. Es inseguro remover los puntos anómalos sin revisar primero con otras mediciones a concentraciones cercanas. Si la varianza de las réplicas es proporcional a la concentración entonces utilice un cálculo de regresión ponderada en lugar de uno sin él. En ciertas circunstancias puede ser mejor tratar de ajustar los datos a una curva no lineal. Las funciones mayores que las cuadráticas por lo general no se recomiendan.



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Parámetros de la validación Respuesta instrumental

Intervalo Lineal y de Trabajo

r = 0.9999999999

Concentración del analito Validación de Métodos Analíticos



Parámetros de la validación Intervalo Lineal y de Trabajo Referencia rápida Analiza 3. Como para el Límite de cuantificación, LC (b)

¿Qué calcular de los datos ? Como para el LC LC efectivamente forma el término menor del intervalo de trabajo

Comentarios Trabajar con concentraciones más bajas sucesivamente hasta que la exactitud y la precisión sean inaceptables.



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Parámetros de la validación Intervalo Lineal Ejemplo.• Los siguientes datos fueron obtenidos para construir una curva de calibración para espectrometría de fluorescencia de R-X. Intensidades Concentración, pg/mL

2.1 0

5 2

9 12.6 17.3 4 6 8

21 10

24.7 12

26.7 28.7 14 16

• Determine el intervalo lineal (evaluar los residuales). • Calcule el coeficiente de correlación, la pendiente y la ordenada al origen . • Evalúe el intervalo de confianza de los parámetros de la recta. Validación de Métodos Analíticos


Parámetros de la validación


Intervalo Lineal Ejemplo.• Calcular los valores de la concentración (x0) y u(x0) para muestras con las siguientes intensidades (y0): Muestras

y0

1 2

2.9 13.5

• De acuerdo con los resultados, ¿Cuál de las muestras es medida con menor incertidumbre? ¿Porqué? • ¿Cómo se puede disminuir la incertidumbre de la medición asociada a la función de calibración? Validación de Métodos Analíticos


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Parámetros de la validación Intervalo Lineal y de Trabajo Disminución de la sensibilidad

1.2 Intervalo de trabajo

Respuesta

1 0.8 0.6 0.4

L. C. L. D.

0.2

Intervalo Lineal

0 0

0.2

0.4

0.6

0.8

1

1.2

Concentración Validación de Métodos Analíticos



Parámetros de la validación Sensibilidad • Cociente entre la variación de una indicación de un sistema de medida y la variación correspondiente del valor de la magnitud medida. [VIM 3ra. edición]

• Es el cambio en la respuesta de un instrumento de medición dividido por el correspondiente cambio del estímulo (señal de entrada). [The fitness for purpose of analytical methods. Eurachem]

• En Metrología y en química analítica puede ser explicada por la pendiente de la curva de calibración, expresada en los términos de los coeficientes que la conforman. Validación de Métodos Analíticos


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Parámetros de la validación Sensibilidad • •

•

Sensibilidad ¹ Límite de detección. Especificar el intervalo de concentraciones y condiciones experimentales. Es un parámetro útil para cálculos previos en una medición. c

¿Cual de las líneas tiene mayor sensibilidad?

b

y

a

S=

dy dx

x Validación de Métodos Analíticos



Parámetros de la validación Selectividad / Especificidad • Una muestra es una mezcla multicomponente • Consiste de dos partes: – Analito (s): componente de un sistema a ser medido químicamente. Un analito corresponde al mensurando en mediciones químicas. – Matriz: componentes de la muestra con excepción del analito.



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Parámetros de la validación Selectividad / Especificidad • Selectividad – En análisis cualitativos: Es el grado al cual otras sustancias interfieren en la determinación de una sustancia de acuerdo a un procedimiento dado. – En análisis cuantitativos: es un término utilizado en conjunto con otro sustantivo (ej. Constante, coeficiente, índice, factor) para la caracterización cuantitativa de interferencias. [IUPAC Compendium of Chemical Terminology, 1987] Validación de Métodos Analíticos



Parámetros de la validación Selectividad / Especificidad • Especificidad

– No se menciona el término como tal – Específico (en un análisis): Es un término que expresa cualitativamente el grado al cual otras sustancias interfieren en la determinación de una sustancia de acuerdo a un procedimiento dado. – Específico es considerado como 100 % selectivo, lo cual significa que no habrá interferencias.

[IUPAC Compendium of Chemical Terminology, 1987] Validación de Métodos Analíticos


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Parámetros de la validación Selectividad / Especificidad • Selectividad – La capacidad de un método para determinar exactamente y específicamente el analito de interés en presencia de otros componentes en una matriz de muestra bajo las condiciones de prueba establecidas.

• Confirmación de la identidad – Establecimiento de que la señal producida en la etapa de medición, la cual se atribuye al analito, se debe únicamente a él y no a la presencia de algo química o físicamente similar. [The fitness for purpose of analytical methods. Eurachem] Validación de Métodos Analíticos



Parámetros de la validación Selectividad / Especificidad • Selectividad – Propiedad de un sistema de medida, empleando un procedimiento de medida especificado, por la que el sistema proporciona valores medidos para uno varios mensurandos, que son independientes entre sí o de otras magnitudes existentes en el fenómeno, cuerpo o sustancia en estudio. – NOTA: En química, la selectividad de un sistema de medida generalmente se obtiene para magnitudes con componentes seleccionadas en concentraciones con intervalos determinados.

[VIM 3ra. edición] Validación de Métodos Analíticos


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Parámetros de la validación Selectividad / Especificidad

Referencia rápida ¿Qué hacer ?

Calcular / determinar

Comentarios

Análisis de muestras y materiales de referencia mediante el método candidato y otros métodos independientes.

Uso de resultados de las técnicas de confirmación para establecer la habilidad del método para confirmar la identidad del analito y su habilidad para medir el analito aislado de las interferencias.

Decidir que tanta evidencia de apoyo es requerida de manera razonable para dar suficiente confiabilidad.

Análisis de muestras conteniendo varias interferencias posibles en presencia del analito de interés.

Examinar el efecto de las interferencias -la presencia de la interferencia realza o inhibe la detección o cuantificación del mensurando.

Si la detección o cuantificación se inhibe por las interferencias, se requerirá desarrollo del método.




Parámetros de la validación Selectividad / Especificidad Interferencias y efecto de matriz • La matriz y otros analitos afectan la sensibilidad de la medición del analito de interés. • ¿Como se detecta? Efecto de matriz c/matriz

Diferencia en las pendientes de la curva de calibración con MR acuosos vs. MR con matriz. Validación de Métodos Analíticos

Y

s/matriz

X Octubre del 2013, Diapositiva 60

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Parámetros de la validación Selectividad / Especificidad Interferencias y efecto de matriz • Algunos elementos de la matriz contribuyen a la respuesta del analito sin afectar la sensibilidad de la medición. • ¿Como se detecta? Efecto de interferencias Pendientes iguales, c/interferencias Y diferencia en intercepto s/interferencias Ym de la curva de calibración con MR acuosos vs. MR Yb con matriz. X Validación de Métodos Analíticos




Interferencias y efecto de matriz

• ¿Como se corrigen? • Efectos de matriz: Calibración con Adiciones de MR

Concentración en la muestra: X=-a/b

Y Señal de la muestra

concentración del analito en la muestra X, concentración adicionada Validación de Métodos Analíticos


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Parámetros de la validación Selectividad / Especificidad Interferencias y efecto de matriz • ¿Como se corrigen? 1. Interferencias: – Análisis multicomponente, corrección de resultados.

2. Interferencias + Efecto de matriz – Aplicación de la química para separar o enmascarar interferencias.




Parámetros de la validación Selectividad / Especificidad Interferencias y efecto de matriz Ejemplo: interferencias de matriz causadas por el metanol y es ácido sulfúrico en la determinación de cobre Unidade s de absorbancia

Interferencias de matriz en Cu 0,1 0,09 0,08 0,07 0,06 0,05 0,04 0,03 0,02 0,01 0

Unidades de absorbancia metanol Unidades de absorbancia H2SO4

Cu+HNO3 Cu+ H2SO4 Cu+H2SO4 Cu+ H2SO4 Cu+ H2SO4 (1 %) (10 %) (20 %) (40 %) (60 %) Cu+HNO3 (1 %)


Cu+ Metanol

Cu+ Metanol

Cu+ Metanol

Cu+ Metanol


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Ejemplo.•

Se requiere evaluar la confirmación de la identidad (selectividad) de un método para determinar el compuesto A, en presencia de posibles interferencias (I y II), adicionadas a los niveles máximos permitidos por la legislación, en matriz de agua potable. Se tienen los siguientes datos: x1 es la señal de 5 muestras independientes sin fortificar, x2 es la señal de las mismas 5 muestras, fortificadas con la interferencia I (10 mg/L), x3 es la señal de las mismas 5 muestras fortificadas con la interferencia II (25 mg/L).

Muestra

x1

x2

x3

1

0.071031

0.073223

0.06560

2

0.069299

0.086122

0.07960

3

0.071845

0.084155

0.08300

4

0.071442

0.082345

0.07660

5

0.064314

0.066751

0.07870

Ej. Xls. Validación de Métodos Analíticos



Parámetros de la validación Exactitud • Proximidad entre un valor medido y un valor verdadero del mensurando. [VIM 3ra. Edición, 2012]

ü NOTA 1: El concepto exactitud de medida no es un valor numérico dado, si no que se dice que una medida es más exacta cuando ofrece una incertidumbre de medida más pequeña. ü NOTA 2: El término “exactitud de medida” no debe utilizarse en lugar de “veracidad de medida” al igual que el término “precisión de medida” no debe utilizarse en lugar de “exactitud de medida” ya que esta última incluye ambos conceptos.



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Parámetros de la validación Exactitud Resultados de la Medición

Efectos aleatorio

Efectos sistemáticos

Precisión

Veracidad

Proximidad entre las indicaciones o los valores medidos obtenidos en mediciones repetidas de un mismo objeto, o de objetos similares, bajo condiciones especificadas

Proximidad entre la media de un número infinito de valores medidos repetidos y un valor de referencia

Desviación Estándar

SESGO D = m - t

Incertidumbre de la medición Validación de Métodos Analíticos



Parámetros de la validación Referencia rápida

Veracidad

Análisis

No de veces

Cálculos

a) El blanco reactivo y el material referencia usando un método candidato

10

Valor promedio del blanco sustraído del valor promedio del analito del material de referencia.

Comentarios

Sujeto a la incertidumbre del blanco de que sea un blanco verdadero, caracterización del Comparar con el valor verdadero o material de referencia. aceptado para el material de referencia Da una medición del sesgo del método.

Se recomienda la aplicación de las pruebas de hipótesis como soporte estadístico [The Fitness for Purpose of Analytical Methods, Eurachem Guide, LGC, Teddington, 1998] Validación de Métodos Analíticos


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Parámetros de la validación Veracidad

Materiales de referencia

Materiales de Referencia

MR Certificados

MR adicionados MR internos

De matriz natural similar a la muestra de interés Para cumplir con normatividad. Trazabilidad

Con MRC puros Otros materiales de pureza y estabilidad adecuada. Para trabajo no-crítico Caracterizados en el lab. Como control de calidad interna




Parámetros de la validación Ejemplo.-

Veracidad

l Para la evaluación de un nuevo método para la medición de Pb en en tejido vegetal, se utiliza un MRC de matriz similar con un valor certificado para Pb de 1.03 ± 0.05 mg g-1, con un nivel de confianza del 95%. Los resultados obtenidos en el laboratorio son: 0.90, 1.02, 1.08, 1.20, 1.15, 1.08, 1.09 y 1.20 mg de Pb g-1. 1. Calcular el sesgo del nuevo método 2. ¿El valor obtenido aplicando el nuevo método es diferente o igual al valor certificado?



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Parámetros de la validación Referencia rápida b) El blanco reactivo y el material de referencia/ prueba, usando un método candidato y un método independiente (preferentemente primario).

Veracidad

10 Valor promedio del blanco sustraído del valor promedio del analito en el material de referencia/prueba.

El método independiente puede tener su propio sesgo y por consecuencia no se puede tener una Comparar con mediciones similares medición absoluta de la obtenidas con un método exactitud. independiente/ método primario. El método primario Da una medición del sesgo del idealmente no tiene método relativo al método sesgo por lo que es una independiente/ primario. mejor forma de medir la exactitud.





Ejemplo.-

•Se está desarrollando un nuevo método (1) para la medición de nitrógeno proteico en alimentos, para sustituir al método (2). Se aplicaron ambos métodos a diversas materias primas (cubriendo un amplio intervalo de concentraciones) para elaborar alimento para perros, obteniendo los siguientes resultados (g/g): Materia Prima Maíz

Método 1 ± s (n=5) 7.55 ± 0.25

Método 2 ± s (n=3) 7.28 ± 0.09

Cebada

10.54 ± 0.06

10.63 ± 0.08

Chícharos

18.20 ± 0.30

17.89 ± 0.10

Semilla de girasol

25.95 ± 0.47

26.04 ± 0.11

Harina de soya

38.88 ± 0.45

38.73 ± 0.44 51.83 ± 0.25

Harina de carne

51.83 ± 0.59

Harina de pescado

71.55 ± 0.52

71.48 ± 0.21

Alimento p/perros

27.09 ± 0.20

27.05 ± 0.06


1. Existen diferencias significativas entre los resultados obtenidos por los métodos utilizados.


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Parámetros de la validación Regresión lineal.-

Veracidad

• Comparación de la exactitud de dos métodos utilizando regresión lineal. • Graficar los resultados obtenidos por el método de prueba vs. Método de referencia (se utilizan MRC o muestras con diferentes contenidos del analito) • En ausencia de error: b = 1 y a =0. • Permite estimar los tres tipos de error (aleatorio, sistemático proporcional y sistemático constante) Validación de Métodos Analíticos




Veracidad

Caso Ideal

Efecto de error proporcional Validación de Métodos Analíticos

Método exacto con baja precisión

Efecto de error constante Octubre del 2013, Diapositiva 74

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Veracidad

• Para probar que b es significativamente diferente de b=1, se calcula:

t=

b-b 1- r2

n-2

Con n-2 grados de libertad

•Para probar que a es significativamente diferente de a=0, se calcula:

t=

a -a sa2

Con n-2 grados de libertad





Regresión lineal.- Intervalo de confianza de a y b 1

sy x sb =

sy x

ì å ( yi - yˆi ) 2 ü 2 ï ï =í i ý ï ï n-2 þ î

1

ì 2 ü2 íå (xi - x ) ý î i þ I.C. Pendiente: I.C. Confianza ordenada al origen: Validación de Métodos Analíticos

1

ì å xi2 ü2 ï ï i sa = s s y í 2ý ï n å (xi - x ) ï î i þ

b ± tsb

n-2 grados de libertad

a ± tsa Octubre del 2013, Diapositiva 76

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Parámetros de la validación Veracidad Sesgo.- Interpretación Valor medido. Media del laboratorio

VALOR VERDADERO

SESGO TOTAL

Media de Interlaboratorios

Sesgo del laboratorio

Sesgo del método




Parámetros de la validación Precisión

• Proximidad entre las indicaciones o los valores medidos obtenidos en mediciones repetidas de un mismo objeto, o de objetos similares, bajo condiciones especificadas. [VIM 3ª Ed. 2012]

• Principales factores de influencia – – – –

Tiempo Calibración Operador Equipo [ISO 5725-3:1994]



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Parámetros de la validación Precisión / Repetibilidad • Precisión de medida bajo un conjunto de condiciones de repetibilidad de medición [VIM 3ª Ed. 2012]

• Condiciones de repetibilidad (r): 1. Mismo: repetibilidad

– – – –

Operador Equipo Calibración del equipo Tiempo

[ISO 5725-3: 1994]




Parámetros de la validación Precisión / Reproducibilidad • Precisión de medida bajo un conjunto de condiciones de reproducibilidad de medición. [VIM 3ª Ed. 2012] • Condiciones de Reproducibilidad (R):

Laboratorio 1

Reproducibilidad

– Diferente: – – – –

Operador Equipo Calibración del equipo Tiempo


Laboratorio 2 [ISO 5725-3: 1994] Octubre del 2013, Diapositiva 80

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Parámetros de la validación Precisión Intermedia • Precisión de medida bajo un conjunto de condiciones de precisión intermedia de medición. VIM 3ra. Ed.

Precisión intermedia

• Condiciones de precisión intermedia – Al menos uno es diferente: – – – –

Operador Equipo Calibración del equipo Tiempo [ISO 5725-3:1994]




Parámetros de la validación Precisión Intermedia Precisión intermedia

s i = sr2 + se2- Factor 2 2 se2- Factor = sentre grupos - sdentro de grupos



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Parámetros de la validación Precisión iSe expresa en términos de desviación estándar. iEl coeficiente de variación es una forma útil. iTanto la repetibilidad como la reproducibilidad, son dependientes de la concentración del analito. iSi es relevante, debe establecerse la relación entre la precisión y la concentración del analito. Validación de Métodos Analíticos



Parámetros de la validación Referencia rápida Analizar Materiales de referencia o muestras blanco fortificadas a varias concentraciones en el intervalo de trabajo. a) El mismo analista, equipo, en un periodo de tiempo corto. b) Diferentes analistas, equipos, mismo laboratorio, en periodos de tiempo largo. c) Diferentes analistas, equipos, laboratorios, en periodos de tiempo largo.

Repet. independientes

10 10

10

Precisión ¿Qué calcular con los datos ?

Comentarios

Determinar la desviación estándar (s) a cada concentración Determinar la desviación estándar (s) a cada concentración

Determina la desviación estándar de la repetibilidad a cada concentración. Determina la desviación estándar de la precisión intermedia a cada concentración

Determinar la desviación estándar (s) a cada concentración

Determina la desviación estándar de la reproducibilidad a cada concentración Requiere de un estudio de colaboración.



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Parámetros de la validación Precisión n

n

La r y R varían con la concentración. “Requirements for single laboratory validation of chemical methods”.

Niveles aceptables Concentración

Repetibilidad

Reproducibilidad

100 %

1%

2%

10 %

1.5 %

3%

1%

2%

4%

0.1 %

3%

6%

0.01 %

4%

8%

10 mg g-1

6%

11 %

1 mg g-1

8%

16 %

10 mg kg-1

15 %

32 %





Precisión

•Se midió el contenido de Ca (mg/L) en diferentes muestras con contenidos similares. Determinar la precisión (repetibilidad) del método para las 3 matrices ensayadas y comprobar si el método candidato satisface el requisito interno de precisión (CVr< 12 %). Réplica 1 2 3 4 5 6


Agua potable 186 179 169 160 174 196

Muestra, Ca mg/L Agua de mar Agua residual 174 154 196 196 154 170 196 139 170 196 166 179


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Parámetros de la validación Precisión

Ejemplo.-

• Evaluar la precisión intermedia para la matriz de agua potable, variando el factor del tiempo (días), para el método de medición del contenido de Ca. Día

1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 Validación de Métodos Analíticos

Agua potable Réplica 1 Réplica 2 186 179 194 196 196 180 170 179 185 174 196 180 179 186 195 185 175 186 180 189 Octubre del 2013, Diapositiva 87


Parámetros de la validación Incertidumbre de medición

Parámetro no negativo que caracteriza la dispersión de los valores atribuidos a un mensurando, a partir de la información que se utiliza. [VIM 3ª. Edición, 2012] 90 80 70 60 50 40 30 20 10 0



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Parámetros de la validación Incertidumbre de medición Esquema teórico de una medición Mensurando

Resultado sin corregir

Repetibilidad (errores aleatorios)

Corrección (error sistemático)

Valor verdadero Resultado corregido

Incertidumbre: Repetibilidad + otras contribuciones




Parámetros de la validación Incertidumbre de medición Errores aleatorios y sistemáticos en la incertidumbre Error (de una medición) Error sistemático Error sistemático conocido

Corrección

Error sistemático desconocido

Error remanente

Resultado

Incertidumbre Resultado analítico M N


Error aleatorio

Apuntes del curso: Metrología en Química Fina. M. Valcárcel, B. M. Simonet. Octubre del 2013, Diapositiva 90

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Parámetros de la validación Incertidumbre de medición Incertidumbre en un proceso analítico Muestra

PROCESO ANALÍTICO

Resultados

INCERTIDUMBRE de: • Patrones • Material volumétrico • Equipos de medición • Etapas del proceso (dilución, digestión, pesada etc.) • El conjunto del proceso. VALIDACIÓN

Apuntes del curso: Metrología en Química Fina. M. Valcárcel, B. M. Simonet.




Parámetros de la validación Incertidumbre de medición Estimación de la Incertidumbre de medición Mensurando Magnitudes de influencia Cuantificación Valor del mensurando Incertidumbre estándar combinada Incertidumbre expandida Informe

Definir los modelos físicos y matemáticos. Definir y organizar las magnitudes de influencia. Cuantificar magnitudes de influencia y su dispersión. Obtener la mejor estimación del mensurando. Combinar las contribuciones a la incertidumbre del mensurando. Determinar el intervalo que abarca el valor del mensurando con un cierto nivel de confianza. Del resultado de medición, incluyendo su incertidumbre.

Estimación de la incertidumbre de acuerdo a la GUM (procedimiento básico) Validación de Métodos Analíticos


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Parámetros de la validación Robustez n

Es una medida de la capacidad de un método analítico, de permanecer inalterado por pequeñas, pero deliberadas, variaciones en los parámetros del método y proporciona una indicación de su confiabilidad durante su uso normal.

[Guía Técnica sobre trazabilidad e incertidumbre…, CENAM-ema, revisión 01, 2008] Validación de Métodos Analíticos



Parámetros de la validación Referencia rápida Analizar Identificar las variables las cuales pueden tener un efecto significativo en el desempeño del método. Establecer experimentos (analizando materiales de referencia, muestras de composición conocida o certificadas) para observar el efecto sobre la exactitud y la precisión ocasionado por el cambio sistemático de las variables.

Robustez No de veces Analizar una vez cada grupo de condiciones experimentales

Calcular

Comentarios

Determinar el efecto de cada cambio de condiciones sobre la media

Designar el control de calidad para controlar las variables críticas. Concentrarse en estas variables para mejorar el método.

Clasificar las variables en orden de mayor a menor efecto sobre el desempeño del método.



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Parámetros de la validación Robustez Diseño de experimentos

• Diseño factorial completo: consiste de todos los tratamientos posibles formados por dos o más factores (temperatura, presión, analista, etc.), estudiados a dos o más niveles (alto, medio, bajo, etc.). • Ejemplo: un diseño basado en 3 niveles del factor A, 2 niveles del factor B y 4 niveles del factor C. • 3x2x4= 24 experimentos !!!




Parámetros de la validación Robustez

Diseño de experimentos

• Diseño factorial: 2k • Solo se tienen 2 niveles con k factores • 22= 4 experimentos, con réplicas Factor

Combinación de tratamientos

A

B

-

-

a, b

+

-

A, b

-

+

a, B

+

+

A, B


23= 8 24= 16 27= 128


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Parámetros de la validación Robustez Diseño de experimentos • Prueba de Robustez de Youden: Diseño factorial fraccionado, el número de experimentos corresponde al número de factores estudiados + 1. • Ejemplo para estudiar 7 factores, en dos niveles, se requieren 8 experimentos solamente. • Permite obtener una aproximación de la desviación estándar esperada por la variabilidad de los factores que están “bajo control”.




Parámetros de la validación Robustez Diseño de experimentos Exper.

Combinacione s

Medición

a

1

ABCDEFG

x1

B

b

2

ABcDefg

x2

Tiempo

C

c

3

AbCdEfg

x3

Agitación

D

d

4

AbcdeFG

x4

pH

E

e

5

aBCdeFg

x5

Luz

F

f

6

aBcdEfG

x6

Ácido

G

g

7

abCDefG

x7

8

abcDEFg

x8

Factor

V. alto

V. bajo

Temperatura

A

Humedad



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Parámetros de la validación Robustez Diseño de experimentos Para obtener el efecto de cada variable: Efecto de A y a: [(x1+x2+x3+x4)/4]- [(x5+x6+x7+x8)/4]=J Efecto de B y b: [(x1+x2+x5+x6)/4]- [(x3+x4+x7+x8)/4]=K Efecto de C y c: [(x1+x3+x5+x7)/4]- [(x2+x4+x6+x8)/4]=L

. . .

. . .

Efecto de G y g: [(x1+x4+x6+x7)/4]- [(x2+x3+x5+x8)/4]=P Validación de Métodos Analíticos



Parámetros de la validación Ejemplo.n

Robustez

Para evaluar el proceso de extracción en la determinación de un ingrediente activo de un medicamento, se estudiaron los factores señalados en la tabla. Al aplicar el diseño de robustez de Youden, se obtienen los datos siguientes: Factor

Valor alto

Valor bajo

Exper.

Medición (%)

Peso de muestra

A= 1.00 g

a= 0.50 g

x1

1.03

Temperatura de extracción

B= 30 °C

b= 20 °C

x2

1.32

Volumen de disolvente

C= 100 mL

c= 50 mL

x3

1.29

Disolvente

D= alcohol

d= acetona

x4

1.22

Tiempo de extracción

E=60 min

e= 30 min

x5

1.27

Agitación

F=magnética

f= manual

x6

1.17

Irradiación

G= luz

g=obscuro

x7

1.27

x8

1.43



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Robustez

l Obtenga el efecto de cada uno de los factores estudiados. Interprete los resultados

J(A,a)= K(B,b)= L(C,c)= M(D,d)= N(E,e)= O(F,f)= P(G,g)= Q(F,f)= Validación de Métodos Analíticos



Parámetros de la validación Recuperación

• Proporción de la cantidad de analito presente en la porción de la muestra o adicionado a ésta, que es cuantificada por el método de ensayo. [Guía Técnica sobre trazabilidad e incertidumbre…, CENAM-ema, revisión 01, 2008] • La fracción del analito adicionada a una muestra de prueba (muestra fortificada o adicionada) antes del análisis que es determinada efectivamente por el método se calcula como:

%R=

C f - Csf Ca

x 100

Cf es la concentración del analito medida en la muestra fortificada Csf es la concentración del analito medida en la muestra sin fortificar Ca es la concentración del analito adicionada (no medida por el método) en la muestra fortificada. [The Fitness for Purpose of Analytical Methods, Eurachem Guide, LGC, Teddington, 1998] Validación de Métodos Analíticos


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Referencia rápida Analizar

Repet.

¿Qué calcular con los datos ?

Comentarios

Muestras blanco o muestras sin fortificar y fortificadas con el analito de interés en un intervalo de concentraciones

6

Determinar la recuperación del analito a diferentes concentraciones %R=(C1-C2)/C3 X 100 donde, C1 concentración determinada en la muestra fortificada C2 concentración determinada en la muestra sin fortificar C3 concentración de fortificación

Las muestras fortificadas deberán ser comparadas con la misma muestra sin fortificar para asignar la recuperación neta de la fortificación.

Determinar la recuperación del analito relativa al valor certificado

Dependiendo de la forma en que fue producido y caracterizado el MRC, es posible obtener %R>100 %

Materiales de referencia certificados (MRC)

Las recuperaciones calculadas a partir de muestras fortificadas y de muestras blanco, normalmente son mayores que en muestras reales en las que el analito está unido más íntimamente.





n

El nivel aceptable de recuperación está en función de la concentración y el propósito del análisis.

Concentración

Límites de Recuperación

100 %

98 – 102 %

10 %

98 - 102 %

1%

97 – 103 %

0.1 %

95 – 105 %

0.01 %

90 – 107 %

10 mg g-1

80 – 110 %

1 mg g-1

80 - 110 %

10 mg kg


-1

60 - 115 %


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Documentación de métodos validados



Documentación


• Es necesaria para: – Asegurar que el método sea usado en la misma forma en que fue caracterizado. – Auditorias y procesos de acreditación. – Tener evidencia de la consistencia de los datos obtenidos al aplicar un método en diversas ocasiones. Validación de Métodos Analíticos


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Documentación

El laboratorio debe:

þ Registrar los resultados obtenidos þ Registrar el procedimiento utilizado para la validación. þ Declarar sobre la aptitud del método para el uso previsto.




Documentación • Que tipo de información se debe incluir?

– Guías técnicas de la EMA. “Guía técnica sobre trazabilidad e incertidumbre en las mediciones analíticas que emplean las técnicas de espectrofotometría de absorción atómica y de emisión atómica con plasma acoplado inductivamente” • Documentación de soporte de los parámetros caracterizados (validación total o parcial): documentación analítica y registros



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Documentación • Objetivo del estudio – Ej. Validar la característica... – Incluir detalles particulares, aclaraciones.

• Organizar y caracterizar los datos – Ej. Localización de datos. Los datos ... se encuentran en el anexo... y están organizados... – Incluir aspectos particulares, significado de los vectores, matrices, aclaraciones.



Documentación


• Planteamiento – Listado de los pasos del protocolo de ejecución de los estudios. Soporte lógico empleado. – Citar documentos, manuales, etc.

• Exploración de datos – Referencia de los anexos donde se muestren los resultados. – Interpretación. – Justificar, explicar la no realización de algún estudio. Validación de Métodos Analíticos


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Documentación • Gráficos, estadísticos, pruebas – Referencia a los anexos donde se muestren los resultados. – Citar, procedimientos, documentos donde se recomiendan las pruebas y criterios a emplear.

• Informe – – – –

Cálculos e interpretaciones de las pruebas. Decisiones tomadas y razonadas. Consistencia estadística de los resultados. Comentarios y sugerencias del analista.




Bibliografía • • • • • • • • • • • • • • • •

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Validación de Métodos analíticos 4. ANEXOS

















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