Validasi Metode Analisis Metode validasi adalah proses yang digunakan untuk mengkonfirmasi bahwa prosedur analitis digunakan untuk tes tertentu cocok untuk digunakan. Hasil dari validasi metode dapat digunakan untuk menilai kualitas, keandalan dan konsistensi dari hasil analisis, melainkan merupakan bagian integral dari setiap praktek analitis yang baik. metode Analytical perlu divalidasi atau revalidated a.
sebelum diperkenalkan ke dalam penggunaan rutin;
b.
setiap kali perubahan kondisi untuk metode mana yang telah divalidasi
(misalnya, instrumen dengan karakteristik yang berbeda atau sampel yang berbeda dengan matriks) c.
kapan metode ini berubah dan perubahan di luar lingkup asli metode ini.
Metode validasi telah menerima perhatian yang cukup besar dalam literatur dan dari komite industri dan badan pengatur. a.
The US FDA cGMP permintaan di bagian metode yang akan divalidasi:
Ketelitian, sensitivitas, spesifisitas, dan reproduksibilitas metode pengujian yang digunakan oleh perusahaan harus dibuat dan didokumentasikan. validasi semacam itu dan dokumentasi dapat dicapai sesuai persyaratan-persyaratan termasuk pernyataan dari setiap metode yang digunakan dalam pengujian sampel yang tepat untuk memenuhi standar akurasi dan reliabilitas, sebagaimana yang diterapkan untuk produk diuji. FDA Amerika juga mengusulkan bimbingan industri untuk Analitik Prosedur dan Metode Validasi. b.
ISO / IEC 17025 mencakup sebuah bab tentang validasi metode dengan daftar
sembilan parameter validasi. The ICH telah mengembangkan teks validasi konsensus mengenai prosedur analitis. Dokumen tersebut mencakup definisi untuk delapan karakteristik validasi. ICH juga mengembangkan pedoman dengan metodologi rinci . c.
US EPA dipersiapkan untuk menjadi pedoman pembangunan dan validasi
metode untuk Konservasi Sumber Daya dan Recovery Act (RCRA). The
AOAC, EPA dan organisasi ilmiah lain memberikan metode yang disahkan melalui studi multi-laboratorium. USP telah menerbitkan pedoman khusus untuk validasi metode untuk evaluasi senyawa. USP mendefinisikan delapan langkah untuk validasi: a.
Ketepatan
b.
Ketelitian
c.
Kekhususan
d.
Batas deteksi
e.
Batas kuantisasi
f.
Linieritas dan jangkauan
g.
Kekasaran
h.
Kesegaran
FDA juga telah menerbitkan petunjuk untuk validasi metode bioanalytical. Dokumen paling komprehensif adalah laporan konferensi konferensi Washington 1990:
Validasi
Metode
Analitik:
Bioekuivalensi dan Bioavailabilitas,
Farmakokinetika Studi, yang disponsori oleh, antara lain, Asosiasi Amerika untuk ilmuwan Farmasi (AAPS), yang AOAC dan FDA Amerika Serikat. Laporan ini menyajikan prinsip untuk memvalidasi studi tentang manusia dan hewan subyek keduanya. Laporan ini juga telah digunakan sebagai dasar untuk dokumen industri bimbingan FDA. Perwakilan dari industri farmasi dan kimia telah menerbitkan makalah di validasi metode analisis. Hokanson menerapkan pendekatan siklus hidup, yang dikembangkan untuk sistem komputerisasi, untuk validasi dan revalidation metode. Green memberikan panduan praktis untuk validasi metode analisis, dengan deskripsi dari serangkaian persyaratan minimum untuk suatu metode. Renger dan rekanrekannya menggambarkan validasi prosedur analitis khusus untuk analisis tablet teofilin dalam menggunakan performa tinggi kromatografi lapisan tipis (HPTLC). Prosedur validasi dalam artikel ini khusus didasarkan pada persyaratan untuk pendaftaran multistate Uni Eropa.
Wegscheider telah menerbitkan prosedur untuk validasi metode dengan fokus khusus pada kalibrasi, eksperimen pemulihan, metode perbandingan dan penyelidikan kekasaran. AOAC telah mengembangkan program-Verified Metode validasi rekan dengan panduan lengkap tentang hal apa yang parameter harus divalidasi. Winslow dan Meyer merekomendasikan definisi dan penerapan rencana induk untuk validasi metode analisis. J. Breaux dan rekan telah menerbitkan sebuah studi pada pengembangan metode analisis dan validasi. Titik kunci adalah untuk mengembangkan metode untuk validasi mudah dan revalidation. O. Krause menerbitkan sebuah panduan untuk transfer metode analitis, komparatif, pemeliharaan dan kriteria penerimaan untuk pengujian biopharmaceuticals. Pelajaran ini memberikan review dan strategi untuk validasi metode analisis untuk kedua metode yang dikembangkan in-house serta metode standar, dan rekomendasi mengenai dokumentasi yang harus dihasilkan selama, dan pada saat penyelesaian, validasi metode. Hal ini juga menjelaskan apa yang penting ketika mentransfer sebuah metode. Validitas dari metode spesifik harus ditunjukkan dalam percobaan laboratorium menggunakan contoh atau standar yang mirip dengan sampel yang tidak diketahui dianalisis secara rutin. Penyusunan dan pelaksanaan harus mengikuti protokol validasi,
sebaiknya ditulis
dalam
instruksi langkah
demi
langkah
format.Kemungkinan langkah-langkah untuk validasi metode lengkap yang tercantum dalam Tabel 1. Prosedur yang diusulkan ini mengasumsikan bahwa instrumen tersebut telah dipilih dan metode telah dikembangkan. Hal ini memenuhi kriteria seperti kemudahan penggunaan, kemampuan untuk menjadi otomatis dan dikendalikan oleh sistem komputer; biaya per analisa; throughput sampel; waktu penyelesaian, dan lingkungan, kesehatan dan keselamatan. 1. Mengembangkan protokol validasi, sebuah prosedur operasi atau rencana validasi master untuk validasi 2. Untuk proyek validasi spesifik mendefinisikan dan tanggung jawab pemilik 3. Mengembangkan rencana proyek validasi 4. Tentukan aplikasi, tujuan dan ruang lingkup metode
5. Tentukan parameter kinerja dan kriteria penerimaan 6. Tentukan validasi eksperimen 7. Verifikasi karakteristik kinerja peralatan yang relevan 8. Kualifikasi bahan, misalnya standar dan reagen untuk kemurnian, jumlah yang cukup akurat dan stabilitas 9. Melakukan percobaan pra-validasi 10. Sesuaikan parameter metode atau / dan kriteria penerimaan jika perlu 11. Melakukan penuh internal (dan eksternal) eksperimen validasi 12. Mengembangkan SOP untuk melaksanakan metode ini dalam rutinitas 13. Tentukan kriteria untuk revalidation 14. Menetapkan jenis dan frekuensi uji kesesuaian sistem dan / atau pengendalian mutu analitis (AQC) cek untuk rutin 15. Dokumen validasi eksperimen dan hasil dalam laporan validasi Keberhasilan penerimaan parameter validasi dan kriteria kinerja, oleh semua pihak yang terlibat, membutuhkan upaya kerjasama dari beberapa departemen, termasuk pengembangan analitis, QC, urusan peraturan dan individu yang membutuhkan data analitis. Prosedur operasi atau Validasi Master Plan (VMP) harus secara jelas mendefinisikan peran dan tanggung jawab masing-masing departemen yang terlibat dalam validasi metode analisis. Ruang lingkup metode dan kriteria validasi yang harus didefinisikan pada awal proses. Ini termasuk pertanyaan-pertanyaan berikut: a.
Apa analit harus terdeteksi?
b.
Apa tingkat konsentrasi yang diharapkan?
c.
Apakah matriks sampel?
d.
Apakah ada zat campuran yang diharapkan, dan jika demikian, zat campuran
tersebut harus dideteksi dan dihitung? e.
Apakah ada peraturan khusus legislatif atau persyaratan?
f.
Secara kualitatif atau kuantitatif?
g.
Apa saja yang diperlukan deteksi dan batas kuantisasi?
h.
Berapa kisaran konsentrasi yang diharapkan?
i.
Apa yang presisi dan akurasi diharapkan?
j.
Bagaimana metode yang sesuai?
k.
Jenis peralatan yang harus digunakan? Apakah metode untuk satu instrumen
tertentu, atau seharusnya itu digunakan oleh semua instrumen dari jenis yang sama? l.
Apakah metode yang digunakan dalam satu laboratorium khusus atau
seharusnya itu bisa diterapkan di semua laboratorium di satu sisi atau seluruh dunia? m. Keterampilan apa yang telah diantisipasi pengguna metode ini?
Karakteristik performa Metode harus didasarkan pada tujuan penggunaan metode ini. Hal ini tidak selalu diperlukan untuk memvalidasi semua parameter analitik yang tersedia untuk teknik tertentu. Sebagai contoh, jika metode ini digunakan untuk melacak tingkat analisis kualitatif, tidak perlu untuk menguji dan memvalidasi metode yang membatasi kuantisasi, atau linieritas, selama rentang dinamis penuh peralatan. Parameter awal harus dipilih menurut analis pengalaman dan penilaian terbaik. Final parameter harus disepakati antara lab atau ahli kimia analitis melakukan validasi dan laboratorium atau individu menerapkan metode dan pengguna data yang akan dihasilkan oleh metode ini. Tabel 2 memberikan contoh yang mungkin parameter diuji untuk tugas analisis tertentu. Ruang lingkup metode ini juga harus mencakup berbagai jenis peralatan dan lokasi di mana metode yang akan dijalankan. Sebagai contoh, jika metode ini akan dijalankan pada instrumen tertentu dalam suatu laboratorium khusus, tidak perlu menggunakan instrumen dari vendor lain atau untuk memasukkan laboratorium lain pada percobaan validasi. Dengan cara ini, eksperimen dapat terbatas pada apa yang benar-benar diperlukan.
Mayor
Mayor senyawa
senyawa
dan jejak
Jejak
Jejak
kuantitatif
kuantitatif
kualitatif
kualitatif
batas deteksi tidak
Tidak
Ya
tidak
batas
tidak
Ya
Tidak
ya
linieritas
ya
Ya
Tidak
ya
jarak
ya
Ya
Tidak
tidak
ketelitian
ya
Ya
Tidak
ya
ketepatan
ya
Ya
Tidak
ya
kekhususan ya
Ya
Ya
ya
kekasaran
Ya
Tidak
mungkin
kuantisasi
ya
Tabel 2. Validasi parameter untuk tugas-tugas tertentu Percobaan validasi harus dilakukan oleh seorang analis yang berpengalaman untuk menghindari kesalahan karena kurangnya pengalaman. Analis harus sangat berpengalaman dalam teknik dan operasi dari instrumen. Sebelum instrumen digunakan untuk memvalidasi metode, spesifikasi kinerjanya harus diverifikasi menggunakan standar kimia generik. Memuaskan hasil untuk metode dapat diperoleh hanya dengan peralatan yang berkinerja baik. Perhatian khusus harus diberikan kepada mereka karakteristik peralatan yang penting untuk metode ini.Misalnya, jika batas deteksi adalah penting untuk suatu metode khusus, instrumen yang spesifikasi untuk kebisingan dasar dan, untuk detektor tertentu, respon terhadap senyawa tertentu harus diverifikasi. Setiap bahan kimia yang digunakan untuk menentukan parameter validasi yang penting, seperti reagen standar referensi dan, harus
1. tersedia dalam jumlah yang cukup, 2. diidentifikasi secara akurat, 3. cukup stabil dan 4. diperiksa untuk komposisi yang tepat dan kemurnian. Setiap bahan lainnya dan bahan habis pakai, misalnya, kromatografi kolom, harus baru dan memenuhi syarat untuk memenuhi kriteria performa kolom. Hal ini memastikan bahwa satu set bahan baku dapat digunakan untuk eksperimen yang paling dan menghindari kejutan yang tidak menyenangkan selama validasi metode. Operator harus cukup akrab dengan teknik dan peralatan. Ini akan memungkinkan mereka untuk mengidentifikasi dan mendiagnosa masalah tak terduga lebih mudah dan untuk menjalankan seluruh proses secara lebih efisien. Jika ada sedikit atau tidak ada informasi tentang karakteristik performa metode, dianjurkan untuk membuktikan kesesuaian metode untuk digunakan dalam eksperimen awal. Studi-studi ini harus mencakup perkiraan presisi, bekerja jangkauan dan batas deteksi. Jika muncul validasi data awal tidak sesuai, metode itu sendiri, peralatan, teknik analisis atau batas penerimaan harus diubah. Metode pengembangan dan validasi Oleh karena itu, proses berulang-ulang. Sebagai contoh, pada kromatografi cair, selektivitas dicapai melalui pemilihan komposisi fase gerak. Untuk pengukuran kuantitatif, faktor resolusi antara dua puncak harus 2,5 atau lebih tinggi. Jika nilai ini tidak tercapai, komposisi fase gerak membutuhkan optimasi lebih lanjut. Pengaruh parameter operasi terhadap kinerja metode harus dinilai pada tahap ini jika hal ini tidak dilakukan selama pengembangan dan optimasi metode ini. Tidak ada panduan resmi pada urutan yang benar eksperimen validasi, dan urutan yang optimal tergantung pada metode itu sendiri. Berdasarkan pengalaman penulis, untuk metode kromatografi cair, urutan berikut telah terbukti sangat berguna: 1. Selektivitas standar (pemisahan mengoptimalkan dan deteksi selektivitas campuran standar jika tidak mencukupi) 2. Linieritas, batas kuantisasi, batas deteksi, rentang 3. Pengulangan (presisi jangka pendek) dari waktu retensi dan daerah puncak 4. Intermediate presisi
5. Selektivitas dengan sampel nyata 6. Trueness / akurasi pada konsentrasi yang berbeda 7. Ketidakrataan (studi interlaboratory) Percobaan yang memakan waktu lebih, seperti akurasi dan kekerasan, termasuk menuju akhir. Dapat diukur dalam eksperimen gabungan. Sebagai contoh, ketika presisi kawasan puncak diukur selama rentang konsentrasi penuh, data dapat digunakan untuk memvalidasi linieritas tersebut. Selama validasi metode, parameter batas penerimaan, dan frekuensi uji kesesuaian sistem yang sedang berlangsung atau cek QC harus didefinisikan.Kriteria harus didefinisikan untuk menunjukkan bila metode dan sistem berada di luar kendali statistik. Tujuannya adalah untuk mengoptimalkan eksperimen ini sehingga, dengan jumlah minimum analisis kontrol, metode dan sistem analitis lengkap akan memberikan hasil jangka panjang untuk memenuhi tujuan yang didefinisikan dalam ruang lingkup metode ini. Setelah metode ini telah dikembangkan dan divalidasi, laporan validasi yang harus disiapkan adalah sebagai berikut: a.
Tujuan dan ruang lingkup metode (diterapkan, tipe).
b.
Ringkasan metodologi.
c.
Jenis senyawa dan matriks.
d.
Semua bahan kimia, reagen, standar acuan, QC sampel dengan kemurnian,
kelas, sumber atau petunjuk rinci tentang persiapan mereka. e.
Prosedur pemeriksaan kualitas standar dan bahan kimia yang digunakan.
f.
Keamanan tindakan pencegahan.
g.
Rencana dan prosedur untuk metoda pelaksanaan dari laboratorium
pengembangan metode untuk analisis rutin. h.
Metode parameter.
i.
Parameter kritis diambil dari pengujian ketahanan.
j.
Daftar peralatan dan fungsional dan kinerja, persyaratan misalnya perusahaan,
dimensi sel, kebisingan dan suhu rentang awal kolom. Untuk peralatan yang kompleks, gambar atau diagram skematik dapat berguna.
k.
Kondisi rinci tentang bagaimana percobaan dilakukan, termasuk persiapan
sampel. Laporan tersebut harus cukup rinci untuk memastikan bahwa itu bisa direproduksi oleh teknisi kompeten dengan peralatan yang sebanding. l.
Prosedur dan perhitungan statistik representatif.
m. Prosedur QC dalam analisis rutin, misalnya, sistem tes kesesuaian. n.
Perwakilan plot, misalnya, kromatogram, spektra dan kurva kalibrasi.
o.
Metode batas kinerja penerimaan data.
p.
Ketidakpastian yang diharapkan dari hasil pengukuran.
q.
Kriteria untuk revalidation.
r.
Orang (s) yang dikembangkan dan divalidasi metode ini.
s.
Referensi (jika ada).
t.
Ringkasan dan kesimpulan.
u.
Persetujuan dengan nama, judul, tanggal dan tanda tangan dari mereka yang
bertanggung jawab untuk meninjau dan persetujuan dari prosedur tes analitis. Verifikasi Metode Standar
Sebuah laboratorium menerapkan metode spesifik harus telah mendokumentasikan bukti bahwa metode tersebut telah tepat divalidasi. Ini berlaku untuk metode yang dikembangkan di-rumah, serta untuk metode standar, misalnya, yang dikembangkan oleh organisasi-organisasi seperti EPA, American Society for Testing dan Material (ASTM), ISO atau USP. Sejumlah pertanyaan biasanya timbul tentang validasi metode standar: Pertama, metode ini harus menjadi pengguna revalidated di laboratorium dan, jika demikian, harus revalidation metode mencakup semua percobaan, seperti yang dilakukan selama validasi awal? Kedua, yang dokumentasi harus tersedia atau dikembangkan in-house untuk metode standar? pedoman peraturan resmi dan tidak eksplisit tentang validasi metode standar. Hanya CITAC / Pedoman EURACHEM (19) termasuk sebuah ayat pendek yang berbunyi sebagai berikut: Validasi atau bersama-sama diuji metode standar tidak boleh diambil begitu saja, tak peduli betapa sempurna metode's silsilah - laboratorium harus memenuhi
persyaratan bahwa tingkat validasi metode tertentu adalah cukup untuk tujuan yang diperlukan, dan bahwa laboratorium itu sendiri dapat mencocokkan data kinerja lain. Ada dua persyaratan penting dalam kutipan ini: 1. Metode standar's validasi data yang memadai dan cukup untuk memenuhi persyaratan's metode laboratorium. 2. laboratorium harus dapat mencocokkan data performa seperti yang dijelaskan dalam standar. Hasil harus didokumentasikan dalam protokol validasi. Kedua dokumen akan menjadi sumber utama untuk laporan validasi.
Revalidation
Kemungkinan besar beberapa parameter metode harus diubah atau disesuaikan selama hidup metode jika metode kriteria kinerja berada di luar kriteria penerimaan mereka. Revalidation juga diperlukan jika ruang lingkup metode telah berubah atau
diperpanjang, misalnya, jika sampel perubahan operasi matriks atau jika kondisi berubah. Selanjutnya, revalidation diperlukan jika dimaksudkan untuk menggunakan instrumen dengan karakteristik yang berbeda, dan karakteristik baru ini belum tercakup dalam validasi awal. Sebagai contoh, metode KCKT mungkin telah dikembangkan dan divalidasi pada pompa dengan volume delay 5 mL, tetapi pompa baru memiliki volume keterlambatan hanya 0,5 mL.
Gambar 3. Flow diagram untuk revalidation Bagian atau revalidation lengkap juga dapat dipertimbangkan jika tes kesesuaian sistem, atau hasil analisis sampel QC, terletak di luar kriteria penerimaan preset dan di mana sumber kesalahan tidak bisa dilacak kembali ke instrumen atau penyebab lainnya.
Setiap kali ada perubahan yang mungkin memerlukan revalidation sebagian atau penuh, perubahan itu harus mengikuti perubahan sistem kontrol didokumentasikan. Diagram aliran proses tersebut didokumentasikan dalam Gambar 3. Perubahan ini harus didefinisikan, berwenang untuk implementasi dan didokumentasikan. Kemungkinan perubahan mungkin termasuk a. sampel baru dengan senyawa baru atau matriks baru, b. analis baru dengan keahlian yang berbeda, c. instrumen baru dengan karakteristik yang berbeda, d. Lokasi baru dengan kondisi lingkungan yang berbeda, e. baru bahan kimia dan / atau referensi standar dan f. modifikasi parameter analitik.
Sebuah evaluasi harus menentukan apakah perubahan tersebut adalah dalam lingkup metode ini. Jika demikian, revalidation tidak diperlukan. Jika perubahan yang terletak di luar ruang lingkup, parameter untuk revalidation harus didefinisikan. Setelah percobaan validasi, uji kesesuaian parameter sistem harus diselidiki dan merumuskan kembali, jika perlu. Parameter untuk Validasi Metode
Parameter untuk validasi metode telah ditetapkan dalam kelompok kerja yang berbeda dari komite nasional dan internasional dan dijelaskan dalam literatur.Sayangnya, beberapa definisi bervariasi antara organisasi yang berbeda. Sebuah upaya harmonisasi dibuat untuk aplikasi farmasi melalui ICH, di mana perwakilan dari industri dan lembaga regulator dari Amerika Serikat, Eropa dan Jepang batasan tertentu, persyaratan dan, sampai taraf tertentu, metodologi untuk validasi metode analisis. Parameter, seperti yang didefinisikan oleh ICH dan dengan organisasi lain dan penulis, diringkas dalam Tabel 3 dan dijelaskan secara singkat dalam paragraf berikut. Selektivitas / Spesifisitas
Istilah selektivitas dan spesifisitas sering digunakan secara bergantian. Sebuah diskusi rinci tentang istilah ini, sebagaimana didefinisikan oleh organisasi yang berbeda, telah disajikan oleh Vessmann. Ia terutama menunjukkan perbedaan antara definisi kekhususan yang diberikan oleh IUPAC / WELAC dan ICH. Meskipun tidak konsisten dengan ICH, istilah yang spesifik umumnya mengacu pada metode yang menghasilkan respons untuk analit hanya satu, sedangkan istilah selektif merujuk pada metode yang memberikan tanggapan untuk sejumlah entitas kimia yang mungkin atau mungkin tidak dibedakan satu sama lain. Jika respon dibedakan dari semua tanggapan lainnya, metode ini dikatakan selektif.Karena terdapat beberapa metode yang sangat yang menanggapi hanya satu analit, istilah selektivitas biasanya lebih tepat. USP monografi mendefinisikan selektivitas suatu metode analisis sebagai kemampuan untuk mengukur secara akurat suatu analit dalam kehadiran gangguan, seperti prekursor sintetik, eksipien, enantiomer dan dikenal (atau mungkin) degradasi produk yang dapat diharapkan untuk hadir dalam matrik sampel. Selektivitas dalam kromatografi cair diperoleh dengan memilih kolom optimal dan pengaturan kondisi kromatografi, seperti komposisi fase gerak, kolom suhu dan panjang gelombang detektor. Selain pemisahan kromatografi, langkah persiapan sampel juga dapat dioptimalkan untuk terbaik selektivitas. Ini adalah tugas yang sulit dalam kromatografi untuk memastikan apakah puncak dalam kromatogram sampel murni atau terdiri dari lebih dari satu senyawa. Oleh karena itu, analis harus mengetahui berapa banyak senyawa dalam sampel atau apakah prosedur untuk mendeteksi puncak murni harus digunakan. Sedangkan pada parameter kromatografi masa lalu seperti komposisi fase gerak atau kolom yang telah diubah, sekarang aplikasi detektor spektroskopi digabungkan on-line untuk kromatograf sedang digunakan. UV / terlihat dioda-array detektor dan spektrometer massa
memperoleh
spektrum
on-linesepanjang seluruh
kromatogram. Spektrum diperoleh pada saat puncak elusi dinormalisasi dan disalut untuk presentasi grafis. Jika spektrum normal berbeda, puncak terdiri dari paling sedikit dua senyawa.
Prinsip-array deteksi dioda dalam HPLC dan aplikasi mereka dan batasan yang berkaitan dengan puncak kemurnian dijelaskan dalam literature. Contoh murni HPLC puncak dan murni diperlihatkan pada Gambar 4. Sementara sinyal kromatografi menunjukkan tidak ada kotoran di puncak baik, evaluasi spektral mengidentifikasi puncak di sebelah kiri sebagai murni. Tingkat kotoran yang dapat dideteksi dengan metode ini tergantung pada perbedaan spektral, pada detektor performa dan pada algoritma perangkat lunak. Dalam kondisi ideal, puncak pengotor sebesar 0.05 0,1 persen dapat dideteksi. Studi Selektivitas juga harus menilai gangguan yang mungkin disebabkan oleh matriks, misalnya, urin, darah, tanah, air atau persiapan makanan. sampel Optimized dapat menghilangkan sebagian besar komponen matriks. Tidak adanya gangguan matriks untuk metode kuantitatif harus dibuktikan oleh analisis setidaknya lima sumber independen kontrol matriks.
Gambar 4. Contoh murni HPLC puncak dan murni. Sinyal kromatografi tidak menunjukkan adanya kotoran dalam puncak baik. evaluasi spektral Namun, mengidentifikasi puncak di sebelah kiri sebagai murni. Precision dan Reprodusibilitas
Ketepatan metode (Tabel 4) adalah sejauh mana hasil uji individu suntikan beberapa dari serangkaian standar setuju. Standar deviasi diukur dapat dibagi menjadi 3 kategori: pengulangan, presisi intermediate dan reproduksibilitas. Pengulangan didapat bila analisis dilakukan di laboratorium oleh seorang operator dengan menggunakan suatu peralatan dalam waktu yang relatif jangka pendek.Setidaknya 6 penentuan dari 3 matriks yang berbeda pada 3 konsentrasi yang berbeda atau 2 harus dilakukan, dan RSD dihitung. The ICH membutuhkan presisi dari setidaknya 6 ulangan yang akan diukur pada 100 persen dari target konsentrasi tes atau dari minimal 9 ulangan meliputi kisaran tertentu lengkap. Contohnya, hasilnya dapat diperoleh di 3 konsentrasi dengan 3 suntikan pada konsentrasi masing-masing. kriteria penerimaan ini untuk presisi sangat tergantung pada jenis analisis. Farmasi presisi QC yang lebih besar dari 1 persen RSD mudah dicapai untuk analisis senyawa, tapi presisi untuk cuplikan biologi lebih seperti 15 persen di batas konsentrasi dan 10 persen pada tingkat konsentrasi yang lain. Untuk lingkungan dan sampel makanan, presisi sebagian besar tergantung pada sampel matriks, konsentrasi analit, kinerja alat dan teknik analisis. Intermediate presisi adalah istilah yang telah didefinisikan oleh ICH sebagai variabilitas jangka panjang dari proses pengukuran. Hal ini ditentukan dengan membandingkan hasil dari metode dijalankan dalam sebuah laboratorium tunggal selama beberapa minggu. yang presisi antara metode A mungkin mencerminkan perbedaan dalam hasil yang diperoleh a.
dari operator yang berbeda,
b.
dari praktek kerja yang tidak konsisten (ketelitian) dari operator yang sama,
c.
dari instrumen yang berbeda,
d.
dengan standar dan reagen dari pemasok yang berbeda,
e.
dengan kolom dari batch yang berbeda atau
f.
kombinasi ini.
Analit%
Rasio analit
Satuan
RSD%
100
1
100%
1,3
10
10
10%
2,8
1
10-2
1%
2,7
0,1
10-3
0,1%
3,7
0,01
10-4
100 ppm
5,3
0,001
10-5
10 ppm
7,3
0,0001
10-6
1 ppm
11
0,00001
10-7
100 ppb
15
0.000001
10-8
10 ppb
21
0.0000001
10-9
1 ppb
30
-1
Tabel 4. Versus konsentrasi analit presisi (Ref. 15) Tujuan validasi presisi menengah adalah untuk memastikan bahwa di laboratorium metode yang sama akan memberikan hasil yang sama sekali tahap pengembangan selesai. Reproducibility (Tabel 5), seperti yang didefinisikan oleh ICH, merupakan presisi diperoleh antara laboratorium yang berbeda. Tujuannya adalah untuk memastikan bahwa metode ini akan memberikan hasil yang sama di laboratorium yang berbeda. Reproducibility dari metode analisis ditentukan dengan menganalisis aliquots dari banyak homogen di laboratorium yang berbeda dengan analis berbeda, dan dengan menggunakan dan lingkungan kondisi operasional yang mungkin berbeda dari, tapi masih dalam, parameter tertentu dari metode (tes interlaboratory). Validasi reproduksibilitas adalah penting jika metode ini untuk digunakan di laboratorium yang berbeda. a.
Perbedaan pada suhu kamar dan kelembaban
b.
Operator dengan pengalaman yang berbeda dan ketelitian
c.
Peralatan dengan karakteristik yang berbeda, misalnya volume penundaan
sistem HPLC d.
Variasi material dan kondisi instrumen, misalnya dalam HPLC, mobile
komposisi fase, pH, laju alir fasa gerak e.
Variasi rincian eksperimental tidak ditentukan oleh metode
f.
Peralatan dan bahan habis pakai dari usia yang berbeda
g.
Kolom dari pemasok yang berbeda atau berbeda batch
h.
Pelarut, reagen dan bahan lain dengan berbagai kualitas
Akurasi
Keakuratan suatu metode analisis adalah sejauh mana hasil tes yang dihasilkan oleh metode dan nilai yang benar setuju. Keakuratan juga dapat digambarkan sebagai kedekatan perjanjian antara nilai yang diadopsi, baik sebagai atau, diterima referensi nilai sebenarnya konvensional, dan nilai ditemukan. Nilai yang benar untuk penilaian akurasi dapat diperoleh dengan beberapa cara.Salah satu alternatifnya adalah untuk membandingkan hasil metode dengan hasil dari metode referensi ditetapkan. Pendekatan ini mengasumsikan bahwa ketidakpastian metode referensi diketahui. Kedua, akurasi dapat dinilai dengan menganalisis sampel dengan konsentrasi yang dikenal (misalnya, sebuah sampel kontrol atau bahan referensi bersertifikat) dan membandingkan nilai yang diukur dengan nilai yang benar sebagai yang disertakan dengan bahan tersebut. Jika bahan referensi bersertifikat atau sampel kontrol tidak tersedia, sampel kosong matriks dapat bunga berduri dengan konsentrasi dikenal dengan berat atau volume. Setelah ekstraksi dari analit dari matriks dan injeksi ke dalam instrumen analitis, pemulihan nya dapat ditentukan dengan cara membandingkan respon ekstrak dengan tanggapan mengenai materi referensi dilarutkan dalam pelarut yang murni. Karena penilaian ini akurasi mengukur efektivitas persiapan sampel, perawatan harus dilakukan untuk meniru persiapan sampel aktual sedekat mungkin. Jika divalidasi dengan benar,
faktor pemulihan dihitung untuk konsentrasi yang berbeda dapat digunakan untuk memperbaiki hasil akhir. Konsentrasi harus mencakup rentang perhatian dan harus mencakup konsentrasi mendekati batas kuantisasi, satu di tengah jangkauan dan satu di akhir yang tinggi dari kurva kalibrasi. Pendekatan lain adalah dengan menggunakan nilai keputusan penting sebagai titik konsentrasi yang harus menjadi titik akurasi terbesar. Dokumen ICH pada metodologi merekomendasikan akurasi validasi akan dinilai menggunakan minimal sembilan penentuan selama minimal tiga tingkat konsentrasi yang mencakup kisaran tertentu (misalnya, tiga konsentrasi / masingmasing diulang tiga kali). Akurasi harus dilaporkan sebagai pemulihan persen pada uji jumlah ditambahkan dikenal analit dalam sampel atau sebagai perbedaan antara mean dan nilai sebenarnya diterima, bersama-sama dengan interval keyakinan. Linieritas dan Kurva Kalibrasi
Linieritas suatu metode analisis adalah kemampuannya untuk memperoleh hasil tes yang secara langsung proporsional terhadap konsentrasi analit dalam sampel dalam jarak tertentu atau proporsional dengan cara transformasi matematika didefinisikan-baik. Linieritas bisa ditunjukkan secara langsung pada substansi uji (dengan pengenceran dari larutan stok standar) dan / atau dengan menggunakan penimbangan terpisah dari campuran sintetis produk komponen pengujian, menggunakan prosedur yang diusulkan. Linearitas ditentukan oleh serangkaian 3 sampai 6 suntikan dari 5 atau lebih standar yang konsentrasi span 80-120 persen dari rentang konsentrasi yang diharapkan. Tanggapan harus berbanding lurus dengan konsentrasi dari analit atau proporsional dengan cara perhitungan matematika yang ditetapkan-baik.Sebuah persamaan regresi linier diterapkan pada hasil harus memiliki sebuah mencegat tidak berbeda dari 0. Jika mencegat nol signifikan diperoleh, harus menunjukkan bahwa hal ini tidak berpengaruh pada keakuratan metode ini. Pendekatan lain adalah data sinyal bagi dengan konsentrasi masing-masing, menghasilkan respon relatif. grafik adalah diplot dengan tanggapan relatif pada
sumbu y dan konsentrasi yang sesuai pada sumbu x-, pada skala log. Garis horizontal yang diperoleh harus selama rentang linier penuh. Pada konsentrasi yang lebih tinggi, biasanya akan ada deviasi negatif dari linieritas. garis horisontal paralel ditarik pada grafik yang berhubungan dengan, misalnya, 95 persen dan 105 persen dari garis horizontal. Metode ini linier sampai ke titik di mana garis merencanakan respon relatif memotong garis 95 persen HPLC. Gambar 5 menunjukkan perbandingan grafis dua evaluasi pada sampel menggunakan kafein. ICH merekomendasikan, untuk pelaporan akurasi, linieritas kurva koefisien korelasi, y-intercept, kemiringan garis regresi dan jumlah kuadrat sisa. Selain itu, analisis deviasi titik data aktual dari garis regresi juga dapat membantu untuk mengevaluasi linearitas. Beberapa prosedur analitis, seperti immunoassays, tidak menunjukkan linieritas setelah transformasi ada). Ini Dalam kasus ini, analitis respon harus dijelaskan dengan tepat fungsi dari konsentrasi (jumlah dari analit dalam contoh. Dalam rangka membangun linieritas, minimal lima konsentrasi dianjurkan. pendekatan lain harus dibenarkan.
Gambar 5. Presentasi grafis plot linieritas sampel kafein menggunakan HPLC.
Jarak
Kisaran suatu metode analisis adalah interval antara bagian atas dan tingkat bawah (termasuk tingkat-tingkat) yang telah menunjukkan akan ditentukan dengan presisi, akurasi dan linearitas menggunakan metode seperti yang tertulis. Rentang ini biasanya dinyatakan dalam satuan yang sama dengan hasil uji (misalnya, persentase, bagian per juta) yang diperoleh dengan metode analitik. Untuk tes uji, yang ICH memerlukan rentang minimum spesifikasi untuk menjadi 80-120 persen dari konsentrasi uji, dan untuk penentuan suatu kenajisan, untuk memperluas jangkauan dari batas kuantisasi, atau dari 50 persen dari spesifikasi setiap kenajisan, mana yang lebih besar, sampai 120 persen dari spesifikasi.
Gambar 6. Definisi untuk linearitas, jangkauan, LOQ, LOD Limit Deteksi
Batas deteksi adalah titik di mana suatu nilai yang terukur lebih besar dari ketidakpastian yang terkait dengannya. Ini adalah konsentrasi terendah dari analit dalam suatu sampel yang dapat dideteksi namun tidak selalu diukur. Batas deteksi sering bingung dengan sensitivitas dari metode ini. Sensitivitas dari metode analisis adalah kemampuan metode ini untuk membedakan perbedaan-perbedaan kecil
konsentrasi atau massa analit uji. Dalam istilah praktis, sensitivitas kemiringan kurva kalibrasi yang diperoleh dengan merencanakan respons terhadap konsentrasi analit atau massa. Pada kromatografi, batas deteksi adalah jumlah injeksi yang menghasilkan puncak dengan ketinggian minimal dua atau tiga kali lebih tinggi tingkat kebisingan baseline. Selain itu sinyal / kebisingan metode, yang ICH menjelaskan tiga metode lebih lanjut: 1. Inspeksi visual: Batas deteksi ditentukan oleh analisis sampel dengan konsentrasi analit dan dikenal dengan penentuan tingkat minimum yang analit dapat dipercaya terdeteksi. 2. Standar deviasi respon berdasarkan deviasi standar dari kosong: Pengukuran besarnya respons latar belakang analitis dilakukan dengan menganalisis jumlah sampel yang tepat kosong dan menghitung standar deviasi tanggapan ini. 3. Standar deviasi respon berdasarkan kemiringan kurva kalibrasi: Sebuah kurva kalibrasi tertentu dipelajari dengan menggunakan sampel yang mengandung analit dalam kisaran batas deteksi. Deviasi standar residu dari garis regresi, atau standar deviasi dari y-perpotongan garis-garis regresi, dapat digunakan sebagai standar deviasi.
Gambar 7. Batas deteksi dan batas kuantisasi melalui sinyal terhadap kebisingan
Batas Kadar
Batas kuantisasi adalah jumlah minimum yang disuntikkan menghasilkan pengukuran kuantitatif dalam matriks target dengan presisi diterima dalam kromatografi, biasanya membutuhkan ketinggian puncak 1-20 kali lebih tinggi dari dasar suara. Jika diperlukan presisi metode di batas kuantisasi telah ditentukan, EURACHEM (Gambar 8) pendekatan dapat digunakan. Sejumlah sampel dengan penurunan jumlah analit adalah disuntikkan enam kali. RSD persen dihitung dari ketepatan diplot terhadap jumlah analit. Jumlah yang sesuai dengan yang dibutuhkan presisi didefinisikan sebelumnya adalah sama dengan batas kuantisasi.Adalah penting untuk tidak hanya menggunakan standar murni untuk tes ini tetapi juga matriks runcing yang erat merupakan sampel yang tidak diketahui. Untuk batas deteksi, para ICH merekomendasikan, di samping prosedur seperti yang dijelaskan di atas, inspeksi visual dan deviasi standar respon dan kemiringan kurva kalibrasi.
Gambar 11. Batas kuantisasi dengan EURACHEM metode. Setiap hasil deteksi dan batas kuantisasi pengukuran harus diverifikasi oleh tes eksperimen dengan sampel yang mengandung analit pada tingkat di dua daerah..Gambar 6 menggambarkan batas kuantisasi (bersama dengan batas deteksi, kisaran dan linieritas). Gambar 7 mengilustrasikan kedua batas deteksi dan batas kuantisasi.
Kekasaran
Ketidakrataan tidak dibahas dalam dokumen ICH telah digantikan oleh reproduktibilitas, yang memiliki arti yang sama seperti kekasaran, ditetapkan oleh USP sebagai tingkat reprodusibilitas hasil diperoleh berdasarkan berbagai kondisi, seperti yang berbeda laboratorium, analis, instrumen, kondisi lingkungan, operator dan bahan. Ketidakrataan adalah ukuran reprodusibilitas hasil tes di bawah normal, kondisi operasional diharapkan dari laboratorium ke laboratorium dan dari analis ke analis. Ketidakrataan ditentukan oleh analisis aliquots dari banyak homogen di laboratorium yang berbeda. Robustness
Robustness tes yang menguji pengaruh parameter operasional terhadap hasil analisis. Untuk penentuan ketahanan metode, sejumlah parameter metode, misalnya, pH, laju alir, suhu kolom, volume injeksi, panjang gelombang deteksi atau komposisi fase gerak, bervariasi dalam kisaran yang realistis, dan pengaruh kuantitatif dari variabel-variabel ini ditentukan. Jika pengaruh parameter adalah dalam toleransi yang ditentukan sebelumnya, parameter dikatakan dalam rentang's ketahanan metode. Memperoleh data tentang efek-efek ini membantu untuk menilai apakah suatu metode perlu revalidated ketika satu atau lebih parameter yang berubah, misalnya, untuk mengkompensasi kinerja kolom dari waktu ke waktu. Dalam dokumen ICH, dianjurkan untuk mempertimbangkan metode evaluasi yang ketahanan selama tahap pengembangan, dan hasil yang sangat penting untuk metode ini harus didokumentasikan. Ini bukan, bagaimanapun, diperlukan sebagai bagian dari registrasi. Stabilitas
Banyak zat terlarut mudah terurai sebelum investigasi kromatografi, misalnya, selama penyusunan solusi sampel, ekstraksi, pembersihan, transfer fase atau penyimpanan botol disiapkan (dalam lemari pendingin atau di sampler
otomatis).Dalam keadaan ini, pengembangan metode harus menyelidiki stabilitas analit dan standar. Sistem stabilitas jangka telah didefinisikan sebagai stabilitas dari sampel yang dianalisis dalam larutan sampel. Itu adalah ukuran dari bias dalam hasil uji yang dihasilkan selama suatu selang waktu terpilih, misalnya, setiap jam sampai 46 jam, menggunakan solusi tunggal (Gambar 9). Stabilitas sistem harus ditentukan oleh mereplikasi solusi analisis sampel. Sistem stabilitas yang dianggap pantas ketika RSD, dihitung berdasarkan hasil uji yang diperoleh pada interval waktu berbeda, tidak melebihi lebih dari 20 persen dari nilai yang sesuai dari sistem presisi. Jika, merencanakan hasil uji sebagai fungsi waktu, nilai lebih tinggi, durasi maksimum kegunaan larutan sampel dapat dihitung.
Gambar 9. Schematics stabilitas pengujian Pengaruh penyimpanan jangka panjang dan siklus beku-thaw dapat diselidiki dengan menganalisis sampel berduri segera setelah persiapan dan pada hari-hari berikutnya periode penyimpanan diantisipasi. A minimum dua siklus pada dua konsentrasi harus dipelajari dalam rangkap dua. Jika integritas obat dipengaruhi oleh pembekuan dan thawing, sampel berduri harus disimpan dalam kontainer individu, dan hati-hati yang tepat harus digunakan untuk studi sampel.
Parameter yang Harus Ada dalam Validasi Metode
Untuk proses validasi efisien, sangat penting untuk menentukan parameter validasi yang tepat dan kriteria penerimaan. Parameter lebih, semakin banyak waktu yang diperlukan untuk memvalidasi. Semakin ketat spesifikasi atau batas penerimaan, semakin sering peralatan harus dikalibrasi ulang, dan mungkin juga dikualifikasi ulang, untuk memenuhi spesifikasi yang lebih tinggi pada satu waktu. Hal ini tidak selalu penting untuk setiap memvalidasi parameter kinerja analitis, tetapi perlu untuk menentukan mana yang dibutuhkan. Identi-
Kenajisan
Kenajisan
Assay
fikasi
kuantitatif
kualitatif
Cate 3
tidak
tidak
ya
Ya
- Pengulangan
tidak
ya
tidak
Ya
- Interim presisi
tidak
ya
tidak
Ya
- Reproduksibilitas tidak
tidak
tidak
Tidak
Spesifikasi
ya
ya
ya
Ya
Batas deteksi
tidak
tidak
ya
Tidak
Batas kuantisasi
tidak
ya
tidak
Tidak
Linieritas
tidak
ya
tidak
Ya
Jarak
tidak
ya
tidak
ya *
Tugas Analitik
Ketepatan Ketelitian
Tabel 8. ICH Karakteristik * Mungkin diperlukan, tergantung pada sifat dari tes khusus
Assay Tugas Analitik
Kategori 1
Cat
2 Cat
3 Assay
kuantitatif
kualitatif
Cate 3
Ketepatan
ya
ya
*
*
Ketelitian
ya
ya
tidak
Ya
Spesifikasi
ya
ya
ya
*
Batas deteksi
tidak
tidak
ya
*
Batas kuantisasi
tidak
ya
tidak
*
Linieritas
ya
ya
tidak
*
Jarak
ya
ya
*
*
Kekasaran
ya
ya
ya
*
Tabel 9. Karakteristik USP * Mungkin diperlukan, tergantung pada sifat dari tes khusus Parameter validasi bergantung pada analisis tugas dan lingkup metode ini.Sebagai contoh, baik USP dan ICH berisi bab-bab tentang prosedur validasi untuk tugas-tugas analitik yang berbeda, yang keduanya termasuk untuk memberikan beberapa ide tentang apa jenis validasi yang diperlukan untuk tugas yang berbeda (lihat tabel 8 dan 9 ). Misalnya, menurut ICH, akurasi, presisi semua jenis dan batas deteksi dan kuantisasi tidak diperlukan jika tugas analisis adalah identifikasi. Untuk pengujian dalam 1 USP, kategori komponen utama atau bahan aktif yang akan diukur biasanya hadir pada konsentrasi tinggi, sehingga validasi batas deteksi dan kuantisasi tidak diperlukan. Karena jenis analisis dan informasi yang harus diperoleh dari sampel memiliki banyak pengaruh sebagainya validasi, tujuan dan ruang lingkup metode harus selalu didefinisikan sebagai langkah pertama dari setiap validasi metode.
Referensi
1. US FDA - Pedoman untuk Industri (draft) Prosedur Analitis dan Metode Validasi: Kimia, Manufaktur, dan Kontrol dan Dokumentasi, 2000 2. Konferensi Internasional Harmonisasi (ICH) Persyaratan Teknis Pendaftaran Farmasi Manusia Penggunaan, Validasi prosedur analitis, Jenewa (1996) 3. US EPA, Bimbingan untuk metode pengembangan dan validasi metode untuk Konservasi Sumber Daya dan Recovery Act (RCRA) Program, Washington DC (1995)., http://www.epa.gov/sw-846/pdfs/methdev.pdf 4. JM Hijau, Sebuah panduan praktis untuk validasi metode analitik, Anal. Chem.Berita & Fitur, 1 Mei 1996, hlm. 305A-309A. 5.
AOAC rekan-Verified Metode Program, Manual kebijakan dan prosedur, Arlington, Va., USA (1998). http://www.aoac.org/vmeth/PVM.pdf
6. 16. Winslow PA dan RF Meyer, Mendefinisikan rencana induk untuk validasi metode analisis, J. Validasi Teknologi, hal). 361-367 (1997. 7. J. Vessman, Selektivitas atau spesifisitas? Validasi metode analisis dari perspektif kimiawan analitis dalam industri farmasi, J. Pharm & BioMed Analisis 14:867-869 (1996). 8. L. Huber dan S. George, diode-array deteksi dalam kinerja tinggi kromatografi cair, New York, Marcel Dekker, ISBN 0-8247-4 (1993).
VALIDASI METODE ANALISIS UNTUK MEMENUHI TUGAS AKHIR SEMESTER IV FAKULTAS MIPA, PRODI FARMASI, MATA KULIAH ANALISIS FISIKOKIMIA 2
DISUSUN OLEH : FARIDA ISKANATI (08613095) PROGRAM STUDI FARMASI FAKULTAS MATEMATIKA DAN ILMU PENGETAHUAN ALAM UNIVERSITAS ISLAM INDONESIA YOGYAKARTA 2009/2010
