VALIDASI METODE PENETAPAN KADAR THIAMIN HCl DALAM TABLET VITAMIN B1 SECARA HPLC
Prambudi Cahyo Laksono, Laksono, Prasetia, Riyadh Raihan Abiyyu, Rizqi Amaliyah. Kelompok 6 Kelas 13-9 SMK-SMAK SMK-SMAK Bogor ABSTRAK
Validasi adalah suatu metode penetapan kadar Thiamin HCl secara HPLC yang merupakan konfirmasi pengujian dan pengadaan bukti yang objektif bahwa persyaratan atau kesesuaian metode ini memenuhi maksud khusus atau tujuan pengukuran untuk dapat memberikan data analisis yang berguna pada penentuan kadar thiamin dalam suatu contoh vitamin B1. Larutan standar Thiamin yang digunakan dengan konsentrasi 050 ppm. Sampel vitamin B1 dilarutkan dan diencerkan dengan larutan buffer fosfat. Uji yang telah dilakukan adalah Uji presisi dengan hasil RSD 0,64%, uji LOD 0,0647, dan uji LOQ 0,2158. ABSTRACT
Validation is one of a method for the determination of contain of Thiamine HCl in HPLC which is confirmation testing and procurement objective evidence that the requirements or the suitability of this method meets the specific intent or purpose for measurement data analysis can provide useful in determining levels of thiamine in a vitamin B1 sample. Standard solutions used with thiamine concentration from 0 to 50 ppm. Samples of the vitamin B1 is dissolved and diluted with phosphate buffer solution. The trial has been conducted is a precision Test with RSD results of 0.64%, LOD test result of 0,0647 and LOQ test result of 0,2158. 0,2158.
PENDAHULUAN
Banyaknya vitamin yang dihasilkan untuk mencegah penyakit tertentu atau pengembangan terhadap vitamin sebelumnya baik dari segi indikasi maupun mekanisme aksinya, membutuhkan suatu studi untuk menguji vitamin tersebut dari segala aspek, baik farmakologi maupun farmakokinetinya. Salah satunya adalah validasi metode analisis penetapan kadar Thiamin HCl dalam tablet vitamin B1 secara HPLC. Validasi metode analisis merupakan suatu tindakan penilaian terhadap parameter tertentu berdasarkan percobaan laboratorium untuk membuktikan bahwa parameter tersebut memenuhi persyaratan untuk penggunaannya (Harmita, 2004). Tujuan dari pembuatan Laporan Khusus ini adalah untuk mengkonfirmasi atau memastikan metode analisis penetapan kadar thiamin pada tablet vitamin B1
secara HPLC peruntukannya.
sesuai
untuk
TINJAUAN PUSTAKA
A. Validasi Metode Analisis Validasi metode analisis adalah suatu tindakan penilaian terhadap parameter tertentu berdasarkan percobaan laboratorium, untuk membuktikan bahwa parameter tersebut memenuhi persyaratan untuk penggunaannya (Harmita, 2004). Menurut Harvey (2000), validasi merupakan suatu proses evaluasi kecermatan dan keseksamaan yang dihasilkan oleh suatu prosedur dengan nilai yang dapat diterima. Sebagai tambahan, validasi memastikan bahwa suatu prosedur tertulis memiliki detail yang cukup jelas sehingga dapat dilaksanakan oleh analis atau laboratorium yang berbeda dengan hasil yang sebanding. Validasi metode analisis bertujuan untuk memastikan dan
mengkonfirmasi bahwa metode analisis tersebut sudah sesuai untuk peruntukannya. Validasi biasanya diperuntukkan untuk metode analisa yang baru dibuat dan dikembangkan. Sedangkan untuk metode yang memang telah tersedia dan baku (misal dari AOAC, ASTM, dan lainnya), namun metode tersebut baru pertama kali akan digunakan di laboratorium tertentu, biasanya tidak perlu dilakukan validasi, namun hanya verifikasi. Tahapan verifikasi mirip dengan validasi hanya saja parameter yang dilakukan tidak selengkap validasi. B. Akurasi Akurasi adalah ukuran yang menunjukkan derajat kedekatan hasil analis dengan kadar analit yang sebenarnya. Accuracy dinyatakan sebagai persen perolehan kembali (recovery) analit yang ditambahkan. Accuracy dapat ditentukan melalui dua cara, yaitu metode simulasi (spikedplacebo recovery) atau metode penambahan baku (standard addition method). C. Presisi Presisi adalah ukuran yang menunjukkan derajat kesesuaian antara hasil uji individual, diukur melalui penyebaran hasil individual dari rata-rata jika prosedur diterapkan secara berulang pada sampel-sampel yang diambil dari campuran yang homogen. Presisi diukur sebagai simpangan baku atau simpangan baku relatif (koefisien variasi). Precision dapat dinyatakan sebagai repeatability (keterulangan) atau reproducibility (ketertiruan). D. Ripitabilitas Repitabilitas adalah keseksamaan metode jika dilakukan berulang kali oleh analis yang sama pada kondisi sama dan dalam interval waktu yang pendek. Repeatability dinilai melalui pelaksanaan penetapan terpisah lengkap terhadap sampel-sampel identik yang terpisah dari batch yang sama, jadi memberikan ukuran keseksamaan pada kondisi yang normal. E. Selektivitas Selektivitas atau spesifisitas suatu metode adalah kemampuannya yang
hanya mengukur zat tertentu saja secara cermat dan seksama dengan adanya komponen lain yang mungkin ada dalam matriks sampel. Selektivitas seringkali dapat dinyatakan sebagai derajat penyimpangan (degree of bias) metode yang dilakukan terhadap sampel yang mengandung bahan yang ditambahkan berupa cemaran, hasil urai, senyawa sejenis, senyawa asing lainnya, dan dibandingkan terhadap hasil analisis sampel yang tidak mengandung bahan lain yang ditambahkan. Selektivitas metode ditentukan dengan membandingkan hasil analisis sampel yang mengandung cemaran, hasil urai, senyawa sejenis, senyawa asing lainnya atau pembawa plasebo dengan hasil analisis sampel tanpa penambahan bahan-bahan tadi. F. Linearitas (Jangkauan Kerja Linear) Linearitas adalah kemampuan metode analisis memberikan respon proporsional terhadap konsentrasi analit dalam sampel. Rentang metode adalah pernyataan batas terendah dan tertinggi analit yang sudah ditunjukkan dapat ditetapkan dengan kecermatan, keseksamaan, dan linearitas yang dapat diterima. Linearitas biasanya dinyatakan dalam istilah variansi sekitar arah garis regresi yang dihitung berdasarkan persamaan matematik data yang diperoleh dari hasil uji analit dalam sampel dengan berbagai konsentrasi analit. Perlakuan matematik dalam pengujian linearitas adalah melalui persamaan garis lurus dengan metode kuadrat terkecil antara hasil analisis terhadap konsentrasi analit. G. Limit Deteksi (Limit of Detection) dan Batas Kuantitasi (Limit of Quatification) Batas deteksi adalah jumlah terkecil analit dalam sampel yang dapat dideteksi yang masih memberikan respon signifikan dibandingkan dengan blangko. Batas deteksi merupakan parameter uji batas. Batas kuantitasi merupakan parameter pada analisis renik dan diartikan sebagai kuantitas terkecil analit dalam sampel yang masih dapat memenuhi kriteria cermat dan seksama. Penentuan batas deteksi suatu metode berbeda-beda tergantung pada metode analisis itu menggunakan instrumen atau
tidak. Pada analisis yang tidak menggunakan instrumen batas tersebut ditentukan dengan mendeteksi analit dalam sampel pada pengenceran bertingkat. Pada analisis instrumen batas deteksi dapat dihitung dengan mengukur respon blangko beberapa kali lalu dihitung simpangan baku respon blangko. METODE ANALISIS
Dasar. Validasi metode penetapan kadar
Thiamin HCl secara HPLC adalah konfirmasi pengujian dan pengadaan bukti yang objektif bahwa persyaratan atau kesesuaian metode ini memenuhi maksud khusus atau tujuan pengukuran untuk dapat memberikan data analisis yang berguna pada penetapan kadar Thiamin dalam suatu sampel tablet vitamin B1. Peralatan. Pada penetapan ini peralatan
yang dibutuhkan adalah Kertas perkamen, Kaca arloji, Pengaduk, Corong, Labu ukur 100 mL, Labu ukur 50 mL, Piala gelas 800 ml, Piala gelas 400 mL, Pipet tetes, Pipet volum 5 mL, Kertas saring Whatman No.41, Penyaring milipore 0.22 µm, vial dan syringe. B a h a n . Bahan yang digunakan sebagai
standar adalah Thiamin HCl. Bahan kimia lain yang digunakan adalah Buffer fosfat pH 4,5 yang digunakan sebagai pelarut. Cara kerja
a. Pembuatan Larutan Buffer Fosfat 0,04M Ditimbang 10,8872 ±0,0005 gram KH2PO4, dimasukkan ke dalam labu ukur 2000 mL, diencerkan dengan akuabides, diimpitkan pada skala tera, dihomogenkan. Ditempatkan pada botol dan diberi label yang sesuai. b. Pembuatan Deret Standar Larutan Deret Standar Thiamin HCl: 0-50 ppm. Diturunkan dari buret standar induk Thiamin 100 ppm sejumlah 0 mL; 2,5 mL; 5 mL; 7,5 mL; 10 mL; 15 mL; dan 25 mL ke dalam labu ukur 50 mL, diencerkan dan diimpitkan hingga 50 mL buffer fosfat, dihomogenkan. Disaring menggunakan kertas saring Millipore.
Dikumpulkan filtrat pada piala gelas 100 mL, larutan standar siap dinjeksikan. c. Persiapan sampel Ditimbang ± 0,2000 gram sampel. Dimasukkan ke dalam labu ukur 100 mL, ditambahkan larutan buffer fosfat, dikocok selama 5 menit, diimpitkan pada tanda tera, dibiarkan mengenap dan disaring dengan kertas saring Whatman 41. Pipet 5 mL filtrat ke dalam labu ukur 50 mL, diencerkan dengan buffer fosfat, diimpitkan dan dihomogenkan. Disaring menggunakan kertas saring millipore. Dikumpulkan filtrat pada gelas piala 100 ml, larutan sampel siap dinjeksikan. d. Selektifitas Penetapan selektifitas dilakukan dengan membandingkan kromatogramkromatogram blanko, standar, sampel dan sampel spike. e. Ripitabilitas Penetapan ripitibilitas dilakukan dengan melakukan penetapan sampel sebanyak 10 kali pengulangan, dihitung nilai simpangan baku dan simpangan baku relatif sampel. Ripitibilitas dinyatakan sebagai simpangan baku relatif (RSD) f. Limit deteksi Penetapan limit deteksi instrumen (IDL) dilakukan dengan membaca nilai area spike sampel terendah sebanyak 10 kali pengulangan. Ditetapkan nilai IDL berdasarkan 3 kali nilai simpangan baku kemudian dikonversikan sebagai konsentrasi menggunakan area standar. Penentuan limit deteksi metode (MDL) ditentukan nilai estimasi 6 kali simpangan baku. Dikonversikan nilai area menjadi konsentrasi menggunakan kurva kalibrasi. Dibuat deret standar dengan konsentrasi 3SD, 6SD, dan 9SD kemudian dibaca nilai area pada KCKT. Ditentukan konsentrasi yang memberikan pembacaan di atas area estimasi sebagai limit deteksi metode (MDL). g. Jangkauan Kerja Linear Jangkauan kerja linear ditentukan dengan membuat deret standar ThiaminHCl dengan konsentrasi 5; 10; 15; 20; 30; 50; 75, 100; 150; 200; 250; 300; 400 dan 500 ppm. Disaring dengan millipore, diinjeksikan pada KCKT. Ditetapkan persamaan koefisien korelasi. Ditentukan
konsentrasi maksimum yang masih memberikan nilai koefisien korelasi lebih besar dari 0,9995. h. Pengujian Spike pada Sampel Ditimbang ± 0,2000 gram sampel. Dimasukkan ke dalam labu ukur 100 mL. Ke dalam sampel ditambahkan larutan standar dengan konsentrasi 5 ppm dan 10 ppm dengan pengulangan masingmasing sebanyak 10 kali. Diambahkan larutan larutan buffer fosfat, dikocok selama 5 menit, diimpitkan hingga tanda tera. Dibiarkan mengenap dan disaring menggunakan kertas saring Whatman 41. Dipipet 5 mL filtrat ke dalam labu ukur 50 mL, diencerkan dengan larutan buffer fosfat, diimpitkan dan dihomogenkan. Diaring larutan dengan kertas saring millipore, injeksikan sebanyak 20 μL pada alat kromatografi cair kinerja tinggi. Dihitung kadar Thiamin HCl dalam sampel spike. HASIL DAN PEMBAHASAN
A. Data pengamatan 1.
Uji Presisi
Table 1. Kadar tiamina-Hcl dalam vitamin B1 tablet (KCKT) No 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 Rata-rata SD RSD
Kadar Tiamina (%) 11,68 11,80 11,80 11,92 11,83 11,79 11,74 11,67 11,74 11,84 11,781 0,0759 0,6445
Tabel 2. Rekomendasi Hrowitz terhadap nilai RSD berdasarkan daerah konsentrasi pembaacaan. Kisaran Konsentrasi Analat 100 % 10 %
Ripitabilitas (% RSD) 1% 1,5 %
1% 0,1 % 0,01 % 10 ppm 1 ppm 10 ppb 2.
2% 3% 4% 6% 8% 15 %
Kisaran Kerja Linear
Tabel 3. Hubungan nilai luas area terhadarp keonsentasi standar dalam penentuan daerah konsentrasi linear (KCKT)
No
Konse ntrasi (ppm)
1 0 2 5 3 10 4 15 5 20 6 30 7 50 8 75 9 100 Slope= 48,5397 3.
Luas Area 0,0000 257,0605 496,4235 759,3652 991,2006 1457,5432 2437,9878 3323,6598 3356,3656
Koefisien Korelasi
0,9998 0,9998 0,9998 0,9998 0,9998 0,9980
Limit Deteksi
Tabel 4. Luas standar 10 kali pembacaan pada penetapan kimit deteksi instrument (IDL) secara KCKT No 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10
Konsentrasi Standar (ppm) 0,2 0,2 0,2 0,2 0,2 0,2 0,2 0,2 0,2 0,2 Rata-rata SD IDL LOQ
Luas Area Pembacaan 26,14161 24,61180 23,74009 24,18138 25,25105 26,45989 26,76989 25,79672 26,34040 16,14161 25,54338 1,0473 0,0647 0,2158
Tabel 5. Nilai pembacaan luas area pada penetapan limit deteksi metode (MDL) secara KCKT No 1 2 3 4 5 6
4.
Konsentrasi (ppm) 0,05 0,10 0,20 0,30 0,40 0,50
Luas Area 0,00 0,00 20,02 38,71 42,20 50,65
Akurasi
Tabel 6. Hasil penentuan recovery spike 60 ppm (KCKT)
Tabel 7. Hasil penentuan recovery spike 120 ppm (KCKT)
B. Pembahasan 1. Uji Presisi Uji presisi dilakukan dengan mengamati parameter ripitibilitas. Uji presisi dapat ditunjukkan dengan ripitabilitas yang dinyatakan sebagai hasil presisi dibawah perlakuan yang sama. Pengujian dilakukan dengan menghitung nilai simpangan baku dan simpangan baku relatif terhadap pengukuran 10 kali pembacaan sampel. Tabel 1 menampilkan data hasil pengujian sepuluh kali pengulangan kadar tiaminaHCl secara KCKT.Nilai simpangan baku pembacaan adalah 0,08 dengan simpangan baku relatif 0,64 %.
Menggunakan tabel ripitibilitas Horwitz pada kisaran pembacaan 10 %, persyaratan ripitabilitas pada 1,5 %. Dengan demikian 0,64% < 1,5 %, dan metode penetapan memenuhi persyaratan nilai presisi sebagai ripitibilitas. 2. Kisaran Kerja Linear Uji kisaran kerja linear suatu metode analisis bertujuan untuk membuktikan adanya hubungan linear antara konsentrasi zat dengan respon alat. Dalam hal ini diperlukan ketelitian saat preparasi contoh serta kemampuan yang baik dari alat untuk melakukan pengukuran secara tepat dan teliti. Uji Kisaran Kerja Linear dilakukan dengan membuat grafik persamaan regresi linear dengan maksud mendemonstrasikan hubungan linear antara sinyal analisis terhadap konsentrasinya. Koefisien korelasi yang disyaratkan adalah >0,9995. Kisaran kerja linear ditampilkan sebagai korelasi tabel data konsentrasi terhadap luas area. Konsentrasi tertinggi yang masih memberikan hubungan yang linear terjadi pada konsentrasi 50 dengan koefisien korelasi 0,9999. 3. Limit Deteksi Limit deteksi diperoleh dari konsentrasi terendah yang masih dapat ditetapkan dengan presisi atau ripitibilitas yang masih dapat diterima oleh kondisi pengujian. Batas konsentrasi yang memberikan puncak yang dapat dideteksi secara kromatografi cair kinerja tinggi (KCKT) untuk peralatan yang digunakan berada pada level 0,2 ppm. Pembacaan yang dihasilkan alat dihitung nilai standar deviasinya secara statistik untuk menghasilkan nilai limit deteksi instrumen (IDL). Tabel 4 menampilkan data pengamatan penetapan limit deteksi instrumen (IDL). Nilai IDL didapatkan untuk penetapan secara KCKT adalah 0,0647 satuan area dari hasil 3 kali standar deviasi pengukuran area. Estimasi 6 kali simpangan baku area ditetapkan sebagai estimasi penetapan limit deteksi metode (MDL). Nilai area yang harus didapatkan adalah 0,2158 satuan area. 4. Akurasi Uji akurasi dilakukan dengan proses spike terhadap sampel dan menghitung nilai perolehan kembalinya, spike
dilakukan pada dua tingkat. Menggunakan metode yang sama dengan perlakuan pada metode spektrofotometri UV-Vis, secara KCKT dilakukan spike pada tingkat 60 ppm dan 120 ppm. Menggunakan nilai konsentrasi analat yang ditambahkan sebagai sampel spike dalam kisaran 1% maka nilai batas recovery yang direkomendasikan adalah 92 – 105 %. Dengan demikian recovery penetapan terhadap spike 60 ppm dan spike 120 ppm masih memenuhi persyaratan nilai batas recovery. KESIMPULAN
Berdasarkan validasi metode penetapan kadar tiamin-HCl dalam tablet vitamin B1 seara HPLC, didapatkan hasil rata-rata pada uji presisi sebesar 11,781 dengan SD sebesar 0,075 dan RSD sebesar 0,6445 %. Jika nilai RSD dibandingkan dengan tabel rekomendasi Horwitz maka uji presisi dintyatakan kayak karena RSD < 1,5 % dengan kisaran konsentrasi 11 %. Pada kisaran kerja linear, didapatkan koefisien korelasi 0,9999 pada konsentrasi 0-50 ppm dan slope uyang didapatkan sebesar 48,5397. Pada uji limit deteksi dinyatakan bahwa pembacaan luas area terkecil yang dibaca oleh alat adalah dengan rata-rata luas area = 25,54338 ; SD = 1,0473 ; IDL = 0,0647 dan LOQ = 0,2158. Pada uji akurasi didapatkan hasil penentuan recovery spike 60 ppm sebesar 92,91 % dean hasil penentuan recovery spike 120 ppm sebesar 92,30. Maka dengan hasil yang didapatkan dapat disimpulkan
bahwa metode yang digunakan untuk menetapkan kadar Tiamina-Hcl masih layak. DAFTAR PUSTAKA
Riyadi, Wahyu. 2009. Validasi Metode Analisis.(Online)( http://www.chem-istry.org/artikel_kimia/kimia_analisis/valida si-metode-analisis/, diakses pada tanggal 21 Agustus 2014 pk. 16.00). Tanpa nama. 2011. Verifikasi Metode Analisis Secara HPLC . (Online)(http://zonazaenal.wordpress.co m/2011/01/02/verifikasi-metode-analisissecara-hplc/, diakses pada tanggal 21 Agustus 2014 pk. 13.28). Tanpa nama. Tanpa tahun. Validasi Metode. (Online)(http://digilib.unimed.ac.id/public/ UNIMED-Undergraduate-2498010.%20082244710001%20BAB%20I.pdf, diakses pada tanggal 21 Agustus 2014 pk. 13.56).
