DAFTAR ISI KATA KATA PENGAN PE NGANT TAR DAFTAR ISI DAFTAR GAMBAR DAFTAR TABEL BAB I TENTANG BLOT
1.1 Pengan Pengantar tar 1.2 Keuntungan Teknik Blot Blot 1.3 Macam-Macam Macam-Macam Metode Metode Blong BAB II WESTER B!"T 2.1 Kele#i$an We%tern Blot 2.2 Alat dan Ba$an 2.3 !angka$-langka$ We%tern Blot BAB III WESTER B!"T & PERSIAPA SAMPE! 3.1 Sam'el 3.2 Per%ia'an Protein !(%ate dari )aringan dan Kultur Sel 3.2.1 Pro%edur Tekni% Tekni% Ek%trak%i Protein & *enatura%i Protein 3.2.2 Pengukuran Kon%entra%i Protein 3.2.3 *enatura%i Protein BAB I+ WESTER B!"T & PERSIAPA B,ER .1 Per%ia'an Bu//er (ang *i#utu$kan BAB + WESTER B!"T & PERSIAPA PEMB,ATA 0E! .1 S*S-PA0E S*S-PA0E Elektro/ore%i% .2 onto$ Pro%edur Pem#uatan 0el untuk S*S-PA0E S*S-PA0E
BAB +I
WESTER B!"T & E!EKTR""RESIS E!EKTR""RESIS .1 0el Elektro/ore%i% .1.1 Pro%edur Elektro/ore%i% .2 Tran%/er Protein4Blotting .2.1 Pro%edur Tran%/er Protein4Blotting .3 *etek%i Protein dengan An #odi .3.1 Pro%edur Tekni% *etek%i Protein dengan An #odi . *etek%i Protein Target Target ..1 *etek%i %ecara Kolorimetri ..2 *etek%i %ecara $emilumine%cence ..3 *etek%i %ecara radioak / .. *etek%i %ecara luore%cen BAB +II WESTER B!"T & AA!ISIS 5ASI! 6.1 Image-) BAB +III WESTER B!"T & TR",B!E S5""TI0 7.1 Tidak Ada Band Ada Band 7.2 0am#aran Band 0am#aran Band Tidak )ela% 8Sin(al !ema$9 7.3 Extra 7.3 Extra Band 7. High 7. High Background Background 7. Diffuse 7. Diffuse Band 7. Band Ber:arna Pu $ 8E! 8 E! method) 7.6 Bin k-Bin k dan 0elem#ung 'ada Mem#ran 7.7 Ke%ala$an (ang %ering dalam We%tern Blot *ATAR P,STAKA !AMPIRA 1 Re%e' Bu//er Bu//er !AMPIRA 1 Re%e' Bu//er Bu//er !AMPIRA 2 Re%e' S*S-PA0E S*S-PA0E 0el !AMPIRA 3 onto$ 5a%il Pengam#ilan 0am#ar :e%tern Blot I*E; DAFTAR GAMBAR
WESTER B!"T & E!EKTR""RESIS E!EKTR""RESIS .1 0el Elektro/ore%i% .1.1 Pro%edur Elektro/ore%i% .2 Tran%/er Protein4Blotting .2.1 Pro%edur Tran%/er Protein4Blotting .3 *etek%i Protein dengan An #odi .3.1 Pro%edur Tekni% *etek%i Protein dengan An #odi . *etek%i Protein Target Target ..1 *etek%i %ecara Kolorimetri ..2 *etek%i %ecara $emilumine%cence ..3 *etek%i %ecara radioak / .. *etek%i %ecara luore%cen BAB +II WESTER B!"T & AA!ISIS 5ASI! 6.1 Image-) BAB +III WESTER B!"T & TR",B!E S5""TI0 7.1 Tidak Ada Band Ada Band 7.2 0am#aran Band 0am#aran Band Tidak )ela% 8Sin(al !ema$9 7.3 Extra 7.3 Extra Band 7. High 7. High Background Background 7. Diffuse 7. Diffuse Band 7. Band Ber:arna Pu $ 8E! 8 E! method) 7.6 Bin k-Bin k dan 0elem#ung 'ada Mem#ran 7.7 Ke%ala$an (ang %ering dalam We%tern Blot *ATAR P,STAKA !AMPIRA 1 Re%e' Bu//er Bu//er !AMPIRA 1 Re%e' Bu//er Bu//er !AMPIRA 2 Re%e' S*S-PA0E S*S-PA0E 0el !AMPIRA 3 onto$ 5a%il Pengam#ilan 0am#ar :e%tern Blot I*E; DAFTAR GAMBAR
0am#ar 0am#ar 2.1
5a%il 5a%il :e%te :e%tern rn #lot #lot 8Ronn( 8Ronn(<< et. et. al. al. 2=19 2=19
0am#ar 0am#ar 2.2 2.2
Prin%i Prin%i' ' detek% detek%ii 'rotein 'rotein targ target et menggu menggunak nakan an an. #od #odii %'e%i/i %'e%i/ik k
0am 0am#ar #ar 2.3 2.3
We%te e%tern rn #lo #lot workflow
0am#ar 0am#ar 3.1 3.1
5a%il 5a%il ek%tra ek%trak%i k%i 'rot 'rotein ein #eru #eru'a 'a enda' enda'an an dan dan %u'er %u'ernat natan an
0am#ar 0am#ar 3.2
Kur>a Kur>a %tandar %tandar untuk untuk 'emeri 'emerik%aa k%aan n Brad Brad/or /ord d
0am#ar 3.3
Sample Buffer
0am#ar 0am#ar 3.
Blok Blok 'eman 'emana% a% untu untuk k dena denatur tura%i a%i 'rotein 'rotein %am'el %am'el
0am#ar .1
Po%i%i separating gel dan stocking dan stocking gel 'ada gel 'ada gel S*S-PA0E S*S-PA0E
0am#ar .2
Separa Separatin ting g buffer buffer dan stacking buffer, buffer, teme temed d dan dan acryla acrylamid midee di
dalam #o? e% 0am# 0am#ar ar .3 .3
Pera Perala lata tan n untu untuk k mem# mem#ua uatt home made gel
0am# 0am#ar ar . .
Karet Karet 'ena 'ena$a $an n #ag #agia ian n #a: #a:a$ a$
0am#ar .
Holder kaca (ang digunakan untuk mem#uat home made gel
0am#ar .
0ari% ri% luru% 'em#ata% antara ara separating gel dan stocking gel
menggunakan %'idol 0am# 0am#ar ar .6 .6
0ari 0ari%% #ata #ata%% anta antara ra separating separating gel dan stacking dan stacking gel
0am 0am#ar #ar .1 .1
ont onto o$ 'ro 'rote tein in marker dan %am'el 'ada S*S-PA0E
0am# 0am#ar ar .2 .2
Elek Elektro tro/o /ore re%i% %i% S*SS*S-P PA0E A0E
0am# 0am#ar ar .3 .3
Alat Alat ele elekt ktro ro/o /ore% re%i% i% S*S S*S-P -PA0 A0E E
0am# 0am#ar ar . .
Bagi Bagian an %udu %udutt alat alat elek elektr tro/ o/or ore% e%i% i% S*SS*S-P PA0E A0E dala dalam m kead keadaa aan n
terkunci 0am# 0am#ar ar . .
Sam' Sam'el el 'rot 'rotei ein n 8#er: 8#er:arn arnaa #iru9 #iru9 'ad 'adaa separating gel
0am#ar 0am#ar . .
Sam'el Sam'el 'rot 'rotein ein 8#er 8#er:arn :arnaa #iru9 #iru9 #erad #eradaa 'ada 'ada #agian #agian #a:a #a:a$ $ gel
0am# 0am#ar ar .6 .6
Alat Alat tra tran% n%/e /err 'ro 'rote tein in wet blot
0am# 0am#ar ar .7 .7
Alat Alat tra tran% n%/e /err 'ro 'rote tein in semi semi dry blot
0am# 0am#ar ar .@ .@
Alat Alat tra tran% n%/e /err 'ro 'rote tein in dry blot
0am# 0am#ar ar .1= .1= Ka%a Ka%a 8 sponge sponge pad 9 di#a%a$i dengan 1? transfer buffer 0am#ar .11 Filter paper diletakkan diata% ka%a
0am#ar 0am#ar .12 .12 0el $a%il $a%il elektro/ore%i% elektro/ore%i% S*S-PA0E S*S-PA0E 0am# 0am#ar ar .1 .13 3 Bagi Bagian an stacking stacking gel di#uang menggunakan scraper menggunakan scraper 'la% 'la% k 0am#ar 0am#ar .1 .1 ara ara meleta meletakka kkan n gel 'ada 'ada filter paper 0am#ar 0am#ar .1 .1 ara mele'a%k mele'a%kan an kaca kaca dari gel (ang (ang menem' menem'el el 0am#ar 0am#ar .1 .1 ara ara memega memegang ng mem#r mem#ran an P+* P+* 0am#ar 0am#ar .16 .16 ara meletak meletakkan kan mem#ran mem#ran P+* diata% gel 0am 0am#ar #ar .1 .17 Pro% Pro%e% e% rolling rolling untuk meng$ilangkan udara (ang tere#ak diantara mem#ran dan gel 0am# 0am#ar ar .1 .1@ @ Pro% Pro%e% e% rolling 'ada rolling 'ada ka%a /ilter 0am# 0am#ar ar .2 .2= = Ka%et Ka%et #eri% #eri%ii sandwich mem#ran gel dalam 'o%i%i terkunci 0am# 0am#ar ar .21 .21 ara ara mema mema%u %ukk kkan an ka%et ka%et #eri%i #eri%i sandwich membran gel ke dalam alat blotting 0am# 0am#ar ar .2 .22 2 Po%i% Po%i%ii ka%e ka%ett sandwich mem#ran gel dari ata% alat blotting 0am#ar .23 Pro%e% tran%/er 'rotein4blotting 'rotein4 blotting 0am#ar 0am#ar .2 .2 5a%il 5a%il 'ro%e% 'ro%e% tran% tran%/er /er 'rote 'rotein4 in4blotting blotting 0am# 0am#ar ar .2 .2 Pro% Pro%e% e% Ponc Poncea eau u S staining 0am# 0am#ar ar .2 .2 5a%il 5a%il Pon Poncea ceau u S staining S staining 0am# 0am#ar ar .2 .26 6 Pro% Pro%e% e% blocking mem#ran menggunakan blocking solution 0am#ar 0am#ar .27 Ta$a' 'e:arnaa 'e:arnaan n imunolog imunologii dengan dengan an #odi #odi 0am#ar 0am#ar .2@ .2@ Prin%i' Prin%i' detek%i detek%i 'rotein 'rotein 'ada 'ada :e%tern :e%tern #lot 0am#ar .3= Sala$ %atu pe %atu pe gel documentation machine machine 0am#ar .31 nfrared detection system machine 0am#ar 0am#ar .32 *etek%i menggunaka menggunakan n /ilm nega nega / 8%ecara 8%ecara radioak radioak /9 0am#ar 0am#ar .33 .33 *etek%i *etek%i 'rot 'rotein ein targ target et dengan dengan chemiluminescence 0am#ar .3 !hemiluminesence reagent #ia%an(a reagent #ia%an(a terdiri dari reagen A dan B
0am#ar 6.1
Tam'ilan %o :are Image-)
DAFTAR TABEL
Ta#el 3.1 !oka%i 'rotein dan lysis buffer (ang cocok Ta#el a#el .1 .1 Reko Rekome mend nda%i a%i 'er%e 'er%ent nta% a%ee gel gel ter$ ter$ad ada' a' ukur ukuran an 'rot 'rotei ein n (ang (ang akan akan dianali%i%
BAB I TENTANG BLOT
1.1 Pengantar Blot adalah %uatu teknik mentran%/er #agian 'rotein (ang tela$ di%e'ara%i<
RA atau *A dari gel ke lem#aran 'i% atau matrik% mem#ran %u'a(a #agian 'rotein ter%e#ut menadi dak #ergerak dan da'at diukur.
1.2 Keuntungan Ten! Blot
Ak%e% (ang le#i$ #e%ar dan muda$ ke'ada 'rotein terikat di 'ermukaan lem#aran mem#ran di#andingkan ke'ada molekul4'rotein (ang ma%i$ #erada di dalam gel atau matrik%.
!e#i$ %edikit larutan reagen dan #odi4'ereak%i (ang di#utu$kan.
Waktu (ang di#utu$kan untuk melakukan 'er:arnaan dan 'encucian *A< inku#a%i< mencuci menadi le#i$.
Pen(im'anan da'at %am'ai #er#ulan #ulan %am'ai dianali%i%.
Matrik% da'at #eru'a "itrocellulase 89< #oly$inylidene difluoride 8P+*9< Dia%abenyloxymethyl 8*BM9 dan Dia%ophenylthioeter 8*PT9.
1." Ma#a$%$a#a$ Metode Blong
1. Sout$ern Blot Sout$ern #lot 'ertama kali dikemukakan ole$ Sout$ern 81@69. Teknik ini mentran%/er *A ke kerta% nitrocellulose& 2. ort$ern Blot ort$ern #lot meru'akan teknik (ang %ama dengan Sout$ern Blot< namun menggunakan kerta% *BM dan #ia%an(a mendetek%i RA. 3. Ea%tern Blot Ea%tern #lot ditemukan ole$ Rein$ard dan Malamud 81@729< adala$ 'ro%e% tran%/er bidirectional dengan menggunakan aliran 'elarut 'rotein dari gel ke #erda%arkan i%oelektrik.
. We%tern Blot W. eal Burne mem'erkenalkan dan menamai :e%tern #lot %e#agai re%'on ter$ada' 'enamaan teknik %out$ern #lot (ang 'ertama kali ditemukan.
BAB II &ESTERN BLOT
We%tern Blot 8WB9 adala$ %uatu teknik anali%i% %am'el 'rotein (ang digunakan 'ada ri%et #iologi molekular. We%tern Blot digunakan untuk mendetek%i 'rotein %'e%i/ik dengan menggunakan 'rin%i' reak%i gen-an #odi. An #odi 8mono dan 'oliklonal9 da'at di'erole$ %ecara komer%ial atau di#uat %ecara k$u%u% untuk mendetek%i %uatu4#e#era'a e'ito'e dari 'rotein. Teknik untuk mendetek%i 'rotein %'e%i/ik 'ada %am'el aringan. Teknik ini menggunakan gel elektro/ore%i% untuk memi%a$kan 'rotein #erda%arkan 'anang 'oli'e'da atau #erda%arkan %truktur 3*n(a. Protein kemudian ditran%/er memakai nitrocellulose atau P+*< dimana mereka kemudian akan dilacak dengan menggunakan #odi (ang %'e%i/ik ke'ada 'rotein target. We%tern #lot da'at mendetek%i %uatu 'rotein dalam kom#ina%in(a dengan %angat #an(ak 'rotein lain< da'at mem#erikan in/orma%i mengenai ukuran dan ek%'re%i 'rotein ter%e#ut.
0am#ar 2. 5a%il :e%tern #lot 8Ronn(< et. al. 2=19
2.1 Kele'!han &e(tern Blot
*a'at mendetek%i )rote!n dala$ *u$lah e#!l %e'erti clock 'rotein.
*a'at digunakan untuk $endete(! re()on !$unolog!( dari %am'el (ang in/ek%iu% %e'erti >iru% atau #akteri.
Le'!h ()e(!+! di#andingkan dengan E!ISA.
Se'aga! )en,!$)anan (a$)el )rote!n 'ada mem#ran. Mem#ran WB
memiliki kemam'uan
untuk mengikat 'rotein %ecara kuat %e$ingga da'at
men(im'an %am'el 'rotein dengan #aik untuk d!)ro(e( e$'al! untuk detek%i 'rotein (ang #er#eda.
-!(ual!(a(! $udah menggunakan #e#era'a alat %e'erti ?-ra( dan scanner&
Ga$'ar 2.2 Prin%i' detek%i 'rotein target menggunakan #odi %'e%i/ik
Bodi 'ertama 8 primary antibody9 %'e%i/ik akan mengikat 'rotein target. Anti #odi 'ertama akan diikat ole$ anti#odi kedua 8 secondary antibody9 untuk 'ro%e% >i%uali%a%i.
2.2 Alat dan Bahan Alat /
Bahan
'& Elektro/ore%i%
(ysis buffer
& Blotting
#olyacrylamide gel
*& +eader
+unning buffer ransfer buffer TBST4PBST Blocking solution !hemiluminescence agent&
2." Langah%langah &e(tern Blot
Pro%e% :e%tern #lot mem#utu$kan #e#era'a langka$ k$u%u%< (aitu 1. Ta$a' 'er%ia'an 2. Elektro/ore%i% 8S*S-PA0E9 3. Tran%/er 'rotein4 Blotting . *etek%i 'rotein dengan anti#odi . Blocking membrane . *etek%i 'rotein target
Ga$'ar 2." &e(tern 'lot workflow
BAB II &ESTERN BLOT 0 PERSIAPAN SAMPEL
".1 Sa$)el
Per%ia'an %am'el :e%tern #lot meli'uti 'em#uatan lysis buffer dan 'er%ia'an l(%ate dari aringan atau kultur %el. '& (ysis buffer (ysis buffer memiliki kemam'uan (ang #er#eda-#eda untuk melarutkan 'rotein. Kemam'uan anti#odi untuk mendetek%i 'rotein target $aru% menadi 'ertim#angan utama dalam memili$ eni% lysis buffer (ang akan di'akai. Ta#el 3.1 !oka%i 'rotein dan l(%i% buffer yang cocok !oka%i 'rotein Seluru$ %el Sito'la%ma 8 soluble9 Sito'la%ma 8terikat 'ada %ito%keleton9 Protein mem#ran In %el Mitokondria
Bu//er (ang %e%uai P-= Tri%-5l Tri%-Triton P-= atau RIPA RIPA RIPA
2. Protea%e in$i#itor Pada %aat 'ro%e% li%i% #erlang%ung< dimulai uga 'ro%e% proteolysis& 5al ini da'at di$am#at dengan cara menem'atkan %am'el dalam e% atau %u$u = dan menam#a$kan 'rotea%e in$i#itor A'ro nin 81= mg4m!9. leu'e' n< a+ 8Sodium -anadate), PMS.
".2 Per(!a)an Prote!n Lysate dar! ar!ngan dan Kultur Sel
3.2.1 Pro%edur Tekni% Ek%trak%i Protein & *enatura%i Protein 1. )aringan 4 issue Mem'er%ia'kan aringan 8%am'el9 %e#e%ar C 1?2 mm -
*i'otong
menadi
ukuran
kecil
menggunakan
gunung
atau
cutter.
menggunakan nitrogen cair dikeringkan dan ditum#ukD menggunakan gun extractor
-
Sam'el (ang tela$ di'otong le#i$ kecil dima%ukkan kedalam microtube 1< m!
-
*itam#a$kan 2 L lysis buffer, di$omogenkan menggunakan $omogenier
-
*i%entri/uga%i %elama menit 'ada kece'atan mak%imal 81.=== r'm413.3== r'm9
-
*i'inda$kan %u'ernatan kedalam microtube =< m! #aru
Su'ernatan -
*ima%ukkan %e#an(ak 1 ! kedalam microtube =< m!
-
*itam#a$kan 1 ! sample buffer 8dengan 'er#andingan 119
-
*i'ana%kan 'ada %u$u @-1= = %elama menit. Setela$ %ele%ai< lang%ung di%im'an diata% e% %elama 2-3 menit.
-
Sam'el %ia' untuk di-loading ke gel dalam 'ro%e% elektro/ore%i%.
Pro%edur %eder$ana ek%trak%i 'rotein -
Tam#a$kan RIPA buffer 8:it$ protease inhibitors9 kedalam %am'el aringan< dan $omogena%i %ecara #aik.
-
Pinda$kan kedalam microtube 1< m!< dan inku#a%i 3= menit diata% e%.
-
Sentri/uga%i 1= menit = dengan kece'atan 1=.=== 0
-
Pinda$kan %u'ernatan kedalam microtube =< m! #aru
-
,kur kon%entra%i dengan BS
-
Sim'an %am'el di free%er -7==
0am#ar 3.1 5a%il ek%trak%i 'rotein #eru'a enda'an dan %u'ernata
2. Kultur %el 8in>itro %am'el9 -
Per%ia'an lysis solution di%e%uaikan dengan umla$ well dalam plate 81== ! 'er well untuk 2 well. 2== ! 'er well untuk 12 well. == ! 'er well untuk well plate)
-
(ysis solution terdiri dari lysis buffer 8dengan 1 mM *TT< '$o%'$ata%e in$i#itor dan 'rotea%e in$i#itor9 dan 2? sample buffer&
Mi%al di#utu$kan 2.== ! lysis solution F 1.2= ! lysis buffer G 1.2= ! sample buffer Pro%edur -
uci plate dua kali menggunakan 1 ? PBS
-
Scrap
menggunakan
'
atau scrap
cell
dan
re%u%'en%i
dengan
menggunakan lysis solution -
*i'ana%kan 'ada %u$u @-1== %elama menit. Setela$ %ele%ai< lang%ung di%im'an diata% e% %elama 2-3 menit 8 snap free%e9
-
Sam'el %ia' untuk di-loading ke gel dalam 'ro%e% elektro/ore%i%.
".2.2 Penguuran Kon(entra(! Prote!n
Pengukuran kon%entra%i 'rotein da'at dilakukan dengan menggunakan '& Brad/ord assay ,i Brad/ord adala$ %uatu ui untuk mengukur kon%entra%i 'rotein total dengan %ecara kolorimetri dalam %uatu larutan. !oomassie Brilliant Blue 8BB9 (ang #erikatan dengan 'rotein dalam %uatu larutan (ang #er%i/at a%am %e$ingga mem#erikan :arna
8ke#iruan9.
Peru#a$an
:arna
ter%e#ut da'at
diukur
a#%or#an%in(a dengan menggunakan %'ektro/otometer 'ada 'anang gelom#ang -@ nm -
Reagen Brad/ord =<=1 g !oomise Brilian Blue 8BB9 0-2= dilarutkan dalma m! etanol @H 8>4>9< lalu ditam#a$kan 1= m! a%am /o%/or 7H 8>4>9. Sim'an dalam #otol gela' dan 'ada =. Stok #ia%an(a mem#utu$kan 'engenceran kali.
-
!arutan standar protein/ =<=1 g BSA 8 Bo$ine Serum 0lbumin9 dalam 1= m! 52" %teril %e$ingga di'erole$ larutan %tok BSA dengan kon%entra%i 1.=== ''m dan kemudian dilakukan %erial dilu%i untuk menadi 'rotein %tandar. *ari larutan %tok ter%e#ut dilakukan 'engukuran ter$ada' %tandar 'rotein terlarut dengan kon%entra%i =< 1=< 2=< 3=< =< =< =< 6=< 7=< @= dan 1== ''m.
0am#ar 3.2 Kur>a %tandar untuk 'emeri%kaan Brad/ord
& Metode !o:r( Ada #e#era'a metode (ang #ia%a digunakan dalam rangka 'enentuan kon%entra%i 'rotein< (aitu metode Biuret< !o:r(< dan lain %e#again(a. Ma%ingma%ing metode mem'un(ai kekurangan dan kele#i$an. Pemili$an metode (ang ter#aik dan te'at untuk %uatu 'engukuran #ergantung 'ada #e#era'a /aktor %e'erti mi%aln(a< #an(akn(a material atau %am'el (ang ter%edia< :aktu (ang ter%edia untuk melakukan 'engukuran< alat %'ektro/otometer (ang ter%edia 8+IS atau ,+9. Reagen 'endetek%i gugu%-gugu% /enolik %e'erti reagen olin dan iocalteu tela$ digunakan dalam 'enentuan kon%entra%i 'rotein ole$ !o:r( 81@19 (ang kemudian dikenal dengan metode !o:r(. *alam #entuk (ang 'aling %eder$ana reagen olin iocalteu da'at mendetek%i re%idu ro%in 8dalam 'rotein9 karena kandungan /enolik dalam re%idu ter%e#ut mam'u mereduk%i /o%/otung%at dan /o%/omoli#dat< (ang meru'akan kon%tituen utama reagen olin iocalteu< menadi tung%ten dan moli#denum (ang #er:arna #iru. 5a%il reduk%i ini menunukkan 'uncak a#%or#%i (ang le#ar 'ada daera$ mera$. Sen%i>ita% dari reduk%i ini menunukkan 'uncak a#%or#%i (ang le#ar 'ada daera$ mera$. Sen%i>itia% dari metode olin iocalteu ini mengalami 'er#aikan (ang cuku' %igni/ikan a'a#ila diga#ung dengan ion-ion u. !arutan !o:r( ada dua macam (aitu larutan A (ang terdiri dari /o%/otung%tat-/o%/omoli#dad 8119 dan larutan !o:r( B (ang terdiri dari aKar#onat 2H dalam a"5 =<1 < tem#aga %ul/at dan a-K-tartat 2H. ara 'enentuann(a %e'erti #erikut 1 m! larutan 'rotein ditam#a$ m! !o:r( B< di$omogenkan dan di#iarkan %elama 1= menit. Kemudian ditam#a$ =< m! !o:r( A di$omogenka dan di#iarkan 2= menit. Selanutn(a diama "*-n(a. *alam metode ini terli#at 2 reak%i. A:aln(a< kom'lek% u 8II9-'rotein akan ter#entuk %e#agaimana metode Biuret< (ang dalam %ua%ana alkali% u8II9 akan tereduk%i menadi u 8I9. ion u 8I9 kemudian akan mereduk%i reagen oliniocalteu< kom'lek% /o%/omoli#dat /o%/otung%tat 8 phosphomolybdotungstate9< meng$a%ilkan heteropoly molybdenum blue aki#at reak%i ok%ida%i gugu% aroma k
8rantai %am'ing a%am amino9 terkatali% u< (ang mem#erikan :arna #iru inten%i/ (ang da'at didetek%i %ecara kolorimetri. Metode !o:r( mengkom#ina%ikan 'ereak%i #iuret dengan 'ereak%i lain 8olin-iocalteau/enol9 (ang #ereak%i dengan re%idu tyrasine dan tryptophan dalam 'rotein. Reak%i ini meng$a%ilkan :arna ke#iruan (ang #i%a di#aca di antara ==-6= nm< tergantung %en%iti>ita% (agn di#utu$kan. Akan muncul 'uncak kecil di %ekitar == nm (ang da'at digunakan untuk menentukan 'rotein dengan kon%entra%i tinggi dan %e#ua$ 'uncak #e%ar di%ekitar 6= nm (ang da'at digunakan untuk menentukan kadar 'rotein dengan kon%entra%i renda$. Bera:al dari 'eman/aatan alat %'ektro/otometer (aitu untuk mengukur umla$ 'en(era'an at %uatu %en(a:a. Pen(era'an ca$a(a 'ada %en(a:a larutan ter%e#ut< dalam %'ektro/otometri da'at digunakan %e#agai da%ar atau 'edoman dalam 'enentuan kon%entra%i larutan atau %en(a:a %ecara kuantitati/. *alam $al ini 'enggunaan KMn" #ertuuan untuk memuda$kan dalam 'engenalan dan lati$an a:al %'ektro/otometri. Kekuatan :arna #iru terutama #ergantung 'ada kandungan re%idu tryptophan dan tyrosine1n(a. Keuntungan metode !o:r( adala$ le#i$ %en%iti/ 81== kali9 dari'ada metode Biuret. Be#era'a at (ang #i%a mengganggu 'eneta'an kadar 'rotein dengan metode !o:r( ini< diantaran(a #u//er< a%am nukleat< gula atua kar#o$idrat< detergen< gli%erol< tricine< E*TA< Tri%< %en(a:a-%en(a:a kalium< %ul/$idril< di%ul/ida< /enolat< a%am urat< guanin< ?ant$ine< magne%ium dan kal%ium. Inter/eren%i agen-agen ini da'at diminimalkan dengan meng$ilangkan inter/eren% ter%e#ut. Sangat dianurkan untuk menggunakan #lanko untuk da'at dielimina%i dengan 'enam#a$an S*S atau melakukan 're'ara%i %am'el dengan 'engenda'an 'rotein. *& Bicinchoninic 0cid 8BA9 assay Bicinchoninic 0cid assay 8BA assay9< dikenal uga Smit$ assay, karena dinamakan #erda%arkan 'enemun(a< Paul K. Smit$. BA adala$ biochemical assay untuk mendetek%i kon%entra%i total 'rotein 8=< g4m! %am'ai 1< mg4m!9< $am'ir miri' dengan lo:r( 'rotein a%%a(< Brad/ord 'rotein assay atau Biuret
reagent& Peru#a$an :arna dari larutan %am'el dari :arna $iau %am'ai ke ungu dan 'eru#a$an ini diukur dengan metode kolorimetri. Stok cam'uran larutan BA A< adala$ %e#agai #erikut dengan kom'onen (ang %angat alkali% dengan '5 11<2 -
Bicinchoninic acid
-
Sodium carbonate
-
Sodium bicarbonate
-
Sodium tartrate
-
!opper 2) sulfate pentahydrate
Ada 2 reak%i utama '& Ikatan 'e'tida dalam 'rotein akan mereduk%i u2G dari copper 8II9 %ul/ate menadi uG 8reak%i ini %angat #ergantung 'ada %u$u9. )umla$ u2G menentukan umla$ 'rotein (ang terda'at dalam larutann(a. Selanutn(a 2 molekul bicinchoninic acid #erikatan dengan ion uG mem#entuk kom'lek (ang #er:arna ungu dan da'at terukur 'ada 'anang gelom#ang 2 nM. & Bicinchoninic acid ,G com'le? di'engaru$i dalam 'rotein ole$ adan(a cysteine3cystine, tyrosine, dan tryptophon side chains& Pada %u$u (ang tinggi 836-==9< kon%entra%i absorption spectra&
3.2.3 *enatura%i Protein airkan %am'el #eku diata% e% dicam'urkan dengan sample buffer dan -ME 8-Merca'toet$anol9 dengan ratio 1@1. onto$ Sample buffer @= ! G ME = !.
0am#ar 3.3 Sample buffer
Se%uaikan kon%entra%i %am'el 'rotein dan %amakan dilu%i 'engalin(a %e#elum di'ana%kan 'ada #lok 'emana% 8heat block 9.
Anti#odi #ia%an(a mengenali %e#agian kecil dari 'rotein target. Bagian ini kemungkinan #erada dalam li'atan 'rotein (ang #er#entuk 3*. ,ntuk memuda$kan detek%i 'rotein menggunakan anti#odi< maka li'atan-li'atan 'rotein itu $aru% di#uka dengan menggunakan %u$u tinggi. ,ntuk 'ro%e% denatura%i 'rotein< tam#a$kan loading buffer dengan Sodium Dodecyl Sulfate 8S*S9 dan di'ana%kan $ingga @-1=== %elama menit. S*S #erikatan dengan 'rotein dan akan mem#erikan muatan negati/ 'ada %emua 'rotein. ,ntuk memutu% rantai ikatan SS 8di%ul/ida9 %e$ingga 'rotein le#i$ %o/t dan muda$ terurai 'ro%e% elektro/ore%i%. ,ntuk meli$at 'e'inda$an 'rotein di dalam gel maka ditam#a$kan 'ula 'e:arna 8conto$D Bromophenol Blue)&
Ga$'ar ".3 Blo Pe$ana( untu denatura(! )rote!n (a$)el
Ada 'er#edaan %u$u antara #lok 'emana% dengan %u$u real (ang terukur 'ada termometer< %e'erti conto$ 'ada gam#ar. Setela$ %ele%ai inku#a%i 'ada #lok 'emana%< %egera dinginkan %am'el diata% e% dan %im'an 'ada = %am'ai akan digunakan %aat elektro/ore%i% 8 snap free%e)&
BAB I&ESTERN BLOT%PERSIAPAN B4FFER
3.1 Per(!a)an Bu++er ,ang D!'utuhan
Bu//er (ang $aru% di'er%ia'kan dengan %ek%ama -
Runn!ng 'u++er 56 1 (olut!on Tr!( 7 $M Gl,#!ne 182 $M SDS 19:
Tri% 3=<3g G 0l(cine 1 g G S*S 1= g G dd5 2" $ingga 1 liter S*S Sodium *odec(l Sul/te -
Runn!ng (olut!on
+unning buffer 8? 1=9 1== m! G dd5 2" @== m! -
Tran(+er 'u++er 56 7 (olut!on:
Tri% 1<=6 g G 4lycine <2 g G dd5 2" $ingga 1 !Iter -
Tran(+er (olut!on
Tran%/er #u//er 8?9 1= m! G Met$anol 2== m! G dd52" = m! -
TBS 561 ); <7:
Tri% 2<22 g G al 76< g G dd52" $ingga @7 m! G 5l 1 m! -
PBS 561:
PBS 1 ta#let G dd5 2" 2== m! -
TBS%T 5T=een 2 19: > PBS%T
TBS 8? 1=9 1== m! G dd5 2" @== m! G T:een 2= 1 m! PBS 8? 19 2== m! G T:een 2= =<2 m!
T:een 2= F #olyoxythylene Sorbitan 5onolaurate
Setela$ 'enam#a$an T:een 2=< $omogenkan< dan tunggu 3=-= menit $ingga gelem#ung udara. -
RIPA buffer
2 mM Tri%-5c! '$ 6<< 1= mM a!< 1H P-=< 1H< Sodium deo?(c$olate< =<1H S*S a l 1= mM
<376 g
E*TA 1 mM
=<112 g
S*S =<1H
=< g
Tri%-5l 81M9 '$ 6< 2 mM 12<
m!
a-deoxycholate 1H
<= g
P-= 1H
<= ml
dd52"
72< m!
RIPA #u//er :orking %olution
-
RIPA #u//er
1= m!
Protea%e in$i#itor cocktail
1 ta#
=<2 M PMS 8*MS"9
= l
Pon#eau S Sta!n!ng (olut!on 5Pon#eau S 19 ? 79 A#et!# a#!d:
Ponceau S =<= g G Acetic acid 2< m! G dd5 2" 6< m!
BAB &ESTERN BLOT%PERSIAPAN PEMB4ATAN GEL
7.1 SDS%PAGE Eletro+ore(!(
Ta$a' kedua dari :e%tern #lot adala$ 'ro%e% (ang #ertuuan untuk memi%a$kan 'rotein menurut #erat molekuln(a menggunakan alat elektro/ore%i%. S!a)an 'u++er ,ang d!'utuhan/
- +unning buffer 81? 1= solution9 -
ransfer buffer 8? solution)
-
TBS4PBS< TBS-T4PBS-T Pro%e% 'emi%a$an 'rotein dilakukan dengan cara menem'atkan 'rotein
'ada gel elektro/ore%i%. 0el da'at di#uat dengan #ermacam-macam kon%entra%i %e%uai dengan #erat molekul 'rotein target (agn dicari. Pem#agian elektro/ore%i% gel di#agi menadi dua #agian
0am#ar .1 Po%i%i %e'arating gel dan %tacking gel 'ada gel S*S-PA0E
Ada 2 eni% gel (ang dikenal untuk ek%'erimen :e%tern #lot 1. #recast gel/ di#uat ole$ 'a#rik dan %ia' digunakan. 2. Home made gel/ 0el (ang di%ia'kan dan di#uat %endiri ole$ 'eneliti.
Pro%edur tekni% mem#uat gel 3. Semua gel (agn digunakan terdiri dari 2 #agian. Su%un %emua material (ang di#utu$kan dengan ra'i %e'erti 'ada gam#ar.
0am#ar .2 Separating Buffer dan stackign buffer, temed dan acrylamide di dalam #o? e%
. Ber%i$kan kaca dengan menggunakan metanol4'ro'anol untuk meng$ilangkan (ang menem'el (ang da'at menurunkan kualita% dari gel. Su%unla$ kaca %e%uai dengan tatanan (ang di'erlukan dengan menata kaca #agian kecil dan #e%ar dengan #agian kecil meng$ada' ke de'an. Mo$on di cek dengan 'a%ti angan %am'ai #ocor. Po%i%i $older kaca< dan karet 'ena$an $aru% 're%i%i< ika tidak akan #ocor dan gel menadi miring ke#ocoran. Kunci dengan ra'at
0am#ar .3 Peralatan untuk mem#uat home made gel
0am#ar . Karet 'ena$an #agian #a:a$
0am#ar . 5older kaca (ang digunakan untuk mem#uat $ome made gel
. 0el :e%tern #lot memiliki 2 #agian ') Stacking gel Berada
'ada
#agian
ata%
dari
gel.
ung%in(a
untuk
mengkon%entra%ikan 'rotein dalam %atu 'ita 8band 9 %e$ingga %eluru$ 'rotein %am'el akan mulai ter'i%a$ %ecara #er%amaan. ) Separating gel Berada 'ada #agian #a:a$ gel. Ber/ung%i untuk memi%a$kan 'rotein #erda%arkan #erat molekuln(a. Protein dengan #erat molekul tinggi akan
#erada 'ada #agian ata% gel %ementara 'rotein dengan #erat molekul renda$ akan tertarik le#i$ ce'at. Peneliti di%arankan untuk mencari in/orma%i mengenai #e%aran 'rotein target dan memili$ 'er%enta%e gel (ang akan di#uat %e%uai dengan #erat molekul 'rotein target. Tabel 5.1 Rekomendasi persentase gel terhadap ukuran protein yang akan dianalisis
,kuran 'rotein -= k*A 12- k*A 1=-6= k*A 1-1== k*A 2-1== k*A
Per%enta%e gel 2=H 1H 12<H 1=H 7H
. Te% menggunakan air untuk mendetek%i ke#ocoran dan %etela$ itu #uang air keluar dan ma%ukkan %i%ir gel< kemudian gam#ar gari% luru% menggunakan %'idol %etinggi 1 cm di #a:a$ dari #agian #a:a$ %i%ir gel 8'ada gam#ar-gari% #er:arna mera$9
Ga$'ar 7.@ 0ari% luru% 'em#ata% antara separating gel dan stacking gel
menggunakan %'idol
6. Buat dan %ia'kan cam'uran untuk separating gel, ma%ukkan TEME* dan 1=H APS terak$ir %etela$ 'o%i%i kaca gel %ia'. Setela$ tercam'ur dengan #aik< ma%ukkan ke dalam antara kedua kaca %am'ai %etinggi gari% #ata%. Kemudian ma%ukkan 3 ml i%o'ro'anol4metanol4air untuk mem#uat #agian separating menadi gari% luru%. Tunggu %elama -1= menit %am'ai %i%a cam'uran separating gel di dalam gela% kimia mem#eku. Buang keluar i%o'ro'anol4 metanol4air. Selanutn(a tam#a$kan TEME* dan 1=H APS ke cam'uran stacking gel& am'ur dengan #aik dan ma%ukan kedalam kaca antara %am'ai memenu$i #ata% ata% kemudian ma%ukan %i%ir gel %e%uai dengan keinginan 8 sisir untu 1=< 1< 2= %umur %am'el9 dan kem#ali tunggu %am'ai %i%a cam'uran stacking gel didalam gela% kimia mem#eku 8%ekitar -1 menit9.
0am#ar .6 0ari% #ata% antara separating gel dan stacking gel
7. Setela$ %ele%ai keluarkan dari ka%et 'ene'it dan #ungku% dalam ti%%ue #a%a$ dan ma%ukan kedalam 'la%tik dan di%im'an dalam = %am'ai digunakan 8lama 'en(im'anan (ang dianurkan 3- $ari9.
7.2 ontoh Pro(edur Pe$'uatan Gel untu SDS%PAGE
onto$ 'er%ia'an gel 1=H '& Separating gel 1=H di#uat dengan cara -
Sia'kan gela% kimia = m!
-
Ma%ukkan 2<76 m! air mili-J
-
Ma%ukkan 2<31 m! polyacrilamide 3=H< $omogenkan
-
Ma%ukkan 1<6 m! resol$ing buffer, $omogenkan
-
Ma%ukkan 6= ! S*S 1=H< $omogenkan
-
Ma%ukkan = ! APS 1=H< $omogenkan
-
Ma%ukkan 7 ! TEME*< $omogenkan
-
Segera tuang larutan kedalam 'late 'em#entuk gel menggunakan mikro'i'et 1 ml 8diaga angan %am'ai ter#entuk gelem#ung udara9 %am'ai #ata% gari% (ang terda'at 'ada plate
-
Perla$an tam#a$kan air diata% larutan gel dalam plate agar 'ermukaan gel tidak #ergelom#ang.
& Biarkan gel memadat %elama kurang le#i$ 3= menit 8ditandai dengan ter#entukn(a gari% tran%'aran diantara #ata% air dan gel (ang ter#entuk9 %etela$ itu< air (ang menutu'i separating gel di#uang. *& Setela$ separating gel memadat< stacking gel H di%ia'kan dengan cara (ang %ama 'ada 'ro%edur diata% dengan >olume larutan -
Air Mili-J 1<61 m!
-
#olyacrilamide 3=H =<1 m!
-
Stacking buffer =<6 m!
-
SDS 1=H 3= !
-
0#S '67 2 !
-
TEME* !
8& Kemudian tuang stacking gel& 9& Pa%ang %i%ir tem'at mema%ukkan %am'el< kemudian #iarkan #e#era'a lama $ingga gel memadat. :& !e'a% %i%ir ;& 0el dalam plate di'a%ang 'ada alat elektro/ore%i% <& Tuang 1? running buffer %e#an(ak 7== m!.
BAB -I &ESTERN BLOT%ELEKTROFORESIS
@.1 Gel Eletro+ore(!(
(oading3 i%i lu#ang-lu#ang 'ada S*S-PA0E dengan umla$ 'rotein (ang %ama 8%etela$ diukur menggunakan tekni Brad/ord atau #erda%arkan ke%e%uaian umla$ lysis buffer (ang digunakan9. Pada lu#ang 'ertama< i%i dengan 'rotein marker (ang akan menunukkan #erat molekul 'rotein.
0am#ar .1 onto$ 'rotein marker dan %am'el 'ada S*S-PA0E
.1.1 Pro%edur Elektro/ore%i% Inek%i %am'el dan running / '& Pa%ang gel kedalam dudukan elektro/ore%i%< ma%ukkan 1? running buffer %am'ai menutu'i 'ermukaan gel %e%uai #ata% (ang dianurkan. & Sam'el 8$a%il denatura%i 'rotein9 dima%ukkan 1=-1 ! kedalam %umur S*S gel (ang tela$ di%ia'kan. *& Atur >olta%e kontrol running S*S-PA0E %elama 3= menit dengan tegangan 7= + teru%kan %am'ai %emua %am'el terkum'ul 'ada #ata% #a:a$ stacking gel& 8& Setela$ %am'el mema%uki #ata% separating gel, naikkan >olta%e %ecara #erta$a' ke 1== +< 12= + $ingga 1= + dan lanutkan %elama 1 am %am'ai %am'el men(entu$ da%ar gel.
0am#ar .2 Elektro/ore%i% S*S-PA0E
Pro%edur tekni% elektro/ore%i% S*S-PA0E 1. Pa%angkan gel kedalam alat elektro/ore%i% dalam 'o%i%i (ang #enar dan keluarkan %umur %am'el. Kunci dengan #enar dan ra'i.
0am#ar .3 Alat elektro/ore%i% S*S-PA0E
2. Perik%a %etia' %udut kunci dan 'a%tikan terkunci dengan #aik dan tidak #ocor< Setela$ mema%tikan tidak ada (ang #ocor< ma%ukkan %am'el -1 ! %etia' %umurn(a ma%ukkan ladder 'rotein %e#an(ak 3- ! 'ada %umur (ang 'aling kanan atau kiri %e#agai marker& Tutu' dan %am#ungkan li%trik 'ada >olta%e 7= + %elama 2= menit.
0am#ar . Bagian %udut alat elektro/ore%i% S*S-PA0E dalam keadaan terkunci
3. Setela$ men(entu$ #agian separating gel 8%ekitar 2= menit9< naikkan >olta%e ke 1= +< dan lanutkan elektro/ore%i% %elama 1 am %am'ai men(entu$ #agian #a:a$ dari gela% gel.
0am#ar . Sam'el 'rotein 8#er:arna #iru9 'ada separating gel
. )alankan elektro/ore%i% %am'ai gari% %am'el men(entu$ #agin #a:a$ dari gela gel
0am#ar . Sam'el 'rotein 8#er:arna #iru9 #erada 'ada #agian #a:a$
@.2 Tran(+er Prote!n> Blotting
Mem#ran (ang di'akai untuk :e%tern #lot #i%a #eru'a "itrocellulose 2"!) membrane atau #oly$inylidene difluoride 8P+*9. atatan untuk %ediaan P+* Sediaan mem#ran di%im'an P+* dalam keadaan tidak akti/. ,ntuk mengakti/kann(a< mem#ran P+* direndam dalam larutan metanol %elama 1 menit kemudian dicuci dengan menggunakan transfer buffer& Tran%/er 'rotein da'at dilakukan dengan tiga cara '& =et blot
0am#ar .6 Alat tran%/er 'rotein wet blot & Semi dry blot
0am#ar .7 Alat tran%/er 'rotein %emi dry blot
*& Dry blot
0am#ar .@ Alat tran%/er 'rotein dry blot .2.1 Pro%edur Tran%/er Protein4blotting
0el $a%il S*S-PA0E -
*itran%/er menggunakan alat Blotting dengan mem#uat >sandwich? dengan urutan %e#agai #erikut
Katoda 8-9 Sponge pad 8ka%a9 Filter paper 8kerta% %aring9 4el 5embrane 8%e#elumn(a di#a%a$i dengan metanol 'a. dan transfer buffer filter paper) sponge pad Anoda5?:
Keterangan Sponge pad, filter paper, dan membrane direndam terle#i$ da$ulu dalam tran%/er #u//er. -
(alakan alat blotting %elama 3= menit< 2== mA
Ke#er$a%ilan 'ro%e% tran%/er da'at dicek dengan menggunakan Ponceau S staining, %etela$ 'ro%e% tran%/er 'rotein dari gel ke mem#ran %ele%ai< staining #er%i/at re$ersible& Ponceau S da'at di$ilangkan dengan mencuci mem#ran menggunakn =<1 a"5 %elama 1 menit. Pro%edur tekni% tran%/er 'rotein4blotting/ '& Ba%a$i ka%a dengan 1? transfer buffer (ang %uda$ diencerkan dari 1=? transfer buffer ditam#a$ denga metanol 2=H 8li$at lam'iran9
0am#ar .1= Ka%a 8 sponge pad) di#a%a$i dengan 1 ? tran%/er #u//er & !etakkan urutan dengan #enar< filter paper 82 lem#ar9< dan #a%a$i kem#ali dengan 1 ? transfer buffer&
0am#ar .11 Filter 'a'er diletakkan diata% ka%a
*& Setela$ %ele%ai 'ro%e% elektro/ore%i% 8gari% %am'el men(entu$ #agian #a:a$ gel9< #uka gela% kaca< 'i%a$kan kaca dan 'otong gel di 'er#ata%an stacking gel dan separating gel&
0am#ar .12 0el $a%il elektro/ore%i% S*S-PA0E
8& Buang dengan $ati-$ati #agian %tacking gel menggunakan scraper 'la%tik.
0am#ar .13 Bagian stacking gel di#uang menggunakan scraper 'la%tik. 9& Balikkan 'ermukaan kaca dengan gel meng$ada' ke 'ermukaan mem#ran< tekan ke #a:a$ #agian gel 'erla$an %am'ai men(entu$ 'ermukaan filter paper (ang %uda$ di#a%a$i ole$ 1? transfer buffer&
0am#ar .1 ara meletakan gel 'ada filter paper :& Secara 'erla$an gerakan kaca menau$ dari gel %am'ai %eluru$ 'ermukaan gel menem'el 'ada filter paper&
0am#ar .1 ara mele'a%kan kaca dari gel (ang menem'el
;& Buka mem#ran P+* dengan $ati-$ati< angan %entu$ #agian mem#ran< 'egang mem#ran menggunakan 'em#ungku%n(a.
0am#ar .1 ara memegang mem#ran P+*
<& Pegang dengan menggunakan kedua tangan dan letakan te'at diata% gel
0am#ar .16 ara meletakkan mem#ran P+* diata% gel
@& !etakkan kem#ali kerta% /ilter 82 lem#ar9< gunakan roller untuk mema%tikan tidak ada ruangan udara (ang tere#ak diantara mem#ran dengan gel< mem#ran dengan filter paper, 'a%tikan %etia' menaru$ layer %iramkan 1? transfer buffer diata%n(a.
0am#ar .17 Pro%e% rolling untuk meng$ilangkan udara (ang tere#ak diantara mem#ran dan gel
'6& Terak$ir letakkan filter paper di la'i%an (ang 'aling ata% dan lakukan rolling lagi 8lakukan dengan 'erla$an namun merata %aat melakukan rolling)
0am#ar .1@ Pro%e% rolling 'ada ka%a /ilter
''& !i'at dengan #aik dan kunci 8angan %am'ai sandwich mem#ran dan gel keluar dari ka%et9. Re>ie: & angan %am'ai ter#alik %u%unan sandwich mem#ran.
0am#ar .2= Ka%et #eri%i sandwich mem#ran gel dalam 'o%i%i terkunci
'& Ma%ukkan ka%et (ang %uda$ #eri%i sandwich mem#ran gel ke tem'at di dalam alat blotting& 5ati-$ati dengan ara$ mema%ang< 'a%tikan negati/ di ara$ negati/ dan 'o%iti/ di ara$ 'o%iti/. 0unakan stylus magnetic untuk men(e#arkan 'eningkatan tem'eratur %elama blotting dan angan lu'a mema%ukkan e% 'ada tem'at (ang %uda$ di%ediakan.
0am#ar .21 ara mema%ukkan ka%et #eri%i sandwich mem#ran gel ke dalam alat blotting
'*& Tam'ak dari ata%< %etela$ di%u%un #erurutan. Ma%ukkan 7== m! 1? transfer buffer dan %ia' untuk di-running 'ada 2== mA %elama minimal 1 am.
0am#ar .22 Po%i%i ka%et sandwich mem#ran gel dari ata% alat blotting '8& Po%i%i alat diata% magnet styler, dan #iarkan men(ala
0am#ar .23 Pro%e% tran%/er 'rotein4blotting
'9& Pi%a$kan gel dan mem#ran< 'a%tikan marker %uda$ #er'inda$ ke mem#ran P+* dan gel terli$at #ening tran%'aran
0am#ar .2 5a%il 'ro%e% tran%/er 'rotein4#lotting
':& Inku#a%i dengan Ponceau S staining #i%a dengan atau tan'a mixer %elama 1- menit. Kemudian cuci dengan air #er%i$ %e#an(ak 1 kali menit.
0am#ar .2 Pro%e% Ponceau S. staining
0am#ar .2 5a%il Ponceau S staining
';& 0unting mem#ran %eukuran (ang diinginkan untuk meng$emat 'enggunaan anti#odi %aat inku#a%i dengan anti#odi 'rimer dan anti#odi %ekunder. Kemudian cuci dengan menggunakan TEST4PBST %e#an(ak 3 kali %elama menit.
@." Dete(! Prote!n dengan Ant!'od!
1. Anti#odi 'ertama 8 primary antibody9 dilarutkan ke dalam blocking solution 8da'at di#uat dari %u%u %kim atau'un BSA9. Inku#a%i mem#ran dengan anti#odi 'ertama da'at dilakukan %elama 1 am 'ada %u$u ruangan atau'un o$ernight 'ada %u$u =. 2. Setela$ inku#a%i< mem#ran dicuci dengan cairan TBST4PBST %e#an(ak 3 kali< ma%ing-ma%ing %elama menit. !ampuran blocking solution dengan antibodi pertama dapat disimpan pada suhu 86! selama minggu untuk dapat digunakan kembali& Kemudian< lakukan inku#a%i mem#ran dengan anti#odi kedua 8 secondary antibody9 %e%uai dengan $a%il o'tima%i atau rekomkenda%i 'engenceran (ang 'eru%a$aan 'em#uat. Inku#a%i dilakukan %elama 1 am dalam %u$u ruangan diikuti dengan ta$a' 'encucian dengan TBST4PBST %elama menit %e#an(ak
3 kali. Anti#odi kedua ini #ia%an(a #erikatan dengan molekul fluoresce atau enim %e'erti 0lkaline #hosphatase 8AP9 atau Horseradish #eroxidase 85RP9. ara detek%i (ang 'aling %ering digunakan adala$ dengan menggunakan enim AP atau 5RP.
@.".1 Pro(edur Ten!( Dete(! Prote!n dengan Ant!'od! 1. Pro%e% blocking mem#ran dengan menggunakan blocking solution k$u%u%
dengan kon%entra%i 1-H dalam TBST4PBST 'ada %u$u ruangan %elama = menit.
0am#ar .26 Pro%e% blocking mem#ran menggunakan blocking solution
2. Setela$ %ele%ai 'ro%e% blocking, cuci mem#ran dengan TBST4PBST %elama
menit dan dilakukan #erulang %e#an(ak 3 kali. ". Tam#a$kan primary antibody solution 8dilu%i %e#an(ak 1.=== %am'ai 2.===
kali< tergantung ke'ada keterangan anti#odi dari 'eru%a$aan9< kemudian taru$ dalam me%in 'engocok atau shaker dan inku#a%i 3 (e$ala$ 5overnight : 3. uci dengan #u//er TBST atau PBST 519: (ela$a (e'an,a " al! 7 $en!t. 7. Kemudian langka$ %elanutn(a tam#a$kan secondary antibody solution
8 secondary antibody %angat kuat %e$ingga dilu%in(a $aru% le#i$ #e%ar 1=.=== %am'ai 1.=== kali dilu%i9< kemudian diinku#a%i 'ada (uhu ruangan (ela$a 1 *a$. @. uci dengan #u//er TBST>PBST (ela$a (e'an,a " al! 7 $en!t. <. *etek%i 'ita 'rotein dengan mereak%ikan dengan chemiluminescence reagent
di#a:a$ me%in 'endetek%i< #i%a menggunakan %i%tem 'anang gelom#ang< %i%tem 'endetek%ian infrared, atau menggunakan /ilm negati/.
0am#ar .27 Ta$a' 'e:arnaan imunologi dengan anti#odi
@.3 Dete(! Prote!n Target
Mem#ran
didetek%i
dengan
#er#agai
cara
%e'erti
kolorimetri<
chemiluminescence atau fluorescence&
0am#ar .2@ Prin%i' detek%i 'rotein 'ada :e%tern #lot
!hemiluminescence akan muncul %aat %u#%trat kimia dikatali%a%i ole$ enim 8AP atau 5RP9< dan meng$a%ilkan ca$a(a %e#agai 'roduk tam#a$an. a$a(a ini akan ditangka' ole$ ?-ra( /ilm atau !harge1coupled De$ice 2!!D) imager& Keuntungan %i%tem chemiluminescence di#andingkan dengan metode lain adala$ %i%tem detek%i (ang ce'at dan %en%iti/. ..1 *etek%i %ecara Kolorimetri Bergantung 'ada inku#a%i :e%tern #lot mem#ran dengan menggunakan %u#%trat (ang #ereak%i dengan reporter en%yme 8conto$n(a 'erok%ida%e9 (ang akan #erikatan dengan secondary antibody& Reak%i ter%e#ut akan meru#a$ 'e:arna terlarut menadi :arna (ang #er#eda dan akan me:arnai mem#ran. *engan mencuci dengan #u//er maka akan mem#er%i$kan mem#ran dari 'e:arna. Kon%entra%i 'rotein akan diukur %ecara den%itometri atau %'ektro/otometri.
..2 *etek%i %ecara !hemiluminescence Bergantung 'ada inku#a%i dengan %u#%trat (ang #erlumina%i ketika diek%'o% 'ada re'orter anti#odi %ekunder. *i#utu$kan kamera dan me%in k$u%u% 8* kamera9 (ang da'at mengangkat gam#ar digital dari :e%tern #lot mem#ran atau /ilm negati/.
0am#ar .3= Sala$ %atu ti'e gel documatation machine
0am#ar .31 nfrared detection system machine
..3 *etek%i %ecara Radioakti/ Penggunaan /ilm negati/ dalam :e%tern #lot 'erla$an mulai ditinggalkan karena ke%ulitan dalam menda'atkan 'er$itungan kuanti/ika%i (ang akurat. Mendetek%i menggunakan radioakti/ tidak memerlukan substrate en%yme, teta'i dengan menggunakan media /ilm ?-ra(< %uda$ mulai #an(ak ditinggalkan karena %am'a$ (ang #er#a$a(a #agi ke%e$atan (ang ditim#ulkan aki#at 'enggunaan metode ini.
0am#ar .32 *etek%i menggunakan /ilm negati/ 8%ecara radioakti/9
.. *etek%i %ecara fluorescence Pro#e (ang %uda$ dila#el fluorescence agent kemudian diek%ita%i ole$ ca$a(a dan emi%i ek%ita%in(a di detek%i ole$ /oto%en%or %e'erti * kamera. Teknik fluorenscence
%ecara
kuanti/ika%i
kurang
%en%iti/
di#andingkan
chemiluminescence& onto$ $a%il >i%uali%a%i dari :e%tern #lot da'at dili$at dari gam#ar #erikut ini
0am#ar .33 *etek%i 'rotein target dengan chemiluminescence 8Ronn(< et al. Endocrinolog(< 2=19
0am#ar .3 !hemiluminesence reagent #ia%an(a terdiri dari reagen A dan B
BAB -III &ESTERN BLOT%ANALISIS ;ASIL
<.1 I$age%
Setela$ menda'atkan gam#aran 'rotein le>el ek%'re%i< kita $aru% meng$itung density 'rotein (ang kita teliti. Sala$ %atu dari %ekian #an(ak software anali%i% data /oto :e%tern adala$ Image-). So/t:are ini grati%< dan muda$ dalam 'engo'era%iann(a. Image-) 8$tt'44r%#.in/o.ni$.go>4ii49 adala$ %ala$ %atu Auantitati$e image analysis tool (ang $andal dan %angat #erguna dalam dunia ri%et. Freeware (ang dikem#angkan dengan #a%i% #a$a%a 'emrograman a>a ini memiliki umla$ 'engguna (ang ter#ilang #an(ak dan latar #elakang keilmuann(a 'un #eragam< %e#ut %aa bio science, material, fluid mechanics adala$ #e#era'a conto$n(a.
0am#ar 6.1 Tam'ilan %o/t:are Image-)
Tam'ilan menu utama Image-) ini dikem#angkan 'ertama kali ole$ in%titu%i ri%et ke%e$atan ternama di Amerika (aitu acional In%titute o/ 5ealt$ 8I59. A'lika%i ini uga mendukung multi operation system platform 8!inu?< Mac< dan Windo:%432 dan #it9. Image-) da'at digunakan untuk /ung%i-/ung%i da%ar 'engola$an citra (ang %angat #erguna< %e'erti binary operation, first order image processing %e'erti $i%togram< image measurement, fast fourier transform 8T9 %erta ma%i$ #an(ak lagi (ang lain. Tidak ter#ata% 'ada ter%edian(a /ung%i-/ung%i da%ar 'engola$an citra< terima ka%i$ 'ada #an(akn(a 'engem#ang a'lika%i ini< tidak %edikit /ung%i-/ung%i 'engola$an citra tingkat lanut 'un ter%edia< %e'erti particle image $elocimetry 8PI+9 (ang #an(ak digunakan ole$ orang-orang (agn menekuni #idang ek%'erimental mekanika /luida.
!ink
untuk
$tt'44r%#.in/o.ni$.go>4ii4do:nload.$tml
mendo:nload
Image-)
BAB -III &ESTERN BLOT%TRO4BLE S;OOTING
Ma%ala$ (ang %ering di$ada'i 'ada %aat :e%tern #lot '& Tidak ada band & 0am#aran band tidak ela% 8%in(al lema$9 *& Extra band 8& High background 9& Diffuse band :& Band #er:arna 'uti$ ;& Bintik-#intik gelem#ung 'ada mem#ran
8.1. Tidak ada Band
Perma%ala$an Anti#odi
Saran Anti#odi memiliki kemam'uan (ang renda$ untuk mengikat 'rotein target. *i%arankan untuk meningkatkan 'rotein 82- kali li'at le#i$ tinggi dari'ada kon%entra%i a:al9 Anti#odi ke$ilangan akti>ita%.
)umla$ 'rotein (ang
Kon/irma%i dengan *ot Blot Tam#a$kan umla$ 'rotein (ang ditaru$ di dalam gel.
tidak cuku'
Kon/irma%i ke#eadaan 'rotein dengan metode lain. 0unakan kontrol 'o%iti/ 8'rotein rekom#inan< cell line
5a%il tran%/er #uruk Se#agian
atau %el (ang di#eri 'erlakuan k$u%u%9. Ba%a$i P+* mem#ran dengan
metanol<
atau
nitrocellulosemembrane dalam tran%/er #u//er. 'rotein Tam#a$ :aktu tran%/er.
tertinggal 'ada %aat Protein dengan #erat molekul tinggi mem#utu$kan :aktu tran%/er
le#i$ lama untuk ditran%/er ke mem#ran. ,ntuk
mema%tikan
'ro%e%
tran%/er
tela$
#eralan
mak%imal< :arnai mem#ran dengan Ponceau S< Amido Black atau Indian Ink.
">er tran%/er
Kurangi >olt atau :aktu tran%/er untuk 'rotein dengan
Titik i%oelektrik @
#erat molekul renda$. 0unakan #u//er lain (ang mengandung '5 tinggi %e'erti
Anti#odi kedua (ang
APS 8'5 1=<9. Kon/irma%i host species dari anti#odi dan 'e Ig0 dari
tidak %e%uai Pen(im'anan
anti#odi 'ertama ek tanggal kadalu:ar%a.
anti#odi terlalu lama Pen(im'anan
Pe%anan #odi (ang #aru Ikuti 'etunuk 'en(im'anan anti#odi (ang di#erikan
anti#odi (ang tidak 'eru%a$aan. te'at Kontamina%i Sodium
Pa%tikan #u//er tidak mengandung Sodium Aide karena
Aide Waktu
da'at mengganggu %ignal 5RP. inku#a%i Tam#a$ :aktu inku#a%i $ingga 12 am dalam %u$u =
anti#odi
'ertama
terlalu %ingkat .2 Ga$'aran Brand Tidak Jelas (Sinyal Lemah
Perma%ala$an Saran Ikatan anti#odi dan Kurangi umla$ 'encucian dengan TBST. 'rotein lema$
Kurangi kon%entra%i al 'ada blottingbuffer (ang digunakan untuk ta$a' 'encucian mem#ran 8target =<1-
=< M9 anti#odi Reak%i anti#odi ter$ada' 'rotein target renda$.
)umla$
tidak cuku' Tam#a$ kon%entra%i anti#odi 82- kali kon%entra%i a:al9 )umla$ 'rotein tidak Tingkatkan umla$ 'rotein total cuku' Konugat tidak akti/
am'urkan enim dan %u#%trat di dalam tu#e. )ika tidak ada :arna ter#entuk< #erarti reak%i lema$.
E!
lema$
Buat cam'uran #aru atau 'akai reagen (ang #aru atau 0anti dengan E! #aru
%uda$ lama di%im'an Su%u %kim dikenali Kurangi kon%entra%i %u%u dalam blocking solution atau anti#odi 'rotein target
%e#agai ganti dengan 3H BSA.
8.3 !"tra Band
Kemungkinan ma%ala$ Saran Ikatan tidak %'e%i/ik 'ada Kurangi kon%entra%i anti#odi. primary antibody
Kurangi umla$ 'rotein (ang akan dii%i ke dalam gel.
0unakan anti#odi (agn #er%i/at mono%'e%i/ik Ikatan tidak %'e%i/ik 'ada Buat kontrol menggunakan secondary antibody secondary antibody
%aa< ika ma%i$ ada #and maka ganti secondary antibody&
0unakan secondary antibody mono%'e%i/ik Ikatan tidak %'e%i/ik dari Tam#a$kan =<1-=< T:een 2= 'ada larutan primary
atau
secondary primary atau secondary antibody&
antibody
0unakan 2H %u%u %kim 'ada blotting buffer& Se%uaikan
kon%entra%i
anti#odi
dengan cara
menaikkan atau menurunkan kon%entra%i. Tam#a$kan umla$ ta$a' 'encucian. Tam#a$kan kon%entra%i a! 'ada
blotting
buffer (ang digunakan untuk melarutkan anti#odi dan untuk 'encucian. Tam#a$kan kon%entra%i T:een 2= 'ada blotting buffer (ang digunakan untuk ta$a' 'encucian Agrega%i 'ada %am'el
8=<1-=<H9. Tam#a$kan kon%entra%i *TT untuk mema%tikan #erkurangn(a ikatan di%ul/ida 82=-1== mM *TT9 Pana%kan di water bath -1= menit %e#elum dima%ukkan 'ada gel.
!akukan %entri/uga%i %ingkat *egrada%i dari 'rotein (ang Kurangi 'em#ekuan atau 'encairan %am'el. akan dianali%i%
Tam#a$kan
'rotea%e
in$i#itor
%e#elum 'en(im'anan. Kontamina%i reagen
Buat %am'el #aru. ek a'aka$ #u//er terkontamina%i.
'ada
%am'el
Buat reagen #aru. 8.4 #igh Background
Kemungkinan ma%ala$ Saran Ikatan non %'e%i/ik dari 0unakan #odi mono%'e%i/ik. primaryantibody
Tingkatkan kon%entra%i %u%u %kim 'ada blocking buffer 8H9.
Ikatan non
Kurangi kon%entra%i anti#odi %'e%i/ik dari Buat kontrol menggunakan secondary antibody
secondary antibody
%aa< ika ma%i$ ada #and maka ganti secondary
Blocking tidak cuku'
antibody& Mulai dengan kon%entra%i %u%u %kim H< =<1=<H T:een 2=< =<1-=< M< 2 mM Tri% 8'5 6<9. Tam#a$kan :aktu inku#a%i Se%uaikan kon%entra%i. Blocking
o$ernight 'ada
mengurangi
e/i%ien%i
=
akan
karena
kera
%u$u
blocking
detergen terganggu 'ada %u$u renda$
Su%u
%kim
mengandung 0anti dengan 3H BSA
'rotein target Su%u %kim mengandung #io
0anti dengan 3H BSA
endogen (ang tidak cocok dengan a>idin4%tre'ta>idin Pro%e% 'encucian tidak Tam#a$kan ta$a' 'encucian. cuku'
Tingkatkan kon%entra%i T:een2= 'ada wash
buffer 8=<1 & =<H9 Ikatan tidak %'e%i/ik 'ada Tam#a$kan kon%entra%i primary antibody
primary
antibody
dan
al blotting
'ada buffer
larutan (ang
digunakan untuk 'engenceran primary antibody dan ta$a' 'encucian 8rekomenda%i =<1 & =< M9. Kurangi :aktu exposure
)ika %in(al 'rotein target terlalu tinggi< tunggu 1= menit dan /oto ulang. 8.5 $i%use Band
Kemungkinan ma%ala$ Saran )umla$ 'rotein terlalu Kurangi umla$ 'rotein (ang ditaru$ di dalam gel. #an(ak di dalam gel 8. Band Berwarna !utih "#$L method
Kemungkinan ma%ala$ Saran Sin(al (ang ter#entuk Kurangi kon%entra%i dari anti#odi atau 'rotein terlalu #an(ak 8.& Bin'kbin'k dan )elembung pada *embran
Kemungkinan ma%ala$ Kontamina%i reak%i
Saran Perik%a #u//er untuk kemungkinan kontamina%i #akeri.
Buat #u//er #aru. !arutan tidak cuku' 'ada Pa%tikan mem#rane terendam %eluru$n(a 'ada 'ro%e%
inku#a%i
dan 'ro%e% 'encucian dan inku#a%i anti#odi
'encucian Adan(a gelem#ung udara Perla$an %ingkirkan gelem#ung udara. Terutama (ang
ter'erangka'
'ada 'ada ta$a' tran%/er.
mem#ran Kece'atan 'engocokan (ang
Per$atikan kece'atan 'ro%e% 'engocokan dengan
tidak %ama Agrega%i 5RP Exposure terlalu lama
menggunakan rocker atau shoker& 0unakan /ilter untuk men(aring agregat Kurangi :aktu exposure
. Ke(alahan ,ang (er!ng dala$ &e(tern Blot
Ada kemungkinan #a$:a secondary antibody #ereak%i dengan 'rotien (ang tidak diinginkan. Se$ingga $a%il /al%e 'o%iti/.
Teknik (agn tidak o'timal da'at men(e#a#kan adan(a gele$'ung udara 'ada %aat tran%/er 'rotein dari gel ke mem#ran #i%a menim#ulkan gangguan 'ada 'ro%e% inku#a%i dan gambaran band yang tidak elas&
)ika :aktu tran%/er terlalu %ingkat< )rote!n dengan 'erat $oleul t!ngg! aan tert!nggal d! gel.
Kon%entra%i $etanol ,ang terlalu t!ngg! 'ada tran%/er #u//er aan $enurunan e+!(!en(! dari 'ro%e% tran%/er 'rotein dari gel ke mem#ran.
Pro%edur tekni% elektro/ore%i% S*S-PA0E 8in>itrogen9 1. Pa%angkan gel ke dalam tangki dalam 'o%i%i (ang #enar dan keluarkan %i%ir %umur %am'el. Kunci dengan #enar dan ra'i.
Ga$'ar @."7 Alat eletro+ore(!( SDS%PAGE
2. Perik%a %etia' %udut kunci dan 'a%tikan terkunci dengan #aik dan tidak #ocor. Setela$ mema%tikan tidak ada (ang #ocor< ma%ukkan %am'el -1 ! %etia' %umurn(a dan ma%ukan ladder 'rotein %e#an(ak 3- ! 'ada %umur (ang 'aling kanan atau kiri %e#agai market. Tutu' dan %am#ungkan li%trik 'ada >olta%e 7= >lt %elama 2= menit. 3. Setela$ men(entu$ #agian %e'arang gel 8%ekitar 2= min9< naikkan >olta%e ke 1= +< dan lanutkan elektro/ore%i% %elama 1 am %am'ai men(entu$ #agian #a:a$ dari gela% gel.
0am#ar .3 Sam'el 'rotein 8#er:arna #iru9 'ada %e'arang gel
. )alankan elektro/ore%i% %am'ai gari% %am'el men(entu$ #agian #a:a$ dari gela% gel.
0am#ar .36 Sam'el 'rotein 8#er:arna #iru9 #erada 'ada #agian #a:a$ gel
DAFTAR P4STAKA
A#cam. 4eneral western blot protocol, 4uidance for running an efficient and accurate experiment& Ba(er< E. A. and Wilc$ek< M. 1@7=. he use of the a$idin1biotin complex as a tool in molecular biology& Met$od Bioc$em Anal 2< 1-. Blake< M. S< et.al. 1@7. 0 rapid, sensiti$e method for detection of alkaline phosphatase1conugated anti1body on =estern Blots& Anal Bioc$em 13< 1616@. $aiet< !. L Wol/< .). 1@. he properties of strepta$idin, a biotin1binding protein produced by Streptomyces& Arc$ Bioc$em Bio'$(% 1=< 1-. 0allag$er< S. urr. 2==7. mmunoblotting and immunodetection& Protoc. ell Biol< 1=.7.1-1=.7.27. 0ue%don< )-!. et. al. 1@6@. he use of a$idin1biotin interaction in immunoen%ymatic techniAues& ) 5i%toc$em (toc$em 26< 1131-113@. 5a:ke%< R. et. al. 1@72. 0 dot1immunobinding assay for monoclonal and other antibodies& Anal Bioc$em 11@< 12-16 5%u< S. M.< et. al. 1@71. Cse of a$idin1biotin1peroxidase complex 20B!) in immuno1peroxidase techniAues/ a comparison between 0B! and unlabeled antibody 2#0#) procedures& ) 5i%toc$em (toc$em 2@< 66-7=. Kurien< B. T. L Sco/ield< R. 5. 2==3. #rotein blotting/ a re$iew& ) Immunol Met$od% 26 < 1-1. Ronn(< et. al. 2=1. hyroid Hormone S mula on of 0utophagy s Essential for 5itochondrial Biogenesis and 0cti$ity in Skeletal 5uscle& Endocrinolog(. 1681923-37. T$ermo Scienti/ic i%$er. =estern Blot #rotocol& T%ang< +. < et& al& 1@7. En(me-linked immunoelectrotran%/er #lot 8EITB9. In En(me-Mediated Immunoa%%a(. T.T. go and 5.M. !en$o//< ed%. 8e: ork Plenum 're%%9< ''. 37@-1. + Wautot.< et. al. 2===. Expression analysis of endogenous menin, the producti$ity multiple endocrine neoplasia type ' gene, cell lines and human tissue& International )ournal o/ ancer< 789< 766-771.
!AMPIRA 1 Re%e' Bu//er ype Lysis Bu%er Tri%-5l Bu//er
2= mM Tri%-5l< '5 6<
,ntuk da%ar
Tri%-Triton #u//er
mem#uat
#a$an
running
dan
1= mM Tri%< '5 6<
tran%/er #u//er Bia%an(a digunakan
1== mM al
untuk
1 mM E*TA
mengek%trak%i
1 mM E0TA
%ito%keletal 'rotein
tuuan
%'e%i/ik
1H Triton ;-1== 1=H glycerol =<1H S*S P-=
RIPA
#u//er
immuno 0ssay)
8 +adio
#recipitation
=<H deoxycholate 1= mM al
Sito'la%ma< 'rotein
1H P-= 8atau Triton-;9
mem#ran atau
= mM Tri% '5 7.= 1= mM a!
ke%eluru$an 'rotein %el Bu//er ini meru'akan
1H P-= 8atau Triton-;9
'ili$an untuk mengam#il
=<1H S*S
%eluru$ 'rotein %el atau
= mM Tri% '5 7<=
'rotein mem#ran. Teta'i da'at mengganggu interak%i 'rotein< %e$ingga tidak da'at di'akai untuk 'ro%edur imuno're%i'ita%i
!AMPIRA 1 Re%e' Bu//er S$S +,)! !lectrophoresis Bu%er-
Running Bu//er 81=?9
Blotting Bu//er
3 mM S*S 81=<=7 g9
2= mM Tri% 83=<3 g9
1<@2 M 4lycine 81 g9
2 mM Tri% 83<=3 g9
1@2 mM 0l(cine 81< g9
2= mM Tri% '5 6< 82= ml< o/ a 1 ! %olution9
1= mM al 83= m! o/ a M Solution 2 mM Tri% 1@= mM 4lycine 2=H Metanol
Wa%$ing Bu//er
,kur dan %e%uaikan '5 7<3 2 mM Tri% '5 6< 3<1 mM Kl 1= mM al
Blocking Solution Stri''ing Bu//er
=<= T:een 2= 1= m! o/ T-TBS 1? tam#a$kan =< g %u%u %kim 1= m! -merca'toet$anol 2== m! S*S 1=H 136 m! Tri%-5l =< M< '5 <7 Tam#a$kan 52" $ingga >olume menadi 1 !.
!AMPIRA 2. Re%e' S*S-PA0E 0el Ta#el ormula S*S PA0E 0el ,. Separa'ng )el (total 5 ml 3=H Acr(lamide 52" 1< M Tri% 8'5 7<794 Re%ol>ing Bu//er 1=H S*S 1=H APS TEME*
6H 1<1 m! 2<7 m! 1<2 m!
7H 1<33 m! 2<32 m! 1<2 m!
@H 1<= m! 2<1 m! 1<2 m!
1=H 1< m! 1<@7 m! 1<2 m!
12<H 2<=7 m! 1<6 m! 1<2 m!
1H 2<= m! 1<1 m! 1<2 m!
= ! = ! !
= ! = ! !
= ! = ! !
= ! = ! !
= ! = ! !
= ! = ! !
B& Stacking gel
3=H Acr(lamide 52" 1< M Tri% 8'5 7<794 Re%ol>ing Bu//er 1=H S*S 1=H APS TEME*
1 %tack 82 ml9 3= ! 1<3 m! 2= !
2 %tack 8 ml9 7= ! 2<62 m! == !
3 %tack 8 ml9 1.=2= ! <=7 m! 6= !
%tack 87 ml9 1<3 ! < m! 1 m!
2= m! 2= ! 2 !
= m! = ! !
= m! = ! !
7= ! 7= ! 7 !
LAMPIRAN " ontoh ha(!l )enga$'!lan Ga$'ar &e(tern Blot
1.
Kekurangan
Mencuci kurang #er%i$ dan lama< ma%i$ ada unspecific bounding 'rotein di %ekitar 'ita 'rotein.
Kon%entra%i anti#odi 'rimer (ang kurang tinggi.
2.
Kekurangan Exposure (ang kurang lama< %e$ingga gam#ar kurang taam
*ilu%i anti#odi 'ertama dan kedua (ang kurang tinggi.
3.
Kekurangan
Mencuci kurang lama dan /rekuen%in(a kurang
Blocking #u//er (ang tidak o'timal 8#i%a %u%u atau (ang lain9
Anti#odi ini %e$aru%n(a $an(a ada 1 teta'i muncul ada 2 'ita 8anti#odi kurang %'e%i/ik9
.
onto$ $a%il :e%tern #lt mem#ran (ang #aik.
INDEC
A
N
0lkaline #hosphotase 8AP9< 3=
"itrocellulose 2"!), ', '@ ort$en #lot< 1
B Bca< 7 Bicinchoninic acid assay, 7 Blot< 1
P
!harge1coupled Decice 8*9< 32
#oly$inylidene difluoride 8P+*9< 1< 1@ #recast gel, 11 #rimary antibody, 3= Protein marker< 16 #rotealysis,
D
R
Dio%oben%yloxymethyl 8*BM9< 1
+eporter en%yme, 32
Dia%ophenylthioeter 2D#), ' Dry #lot< 21
S
E
Secondary antibody, 3=
Ea%tern Blot< 1
Semi dry blot, 2=
F
Separating gel, 13
/olin ciocalteu< 6
Smith assay, <
;
Snap free%e, :, @
Home made gel, 11
Southern blot, 1
Horseradish #eroxidase 85RP9< 3=
Stacking gel, 13
I
4
Image-)< 3
,i Brad/ord<
L !o:r(< 6
&
(ysis buffer, 9
=estern blot, 2
(ysis solution, :
=et blot, 2=
